《蜜蜂白垩病诊断技术GBT 35908-2018》详细解读

《蜜蜂白垩病诊断技术GB/T35908-2018》详细解读contents目录1范围2规范性引用文件3缩略语4试剂和材料4.1水4.2固定液、染色液和培养基contents目录4.3PCR检测方法试剂4.4引物序列及对照样品5仪器设备6临床诊断6.1流行病学6.2箱外观察contents目录6.3开箱检查6.4结果判定7实验室诊断7.1采样7.2镜检法7.3分离培养contents目录7.4PCR检测8综合判定附录A(规范性附录)固定液、染色液和培养基配方附录B(规范性附录)PCR检测方法试剂的配方附录C(资料性附录)蜜蜂白垩病发病蜂群的巢门前死虫和病虫症状contents目录附录D(资料性附录)蜜蜂白垩病发病蜂群的病脾状态附录E(资料性附录)蜂球囊菌的光镜下显微图像附录F(资料性附录)蜂球囊菌PCR产物电泳图附录G(资料性附录)蜂球囊菌PCR产物参考序列011范围该技术标准适用于养蜂场内蜜蜂白垩病的诊断。养蜂场为蜜蜂疾病研究机构提供统一的诊断方法。蜜蜂研究机构帮助检疫部门准确快速地识别蜜蜂白垩病，以便采取措施防止疾病扩散。检疫部门适用对象010203诊断标准明确了蜜蜂白垩病的诊断标准，包括症状识别、实验室检测等方面。诊断流程详细阐述了蜜蜂白垩病的诊断流程，从疑似病例的发现到确诊的整个过程。防控建议提供了针对蜜蜂白垩病的防控建议，以降低疾病的发生和传播风险。涵盖内容022规范性引用文件GB/T19147该标准主要提供了蜜蜂病害诊断的通用准则和方法，对于理解和实施本诊断技术具有重要的指导意义。GB4789.2该标准规定了食品微生物学检验的基本方法，对于本诊断技术中涉及的微生物学检测提供了技术支持。国家标准NY/T5138此标准详细描述了蜜蜂病害的监测和报告方法，对于本诊断技术的实施提供了具体的操作指南。行业标准该法律规定了动物疫病的预防、控制和扑灭措施，以及相关的监督管理工作，为蜜蜂白垩病的防治提供了法律依据。《中华人民共和国动物防疫法》该文件详细规定了蜜蜂的检疫程序和要求，对于防止蜜蜂病害的传播具有重要的指导意义。《蜜蜂检疫规程》其他相关文件033缩略语APV急性麻痹病毒，一种能够影响蜜蜂健康的病毒。DWV畸形翅病毒，是蜜蜂中常见的一种病毒，可导致蜜蜂翅膀畸形。IAPV以色列急性麻痹病毒，与蜜蜂群体崩溃综合症（CCD）有关联。KBV卡什米尔蜜蜂病毒，一种危害蜜蜂健康的病毒。常见缩略语解释世界动物卫生组织，负责制定和执行动物卫生标准。OIE欧洲和地中海植物保护组织，致力于保护植物健康。EPPO联合国粮食及农业组织，致力于提高农业生产力和改善农村人口生活。FAO专业机构缩略语聚合酶链反应，一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。PCR逆转录聚合酶链反应，用于检测RNA病毒。RT-PCR酶联免疫吸附试验，一种常用的免疫学检测方法。ELISA技术和方法缩略语044试剂和材料免疫学试剂包括特异性抗体、酶标二抗、显色剂等，用于蜜蜂白垩病病原的免疫学检测。常规化学试剂包括乙醇、异丙醇、氯仿等有机试剂，以及Tris、EDTA、NaCl等无机试剂，用于实验过程中的常规操作。分子生物学试剂包括DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、DNAMarker等，用于蜜蜂白垩病病原的分子生物学检测。