TGXAS-家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术规程编制说明

团体标准《家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术规程》（征求意见稿）编制说明项目来源根据《广西标准化协会关于下达2023年第十批团体标准制修定项目计划的通知》（桂标协〔2023〕50号）精神，由广西壮族自治区蚕业技术推广站提出，广西壮族自治区蚕业技术推广站、河池市蚕业技术推广站，广西农业工程职业技术学院共同起草的团体标准《家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术规程》获批立项（项目编号：2023-1005）。项目背景及目的意义我国是世界蚕业起源中心，广西是全国蚕桑第一大省。国家实施“东桑西移”产业转换以来，广西蚕业迅猛发展，取得了令人瞩目的成就，为广西农业增效、农民增收、县域经济发展和社会主义新农村建设做出了重要贡献，已成为广西的新兴优势特色产业，更是部分地区的主要支柱产业，在脱贫攻坚和乡村振兴起了重要的作用。2022年，广西桑园面积284.18万亩，蚕茧产量43.71万吨，约占全国总产量的59.16%，连续18年位居全国第一；养蚕售茧收入206.79亿元，连续两年超200亿元；一二三产业融合发展，全产业总产值近600亿元。但是养蚕业一直面临严重的病害威胁，每年因蚕病暴发造成的减产约占蚕业生产总产量的20%左右，其中家蚕血液型脓病是养蚕病害病害之首，由家蚕核型多角体病毒（BmNPV）感染家蚕引起的，是一种亚急性家蚕病毒病，该病发病快，传染性强，难控制，给蚕业生产造成巨大经济损失。广西蚕区位于南亚热带，气候闷热多湿，是此病的高发地区，给广西蚕业生产造成很大的危害。过去，家蚕血液型脓病的防控依赖于严格的养蚕全过程消毒和饲养技术，近年，国内对抗血液型脓病品种的创新选育与应用，从品种角度有效抵抗血液型脓病的发生，是抵御家蚕血液型脓病最经济有效的方法，是蚕桑产业的重大突破。受抗血液型脓病遗传特性影响，在无抗性跟踪监测并加以选择，随着繁育世代上的增加，抗病将难以得到有效维持，因此抗性跟踪测试在抗病品种选育创新和产业化应用的重要意义。长期以为，广西蚕种质资源保种场在抗血液型脓病蚕品种收集、创新、保存上做了大量的工作，近十年，育成了抗血液型脓病蚕品种“桂蚕N2”“桂蚕8号”“桂蚕9号”“桂蚕10号”“桂蚕11号”等多对抗血液型脓病家蚕新品种并推广应用。本标准的建立具有重要的现实意义。鉴于有关家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试目前尚没有相关的国家标准、行业标准和地方标准，通过本标准的制定规范抗性跟踪测试操作，加快抗血液型脓病育种进程，降低消毒防病药品和劳动力投入，促进养蚕适度规模化进程，助力蚕业绿色生产、农业节本增效，为广西乃至我国蚕桑产业健康发展做出贡献。项目编制过程（一）成立标准编制工作组团体标准《家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术规程》项目任务下达后，广西壮族自治区蚕业技术推广站成立了标准编制工作组，起草单位制定了起草编写方案与进度安排，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准研制工作。编制工作组下设三个组，分别是资料收集组、草案编写组、标准实施组。资料收集组负责国内外有关家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术的文献资料的查询、收集和整理工作，查阅家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试的研究情况和目前对家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试的研究进展。草案编写组负责起草标准草案、征求意见稿和标准编制说明、送审稿及编制说明的编写工作，包括后期召开征求意见会、网上征求意见，以及标准的修改和完善。标准实施组负责《家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术规程》团体标准发布后，督促各相关从业人员广泛认知，在工作中严格贯彻标准，并对标准实施情况进行总结分析，对标准提出修正意见。