T-CVMA 165-2024 禽白血病病毒磁微粒化学发光检测方法

T/CVMA165—2024禽白血病病毒磁微粒化学发光检测方法Magneticparticlechemiluminescencemethodfordetectionofavian2024-5-23发布2024-5-23实施中国兽医协会发布I12规范性引用文件NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范T/CVMA32禽白血病病毒抗原化学发光免疫分激发液excitationflu4符号和缩略语2MES溶液：4-吗啉乙磺酸溶液（4-MorpholineethanesulfonicaMEST溶液：4-吗啉乙磺酸吐温溶液（4-MorpholineEthylsulfonicAcidTweenPBST：磷酸盐吐温溶液（PhosphaNHS溶液：N-羟基丁二酰亚胺溶液（N-hydroxysuccinimidesolution）育洗涤后，加入激发液A和激发液B；在碱性条件下，吖啶酯分子的发射光强度达到最大，通过测量的7.32℃~8℃冰箱，-20℃冰箱。3取全蛋，破碎后取蛋清，置-18℃以下冻融一次，用塑料吸头吸取蛋清直接进行8.1.2泄殖腔拭子取泄殖腔拭子时，将拭子伸入泄殖腔转3圈并沾取少量粪便；用棉签于待检鸡只泄殖腔取样后，放入lmL样品稀释液中，置-18℃以下冻融1次，恢复室温（15℃~25℃)后，剧烈振荡1min，挤出棉签中的液体，弃棉签。将液体于2℃~8℃下，以12,000r/min离心1min，取上清直接进行检测。用棉签取待检鸡只胎粪，放入1mL稀释液中，置-18℃以下冻融1次，恢复室温（15℃~25℃)后，剧烈震荡1min，挤出棉签中的液体，弃棉签。液体在2℃~8℃下，以12,000r/min离心1min，取上清直样品若在一周内检测，可置2℃~8℃条件下保存。若超过一周检测，应置于-80℃以下冷冻保存。运输时注意冷藏。采集的样品可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，在24h内完样品与阴性对照发光值之比﹤0.2，样品判定为禽白血病病毒抗45A.1磁珠偶联物的制备A.1.1抗体处理取500μL抗禽白血病病毒P27蛋白单抗（浓度1mg/mL装入透析袋中溶液（PBS）中，室温（15℃~25℃)透析4h。A.1.2洗涤羧基球取200μL羧基磁珠（浓度50mg/mL）到离心管中，固定到磁力架上进行磁分离），），A.1.3羧基球活化），再加入125μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），室温（15℃~25℃)反应30min。反应结束后，磁分离，移除上清，用MES磁分离洗涤2次。A.1.4偶联抗体补加MEST至总体积1mL，摇匀后固定在混匀器上室温反应4h以上。反应结束后，磁分离，移除上清，加入1mL的封闭液，振荡分散均匀后，固定在混匀器上反应4h。A.1.6保存重悬偶联后的磁珠，2℃~8℃保存备用。A.2磁珠溶液的制备将得到禽白血病病毒抗体磁珠偶联物用PBST按照1:100稀释，加入0.02%Proclin-300混匀后，无菌分装，2℃~8℃保存。6取500μL抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体（浓度2mg/mL），装入透析袋中，置于透析液PBS中，室温（15℃~25℃)透析4h。取出透析后的抗体溶液，加入洁净玻璃瓶中，再将吖啶酯溶液（浓度5.0mmoL溶液中，避光，室温反应2h。反应后入10%（m/V）赖氨酸封闭，室温反应1h。将标记抗体溶液，装入透析袋内，置于pH值7.4的0.05moL/LPBS透析液中，室温（15℃~25℃)B.1.5保存将得到的禽白血病病毒标记单克隆抗体用PBS缓冲液（0.01加入0.02%Proclin-300混匀后经0.22μm滤器过滤，无菌分装，于2℃~8℃保存。7氯化钾0.2g，加入800mL纯化水搅拌溶解，再加纯化水定容至1,000mL，经0.22μm过滤，置2℃~8℃37±2℃温箱倒置培养12h～16h。挑取单菌落转接于200mL含50μg/mL氨苄霉素37±2℃、在200r/min摇床振荡培养12h左右至OD600nm达到0.6h～0.8h，加入终浓度为0.5mmoL/L的pH值7.2）重悬沉淀，通过超声波破碎仪破碎菌体后，在2℃~8℃下，以12,000r/min离心10min，取上清。采用镍离子梯度亲和层析法进行纯化获得纯化的禽白血病病毒p27蛋白。8称取十二水合磷酸氢二钠72.5g、磷酸二氢钾5g、氯化钠200g、氯化钾5g，加入700mL双蒸水加热搅拌溶解，再加入12.5mL的吐温-20，而后加双蒸水定容至1,000用蒸馏水或去离子水25倍稀释。1份25倍浓缩洗涤液加24份蒸馏水。例如：40mL2称取2.9g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、8g氯化钠、量取200mL纯化水，加入37%浓盐酸溶液8.33mL，加入3化水定容至1,000mL。定量分装，2℃~8℃保存。2.5mL，搅拌均匀加纯化水定容至1,000mL。定量分装，2℃~8℃保存。纯化水搅拌溶解，再加纯化水定容至1,000mL，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。过滤，置2℃~8℃保存。称取10mg的NHS，溶于1mLMES溶液中，临用配制10min内使用。称取10mg的EDC溶于1mLMES溶液中，临用配制10min内使用。），搅拌均匀，PBS定容至1,000mL，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。9PBS定容至1,000mL。扫描配套的试剂盒、对照品、激发液A和激发液B的二维码，将批