4.1主要试剂20144.2材料与耗材04010203蜜蜂样本采集自疑似感染白垩病的蜜蜂，用于病原检测。离心管、吸头用于样本处理、试剂配制等操作。PCR管、八连管用于PCR扩增反应。酶标板用于免疫学检测中的酶联免疫吸附试验。用于酶联免疫吸附试验的结果读取和分析。酶标仪用于样本处理过程中的离心操作。离心机01020304用于进行PCR扩增反应，检测蜜蜂白垩病病原的核酸。PCR仪用于精确量取试剂和样本。微量移液器4.3仪器设备054.1水纯净水应使用去离子水或蒸馏水等纯净水作为检测用水，以避免水中的杂质干扰检测结果。水质检测需定期对使用的水源进行质量检测，确保其符合实验用水标准。水源选择试剂配制水是配制各种化学试剂和缓冲液的主要溶剂，其纯度和质量对试剂的稳定性和准确性至关重要。清洗和消毒在实验过程中，需要用纯净水清洗实验器具和消毒操作台，以确保实验的准确性和无菌条件。水在检测中的应用杂质干扰水中的杂质可能与试剂发生反应，导致实验结果偏差或失败。微生物污染水质对实验结果的影响未经处理的水可能含有微生物，对实验结果造成污染和干扰。0102水的处理和储存水储存储存容器应选用密封性好、清洁无菌的容器，并定期清洗和消毒，以避免二次污染。同时，储存环境应保持干燥、阴凉，避免阳光直射和高温环境导致水质变化。水处理可通过蒸馏、去离子等方法处理水，以提高其纯度并去除杂质。064.2固定液、染色液和培养基使用注意事项使用固定液时应严格控制浓度和处理时间，避免过度固定导致细胞结构破坏。种类与选择常用的固定液包括酒精、甲醛、冰醋酸等，选择时应考虑样本类型及后续染色或观察需求。作用机制固定液能够迅速穿透细胞，将其结构和成分迅速固定，防止细胞自溶和腐败，保持细胞的本来面貌。固定液常见的染色液有革兰氏染色液、瑞氏染色液等，不同染色液对细胞的着色效果和特异性有所不同。种类与特性染色液通过与细胞内的特定成分结合，使细胞结构在显微镜下更易观察和区分。染色原理染色时应遵循一定的操作步骤和时间控制，以获得最佳的染色效果。操作技巧染色液种类与用途培养基的制备应严格按照配方进行，确保各种成分的准确性和比例。制备完成后需进行灭菌处理，以消除杂菌污染。制备与灭菌保存与使用培养基应存放在干燥、阴凉处，避免阳光直射和高温。使用时应注意无菌操作，避免污染。培养基的种类繁多，包括营养肉汤、琼脂培养基等，用于不同微生物的分离、培养和鉴定。培养基074.3PCR检测方法试剂TaqDNA聚合酶选择高质量、高保真度的TaqDNA聚合酶，以确保PCR反应的准确性和效率。dNTPs准备适量的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），作为PCR反应中的底物。引物根据蜜蜂白垩病病毒的基因序列，设计并合成特异性引物，用于扩增目标片段。4.3.1试剂准备“按照一定比例混合TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物、模板DNA和PCR缓冲液，配制成完整的PCR反应体系。PCR反应体系分别准备阳性对照（已知含有蜜蜂白垩病病毒DNA的样品）和阴性对照（不含蜜蜂白垩病病毒DNA的样品），用于验证PCR反应的特异性和准确性。阳性对照和阴性对照4.3.2试剂配制VS将TaqDNA聚合酶、dNTPs和引物等试剂按照说明书要求妥善保存，避免受潮、高温和光照等因素影响。试剂使用在使用前，检查试剂的保质期和状态，确保试剂的有效性。同时，遵循实验室安全规范，正确使用和处理试剂。