（二）收集整理文献资料标准编制工作组收集了国内有关家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术相关文献资料。主要有：NY∕T3152.3-2017微生物农药环境风险评价试验准则第3部分：家蚕毒性试验DB11/T1432—2017生物防治产品应用技术规程舞毒蛾核型多角体病毒（北京市地方标准）DB44/T2240-2020油桐尺蠖核型多角体病毒杀虫剂使用技术规程DB42/T675-2010茶尺蠖核型多角体病毒制剂生产及应用技术规程DB33/T2183-2019家蚕核型多角体病抗性鉴定方法，浙江地方标准DB51/T1207-2011桑蚕血液型脓病诊断技术规程，四川地方标准（三）研讨确定标准主体内容标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究之后，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研究，标准的主体内容确定为家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试的术语定义、设施设备，测试蚕品种饲养，取样，攻毒，攻毒后管理、发病调查、发病率计算等操作指示。（四）调研及形成草案、征求意见稿工作小组对家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试的实验研究成果进行系统总结。形成了标准的基本构架，对主要内容进行了讨论并对项目的工作进行了部署和安排。2023年3-4月，在前期工作的基础之上，整合已有的数据资料中有关家蚕抗血液型脓病性能跟踪技术要求，并结合广西多年家蚕抗血液型脓病选育工作实际要求的基础上，按照简化、统一等原则编制完成团体标准《家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术规程》（草案）。2023年5月，标准起草工作组通过实地调研，掌握相关人员关于家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术的具体技术要求。将草案分发至相关单位内部征求意见，针对收集到的意见，标准编制工作组多次召开会议，以草案为基础，提炼核心技术细节，对标准草案进行了反复修改和研究讨论，进一步讨论完善标准草案，形成团体标准《家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术规程》（征求意见稿）和（征求意见稿）编制说明。标准制定原则（一）实用性原则目前尚无家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试方面的标准，因此本标准的撰写主要基于起草单位多年的实际工作经验的总结及大量查询文献的基础上形成，充分考虑了我区家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试的操作实际情况。具有较强的实用性和可操作性。（二）协调性原则本文件编写过程中注意了与家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试相关法律法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。（三）规范性原则本文件严格按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求和规定编写本标准的内容，保证标准的编写质量。标准主要条款的说明本标准确立了家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试的程序，界定了家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术规程涉及的术语和定义，规定了设施设备，以及测试品种的饲育、取样、病毒悬浮液的制备、攻毒操作方法、发病调查、发病率计算及数据记录等操作指示。（一）术语和定义明确了“家蚕核型多角体病毒多角体”“攻毒”的术语和定义，依据DB33/T2183-2019《家蚕核型多角体病抗性鉴定方法》结合跟踪测试试验操作实际确定。（二）设施设备跟踪测试蚕房为专用，独立于生产养蚕区域；测试房间配置养蚕设备、控温控湿设备及消毒机具。与病毒制备房间相邻，配备光学显微镜、低速离心机、纯水机、冰箱、血球计数器、移液枪；主要依据起草单位多年实际操作需要确定。