试剂保存4.3.3试剂保存与使用避免污染在PCR实验过程中，要严格遵守无菌操作规范，避免试剂和样品的交叉污染。准确加样在配制PCR反应体系时，要确保各组分加样准确，以免影响实验结果。验证结果在PCR实验完成后，要对实验结果进行验证和分析，以确保实验结果的准确性和可靠性。0302014.3.4注意事项084.4引物序列及对照样品4.4.1引物序列010203上游引物针对特定病毒基因设计的特异性引物，用于PCR扩增。下游引物与上游引物配对，共同完成PCR扩增过程。引物设计原则遵循特异性、高效性、稳定性等设计原则，确保准确扩增目标基因片段。01阳性对照已知含有目标病毒的样品，用于验证PCR检测体系的灵敏度和特异性。4.4.2对照样品02阴性对照不含目标病毒的样品，用于排除实验过程中的污染和假阳性结果。03内参对照含有与目的基因无关的DNA片段的样品，用于监控PCR过程中DNA的提取和扩增效率。095仪器设备类型复式显微镜或实体显微镜，用于观察蜜蜂组织及病原形态。放大倍数应提供足够的放大倍数，以便清晰观察细节。配备应配备相应的目镜、物镜及光源，确保观察效果。5.1显微镜应提供可调节的转速范围，以适应不同的分离需求。转速范围应具备相应的安全防护措施，确保操作安全。安全性适用于实验室规模的离心机，用于分离样品中的不同成分。类型5.2离心机包括水浴锅、恒温箱等，用于控制实验过程中的温度条件。类型温度范围精确度应能提供稳定的温度环境，以满足实验需求。温度控制应具备一定的精确度，以确保实验结果的可靠性。5.3恒温设备类型包括天平、量筒、移液器等，用于实验过程中的精确计量。校准应定期对计量器具进行校准，确保其处于良好工作状态。精确度计量器具应具备相应的精确度，以确保实验数据的准确性。5.4计量器具106临床诊断蜜蜂活动减弱感染白垩病的蜜蜂往往活动力减弱，飞行能力下降，甚至无法飞行。腹部膨胀病蜂腹部常出现不正常的膨胀，这是由于病原真菌在蜜蜂体内大量繁殖所导致的。体表变白随着病情的发展，蜜蜂的体表会逐渐变白，这是由于病原真菌产生的白色菌丝覆盖在蜜蜂体表所造成的。6.1临床症状观察通过显微镜观察病蜂的组织切片，可以看到病原真菌在蜜蜂体内繁殖，导致组织结构的破坏和细胞损伤。组织病理学变化通过病理学检查，可以鉴定出引起蜜蜂白垩病的病原真菌种类，为后续的防治工作提供依据。病原真菌的鉴定6.2病理学检查PCR检测利用聚合酶链式反应（PCR）技术，可以特异性地检测出蜜蜂白垩病病原真菌的DNA片段，从而确诊病情。016.3分子生物学诊断基因测序通过对病原真菌进行基因测序，可以了解其遗传信息和变异情况，为防治工作提供更深入的认识。02抗体检测通过检测蜜蜂体内针对病原真菌的特异性抗体水平，可以间接反映蜜蜂是否感染了白垩病。这种方法适用于大规模筛查和病情监测。6.4血清学诊断116.1流行病学传染源与传播途径传播途径主要通过蜜蜂个体间的直接接触传播，也可通过被污染的饲料、水源、工具等间接传播。传染源患病蜜蜂及被污染的蜂巢、蜂具等。易感群体与流行季节一年四季均可发生，但以春秋季节为高发期。流行季节各年龄段和品种的蜜蜂均可感染，但幼虫和青年蜜蜂更易感。易感群体影响因素气候、环境、饲养管理等因素均可影响白垩病的流行。如湿度大、温度低的环境易诱发该病。防控措施加强饲养管理，保持蜂场清洁卫生，定期消毒；选用抗病力强的蜜蜂品种；及时发现并隔离病群，防止疫情扩散。影响因素与防控措施126.2箱外观察蜜蜂飞行情况观察蜜蜂飞行的活跃度、飞行路线和飞行姿态，判断是否存在异常。观察内容巢门口情况注意巢门口是否有死蜂、残翅等异常现象，以及蜜蜂进出的频繁程度。箱体外部状况检查蜂箱外部是否有破损、污渍等问题，这些可能会影响蜜蜂的生存环境。观察方法定时观察在固定时间进行箱外观察，如早晨、傍晚等，以便更好地了解蜜蜂的活动规律。细致观察对蜜蜂的飞行、巢门口和箱体外部状况进行仔细观察，不放过任何异常现象。记录分析将观察到的现象进行记录，并结合其他诊断方法进行综合分析，以确定蜜蜂的健康状况。及时发现病情通过箱外观察，可以及时发现蜜蜂的异常表现，为早期诊断和治疗提供依据。预防疾病扩散对异常现象进行及时处理，可以防止疾病的扩散和蔓延，保护整个蜂群的健康。提高养殖效益健康的蜜蜂群体对于提高蜂蜜产量和质量具有重要意义，因此箱外观察是蜜蜂养殖中不可或缺的一环。诊断意义136.3开箱检查防护装备穿戴好养蜂帽、手套等防护用具，确保自身安全。检查工具准备好开箱刀、起刮刀、喷烟器等工具，便于顺利开箱和观察蜂群。检查准备选择天气在晴朗且温暖的天气进行开箱检查，避免恶劣天气对蜜蜂造成不良影响。喷烟镇静用喷烟器向蜂群喷少量烟，使蜜蜂保持安静，便于检查。轻启蜂箱使用开箱刀轻轻撬动蜂箱盖，缓慢打开，避免惊扰蜜蜂。开箱步骤观察蜂群状态注意蜜蜂的飞行和活动情况，是否有异常表现。检查巢脾病情记录病情观察仔细查看巢脾上是否有白垩病的症状，如白色菌丝、幼虫体表覆盖白色物质等。详细记录病情症状、病蜂数量等信息，为后续治疗提供依据。检查完毕后，及时封闭蜂箱，确保蜜蜂安全。后续处理封闭蜂箱清理检查过程中产生的杂物和死蜂，保持养蜂场清洁。清理现场根据病情记录，及时采取治疗措施，控制病情发展。采取治疗措施146.4结果判定采集方法详细规定了样品的采集方法，包括随机采样、多点采样等，确保样品的代表性和准确性。样品处理对采集的样品进行适当处理，如清洗、干燥、粉碎等，以便于后续的检测操作。6.4.1样品采集与处理6.4.2病原学检测显微镜检测采用显微镜观察样品中是否存在白垩病病原孢子，以及其数量和形态特征。分子生物学检测应用PCR等分子生物学技术，检测样品中白垩病病原的基因片段，提高检测的灵敏度和特异性。6.4.3血清学检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，检测样品中是否存在针对白垩病病原的特异性抗体。抗体检测选用特异性抗原，制备用于血清学检测的试剂。抗原制备6.4.4结果判定标准病原学检测结果判定根据显微镜检测和分子生物学检测的结果，综合判断样品是否感染白垩病病原。血清学检测结果判定依据抗体检测的结果，确定样品中是否存在白垩病的特异性抗体，从而间接判断样品的感染状况。综合判定结合病原学检测和血清学检测的结果，以及临床症状等信息，对白垩病进行最终的诊断和判定。157实验室诊断030201显微镜检方法采用光学显微镜对病蜂组织进行镜检，观察是否有白垩病特征性的孢子或菌丝。样本处理取病蜂的翅、足或体壁等部位，进行常规处理后在显微镜下观察。诊断依据若发现大量孢子或菌丝，结合临床症状，可初步诊断为白垩病。7.1显微镜检选择适合蜜蜂白垩病菌生长的培养基，如马铃薯葡萄糖琼脂培养基等。培养基选择取病蜂组织接种于培养基上，在适宜条件下进行培养。病原菌接种观察菌落形态、颜色等特征，结合显微镜检结果进行确认。结果观察7.2病原菌分离培养PCR检测采用特异性引物对病原菌进行PCR扩增，检测病原菌的DNA片段。测序分析对PCR产物进行测序，比对分析确定病原菌种类。