（三）跟踪测试技术流程技术流程主要依据起草单位多年的跟踪测试实际流程确定，流程图见图1：取样取样发病调查记录结果攻毒攻毒管理消毒清洗选留蚕区上蔟采茧调查制种蚕种保护催青收蚁图1家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试技术流程图（四）技术要求家蚕饲养饲育方法及技术要求家蚕品种继代时，选育人员根据选育计划确定需要跟踪测试的品种及区数，同时确定对照品种。常规饲养至2龄起蚕，按照DB45/T83的规定执行，包括蚕室温湿度环境、桑叶质量、饲养管理和眠起处理。核型多角体病毒桑叶准备将病毒配制成目的浓度悬液。将新鲜桑叶浸入病毒悬液中，充分浸渍均匀，取出，待桑叶表面水分晾干后备用。2龄起蚕添食病毒，常用浸叶法和涂抹法。实验室常用涂抹法，固定剂量的病毒悬液涂抹在固定面积的桑叶上，晾干再喂食。此方法比起浸叶法精度较高，但是极耗工耗时。但是我们做跟踪测试的规模一般都比较大，不可行，所以采用浸叶法。据《应用抗病育种技术育成广西首对抗血液型脓病桑蚕新品种“桂蚕N2”》报道，采用定量涂抹法，浓度为1×107PIBs/ml病毒添食两广二号2龄起蚕，正交76.52%，反交69.22%，平均发病率为72.87%。我们采用浸叶法添食在浓度1×107添食两广二号，正交发病率为 73.94% ，反交发病率 71.14%，平均发病率为72.53%，与采用涂抹法添食的发病率基本一致（表一），可见浸叶法也能达到测试筛选效果。表一两广二号2龄起蚕浸叶法测试发病率添食浓度正交反交脓病头数其他死蚕存活头数脓病发生率（%）脓病头数其他死蚕存活头数脓病发生率（%）1×1064509532.1434211422.971×10710583773.9410614371.141×1081452497.3213501689.401×10915000100.0015000100取样及要求受试蚕品种及对照品种均在2龄起蚕饷食前取样。每区取样30头，3个重复。取样的蚕放至样品饲喂盒，并随样本传递一份含有样本信息（包括蚕品种名或代号、区号、抽样数量等信息）的小区片。家蚕对BmNPV的抗性随蚕龄的增加而增强，蚕龄越小越容易染病；而在同一龄期一般起蚕最低。而1龄蚕太小，调查发病率时较费力。所以选在2龄起蚕添食病毒进行测试。攻毒将备好的病毒叶切成3cm×3cm大小给蚕喂食，每区喂3片。攻毒后饲养饲养温度27℃-28℃，湿度85%-90%。第2餐开始换为无病毒普通桑叶饲喂。饲喂前去除病毒叶残叶、蚕沙，更换蚕座及垫纸，蚕体、蚕座撒新鲜石灰粉进行消毒。温湿度是依据DB45/T83种茧育养蚕技术规程给出。发病调查添食后64h-92h开始至3龄起蚕为调查时间。家蚕血液型脓病属于亚急性传染病，感染后一般小蚕3-4天即开始发病（引至《蚕病学》）。品种间发病有快慢，发育快的在添食后64h开始出现病症，慢的品种则能到92h才显现病症。病症及确定方法以家蚕血液型脓病的典型症状结合光学显微镜镜检为依据逐区调查发病蚕、健康蚕。有血液型脓病典型病症的蚕，计为发病蚕；没有典型病症的3龄起蚕记为健康蚕。对不能确定的蚕，取血液用光学显微镜检查，观察到有家蚕核型多角体，则计入发病蚕。家蚕血液型脓病发病时，多为不眠蚕，体壁紧张发亮，有狂躁爬行、环节和节间膜肿胀、血液浑浊等典型病状，最后体壁破裂而死。如图：发病率计算公式 a=b/(b＋c)×100％ 式中：a——发病率,单位为百分比（％）；b——发病蚕头数，单位为头（头）；c——健康蚕头数,单位为头（头）；结果记录如实准确及时记录测试结果并传递测试结果，根据测试结果，选留发病率低的蚕区继续饲育，淘汰发病率高的蚕区。选留蚕区的后续饲养、上蔟制种按DB45/T83执行；蚕种的保护、浸酸、冷藏和浸酸按DB45/T84《桑蚕种保护、冷藏、浸酸技术规程》执行。清洗消毒用具、蚕室进行消毒清洗按DB45/T83《种茧育养蚕技术规程规定执行》。六、国内同类标准制修订情况及与法律法规、强制性标准关系经查阅，国内没有与家蚕抗血液型脓病性能跟踪测试直接相关的标准，其他相关如下：NY/T3421-2019《家蚕核型多角体病毒检测荧光定量PCR法》主要规定了家蚕核型多角体病毒的实时荧光定量PCR检测方法。NY/T3152.3-2017《微生物农药环境风险评价试验准则第3部分：家蚕毒性试验》规定了微生物农药对家蚕毒性试验的操作、条件等要求。DB33/T2183-2019《家蚕核型多角体病抗性鉴定方法》主要规定了家蚕一代杂交种对核型多角体病抗性水平的评价。DB51/T1207-2011《桑蚕血液型脓病诊