优点与局限性分子生物学诊断具有高度的特异性和敏感性，但操作较为复杂且需要专业设备。7.3分子生物学诊断抗原制备提取病原菌的特异性抗原。7.4血清学诊断抗体检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法检测病蜂体内的特异性抗体。诊断意义血清学诊断可用于白垩病的早期诊断和流行病学调查，但可能存在假阳性或假阴性结果，需要结合其他诊断方法进行确认。167.1采样采样工具需准备无菌的镊子、剪刀、手套等，以避免交叉污染。采样容器应选用无菌的离心管或密封袋，确保样本在运输和保存过程中不被污染。采样工具与材料采样方法与步骤采集病蜂用无菌镊子轻轻夹取具有白垩病症状的蜜蜂，放入采样容器中。标注信息在采样容器上标注病群信息、采样日期和采样人等信息，以便后续追踪和分析。选择病群在疑似感染白垩病的蜜蜂群中选择具有代表性的病群进行采样。030201无菌操作整个采样过程需严格遵守无菌操作规范，避免人为引入污染。样本数量根据病群规模和病情严重程度，采集足够数量的样本，以确保检测结果的准确性。保存与运输采样完成后，应尽快将样本送至实验室进行检测。在运输过程中，需保持样本的低温保存，以避免病菌繁殖影响检测结果。采样注意事项010203177.2镜检法显微镜观察利用显微镜观察病蜂组织中的孢子，从而确定是否感染白垩病。形态学特征原理通过观察孢子的大小、形状、颜色等形态学特征，进行初步诊断。0102操作步骤采集样本从疑似感染白垩病的蜜蜂群体中，采集具有代表性的蜜蜂样本。制作玻片将采集的蜜蜂样本进行处理，制作成适合显微镜观察的玻片。显微观察在显微镜下观察玻片中的孢子，记录其形态学特征。结果判定根据观察到的孢子特征，结合诊断标准，判断样本是否感染白垩病。镜检法具有直观、快速、简便等优点，能够直接观察到病原体的存在。优点镜检法对操作人员的专业技能要求较高，且容易受到样本处理、观察条件等多种因素的影响，可能导致误诊或漏诊。缺点优缺点样本采集应确保采集的样本具有代表性，避免污染或损坏。注意事项01玻片制作制作玻片时应严格按照操作规程进行，以保证观察效果。02显微观察观察时应选择适当的放大倍数和光线条件，以获得清晰的图像。03结果判定应结合多个样本的观察结果进行综合判断，以提高诊断的准确性。04187.3分离培养根据蜜蜂白垩病菌的生长特性，选择能够提供必要营养和支持其生长的培养基，如常用的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）等。选择适宜的培养基按照所选培养基的配方，准确称量各成分，混合均匀后加热溶解，调节pH值至适宜范围，然后进行分装、灭菌等处理，制备成无菌的培养基。培养基的制备培养基的选择与制备VS采用无菌操作技术，从疑似感染白垩病的蜜蜂样本中取适量材料，轻轻涂布于培养基表面，或采用划线法接种于培养基上，然后进行适宜温度和湿度的培养。病原菌的纯化在病原菌长出菌落后，挑选单个菌落进行再次划线接种或挑取菌落的一部分进行液体培养，以获得纯化的病原菌。病原菌的分离病原菌的分离与纯化观察培养出的菌落的大小、形状、颜色、质地等特征，以及菌落边缘是否整齐、表面是否光滑等，这些特征有助于初步判断病原菌的种类。观察菌落形态详细记录分离培养的过程、条件及观察到的菌落形态特征等信息，为后续病原菌的鉴定和进一步研究提供依据。同时，对于疑似病原菌的菌落，应及时进行保存和备份。记录培养结果分离培养结果的观察与记录197.4PCR检测即聚合酶链式反应，通过特定引物扩增DNA片段。PCR技术根据蜜蜂白垩病病毒的基因序列设计，确保扩增的准确性。特异性引物能够检测到极低浓度的病毒DNA，提高诊断准确性。敏感性高7.4.1原理0102037.4.2操作步骤样品采集与处理采集疑似感染蜜蜂，提取病毒DNA。PCR反应体系配制按照一定比例混合引物、dNTPs、Taq酶等试剂。PCR扩增设定合适的反应条件，进行PCR扩增。结果检测与分析通过电泳或其他方法检测扩增产物，判断样品是否感染病毒。确保PCR实验室的洁净度，避免交叉污染。实验室环境7.4.3注意事项使用高质量的PCR试剂，确保扩增效率与特异性。试剂质量针对蜜蜂白垩病病毒的保守区域设计引物，提高检测的准确性。引物设计确保样品在保存与运输过程中不受污染与降解。样品保存与运输208综合判定临床症状与病理学检查相结合在诊断蜜蜂白垩病时，应结合蜜蜂的临床症状和病理学检查结果进行综合判定。实验室检测确认对于疑似病例，应通过实验室检测进行确认，包括病原学检测和血清学检测等。8.1判定原则具有典型的蜜蜂白垩病临床症状，且病理学检查或实验室检测结果为阳性的蜜蜂，可确诊为蜜蜂白垩病。确诊病例具有蜜蜂白垩病部分临床症状，但病理学检查或实验室检测结果不明确的蜜蜂，应视为疑似病例。疑似病例8.2判定标准实验室检测对疑似病例进行实验室检测，包括血清学检测和分子生物学检测等，以确认诊断结果。临床检查对疑似患病的蜜蜂进行临床检查，观察其症状是否符合蜜蜂白垩病的特征。病理学检查对疑似病例进行病理学检查，包括显微镜下的组织病变观察和病原学检测等。8.3判定流程8.4注意事项诊断过程中应严格遵守实验室生物安全规定，防止病原扩散和人员感染。对于确诊病例，应及时采取隔离和治疗措施，防止病情扩散和蔓延。同时，应对蜂场进行彻底消毒，消除病原。21附录A(规范性附录)固定液、染色液和培养基配方配方一福尔马林-酒精-冰醋酸固定液。取市售福尔马林(37%-40%甲醛溶液)、95%酒精、冰醋酸，按体积比9:0.5:0.5混合均匀，即可使用。配方二卡诺氏固定液。取纯酒精3份、冰醋酸1份，或95%酒精6份、冰醋酸1份混合均匀，即可使用。该固定液适用于一般植物组织和细胞的固定，常用于根尖、茎尖切片，能较好地保存细胞结构。固定液配方革兰氏染色液。包括结晶紫染色液、碘液、脱色液和复染液。结晶紫染色液由结晶紫、95%酒精和蒸馏水按一定比例混合而成；碘液由碘、碘化钾和蒸馏水配制；脱色液为95%酒精；复染液为番红水溶液或沙黄水溶液。瑞氏染色液。由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料，溶于甲醇，后解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。染色液配方马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，再加15克葡萄糖和15-20克琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管斜面培养基，每试管约装3-5毫升(视试管大小而定)，121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。查彼培养基(Czapek)。取硝酸钠30.0克、磷酸氢二钾1.0克、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5克、氯化钾0.5克、硫酸亚铁0.01克、蔗糖30.0克、琼脂15.0克，蒸馏水定容至1升，pH值自然。经121℃灭菌20分钟后备用。该培养基主要供霉菌、酵母菌等微生物生长。培养基配方22附录B(规范性附录)PCR检测方法试剂的配方TaqDNA聚合酶用于催化PCR反应中的DNA链延伸过程。dNTPs即脱氧核苷三磷酸，是PCR反应中DNA合成的原料。引物特异性结合模板DNA，为PCR反应提供起始点。MgCl₂影响Taq酶的活性和PCR反应的特异性，适量添加可提高PCR效率。试剂组成配方及浓度TaqDNA聚合酶推荐使用浓度为2.5U/μL，根据具体实验需求适量调整。dNTPs通常使用等摩尔浓度的dATP、dTTP、dCTP和dGTP混合液，总浓度为200μM。引物根据目标基因序列设计特异性引物，浓度一般为10~20pmol/μL。MgCl₂终浓度一般为1.5~2.5mM，具体浓度需根据实验条件进行优化。配制方法TaqDNA聚合酶按照厂商提供的说明书进行稀释和保存。dNTPs将四种dNTPs等摩尔混合，用无菌水或TE缓冲液溶解至所需浓度。引物将合成好的引物用无菌水或TE缓冲液溶解至所需浓度，并分装保存。MgCl₂用无菌水溶解MgCl₂至所需浓度，过滤除菌后保存。所有试剂均应在无菌条件下配制和保存，避免污染。试剂的浓度和配制方法可能因不同厂商和产品而有所差异，请参照具体产品的说明书进行操作。PCR反应中，MgCl₂的浓度对反应结果影响较大，建议进行预实验以确定最佳浓度。注意事项01020323附录C(资料性附录)蜜蜂白垩病发病蜂群的巢门前死虫和病虫症状死虫体色由正常的黄褐色变为苍白色，无光泽。体色变化死虫呈蜷缩状或扭曲状，与正常死亡的蜜蜂姿态明显不同。虫体姿态部分死虫体表附有白色菌丝，这是蜜蜂白垩病的典型症状之一。附着物巢门前死虫症状虫体颜色病虫体色逐渐变为白色，失去正常光泽。虫体形态随着病情发展，病虫身体逐渐肿胀，充满整个巢房，后期则逐渐皱缩、僵化。巢房变化病虫所在的巢房常被工蜂咬开，露出白色、质地疏松的病虫尸体，表面覆盖白色菌丝。病虫症状24附录D(资料性附录)蜜蜂白垩病发病蜂群的病脾状态发病蜂群的识别幼虫发育异常巢脾中出现大量异常幼虫，体表覆盖白色菌丝，虫体僵化。蜂群活动减弱染病蜂群的活动力明显下降，工蜂采蜜、清洁巢房等行为减少。脾面凹凸不平受感染的巢脾表面会出现凹凸不平的现象，这是由于病虫体积膨胀所造成的。白色菌丝覆盖病脾的外观特征病脾上可见明显的白色菌丝覆盖，这是蜜蜂白垩病的典型症状。0102病虫充斥巢房打开巢脾，可见大量充满白色菌丝的病虫充斥巢房。巢房内无封盖蜜由于病虫占据巢房，导致蜂群无法正常储存蜂蜜，因此巢房内无封盖蜜。病脾的内部状况VS由于幼虫大量染病，导致蜂群数量急剧减少，群势减弱。产蜜量下降病虫占据巢房，影响蜜蜂采蜜和储蜜，导致产蜜量大幅下降。群势减弱对蜂群的影响25附录E(资料性附录)蜂球囊菌的光镜下显微图像在光镜下，蜂球囊菌的菌丝呈现出分枝状，具有隔膜，且通常较宽。菌丝形态蜂球囊菌的孢子在显微镜下清晰可见，通常呈椭圆形或卵圆形，具有光滑的表面。孢子特征在显微图像中，可以观察到菌丝上生长出的孢子，这些孢子通过菌丝相连，形成独特的菌落形态。菌丝与孢子的关系显微图像的特点为了获得清晰的显微图像，需要对蜂球囊菌样本进行适当的处理，如固定、脱水、染色等步骤。样本制备使用光学显微镜对处理后的样本进行观察，选择合适的放大倍数以获得