基质辅助激光解吸电离飞行时间核酸质谱法体细胞突变检测通则

Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范围 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 15原理 26试剂与耗材 27仪器与设备 28操作步骤 29质量控制 310结果分析 311结果表述 312实验室要求 3附录A（资料性）PCR反应液配方表及反应程序 4附录B（资料性）SAP反应混合液配方表及反应程序 5附录C（资料性）单碱基延伸反应混合液配方表及反应程序 6参考文献 7前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中国研究型医院学会临床数据与样本资源库专业委员会提出。本文件由中国研究型医院学会归口。本文件起草单位：XXX。本文件主要起草人：XXX。基质辅助激光解吸电离飞行时间核酸质谱法体细胞突变检测通则范围本文件为实验室利用飞行时间核酸质谱平台进行肿瘤个体化用药基因或肿瘤良恶性辅助诊断基因的体细胞突变检测提供技术指导。本文件适用的样本类型包括新鲜肿瘤组织、肿瘤组织或者细胞石蜡包埋切片。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。T/ZZB2482-2021飞行时间核酸质谱仪术语和定义下列术语和定义适用于本文件。引物（Primer）结合于模板链上，引导聚合酶进行延伸的起始位点或终止位点的，具有一定长度和顺序的寡核苷酸。聚合酶链式反应（PolymeraseChainCeaction）聚合酶链反应或多聚酶链反应是一种在体外对模板DNA或RNA的特定片段进行快速扩增的方法，包含变性退火延伸三个基本反应步骤。单碱基延伸（SingleBaseExtension）适宜的反应体系中，在延伸引物引导下，聚合酶以ddNTP或者acyNTP为底物仅延伸单个碱基，常用于DNAsequencing和SNP检测。体细胞突变（SomaticMutation）体细胞突变是相对于胚系突变而言的，发生在体细胞中的突变，即在体细胞发生了基因突变或染色体畸变，突变性状一般不能传给下一代个体，却可以引起当代某些细胞的遗传结构发生改变的突变。此文的体细胞突变指单碱基突变。缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）SAP：虾碱性磷酸酶（shrimpalkalinephosphatase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）dUTP：脱氧尿苷三磷酸（2'-deoxyuridine5'-triphosphate）ddATP：2',3'–二脱氧腺苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-adenosine-5'-triphosphate）ddGTP：2',3'-二脱氧鸟苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-guanosine-5'-triphosphate）ddCTP：2',3'-二脱氧胞苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-cytidine-5'-triphosphate）ddTTP：2',3'-二脱氧胸苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-thymidine-5'-triphosphate）UDG：尿嘧啶DNA糖基酶（Uracil-DNAGlycosylase）原理提取纯化获得DNA模板，通过PCR扩增出含有突变位点的一段靶序列，经SAP消化去除扩增产物中多余的dNTP，加入序列特异性延伸引物（其3’端碱基紧挨突变位点）和突变位点特异性的末端终止碱基,这样，突变位点在延伸酶的作用下进行单碱基延伸，而野生型位点得不到延伸，富集突变含量，延伸产物经过脱盐纯化后，转移至带有基质的载体上，使用MALDI-TOF对延伸产物进行检测，通过质荷比信号分析确定模板中是否存在突变。基于本原理，可检测出10ngDNA样品中含量低至1%的突变。试剂与耗材除另有规定，所用试剂均为分析纯。也可根据自身实验需求，选择其他型号的同等功能的耗材和试剂。推荐试剂与耗材如下：10xPCR缓冲液；50mmol/L氯化镁溶液；25mmol/LdNTP/dUTPMix；5U/µLDNA聚合酶；5U/µLUDG；18MΩ*cm@25℃的纯化水；10xSAP缓冲液；1.7U/µLSAP酶；10x延伸缓冲液；ddATPMix；ddGTPMix；ddCTPMix；ddTTPMix；单碱基延伸引物；延伸酶；3Pt校准品；质谱芯片。仪器与设备包含但不限于以下设备：超净工作台；纯水仪；涡旋震荡仪；高速离心机；掌式离心机；全排生物安全柜；紫外可见分光光度计；PCR扩增仪；飞行时间核酸质谱仪。操作步骤样本的预处理新鲜组织样本，根据组织大小剪碎、用玻璃匀浆器将组织彻底研磨；蜡块样本，则需切成5片4μm厚度的连续切片，其中1片进行HE染色，确保含有肿瘤病变细胞比例不低于20%，用于核酸提取的则需3～5张连续性的切片。核酸提取及要求使用核酸提取试剂盒提取或同类方法；提取的核酸纯度通过A260/A280比率判定，DNA的A260/A280的比值建议在1.8～2.0之间。PCR反应PCR反应试剂配制、PCR反应程序详见附录A。SAP消化反应根据附录B配制SAP反应混合液，分装到微孔管中，每孔2μL。从PCR扩增仪上取出8.3的扩增产物，放入掌式离心机，5000rpm，离心30s。在核酸扩增区的生物安全柜里，将PCR扩增产物分装到已加了SAP混合液的微孔中，每孔分装5μL，使总体积达到7μL；完成分装后盖紧反应管，在涡旋仪上充分混匀30s，放入掌式离心机，5000rpm，离心30s。各反应管按一定顺序放入PCR仪上，按照附录B的SAP程序进行消化反应。单碱基延伸反应根据附录C配制单碱基延伸反应混合液；从PCR仪上取出8.4的SAP产物，放入掌式离心机，5000rpm，离心30s。取2μL的延伸混合液加入上述步骤的PCR/SAP产物中，完成分装后，盖紧反应管，在涡旋仪上充分混匀30s，放入掌式离心机，5000rpm，离心30s。将各反应管按一定顺序放入PCR仪上，按照附录C的延伸反应程序进行延伸反应。飞行时间核酸质谱仪器分析要求应符合T/ZZB2482-2021中的规定。质量控制在实验过程中，同时加上阳性对照、阴性对照的检测。结果分析利用质谱分析软件，分析阳性对照、阴性对照的检出情况，分析扩增子的信号峰和突变位点的信号峰。结果表述根据检测结果，对突变位点结果判断为基因突变、野生型。实验室要求对于采用本标准开展飞行时间核酸质谱平台用于肿瘤个体化用药基因或肿瘤良恶性辅助诊断基因的体细胞突变检测实验室，应具备基因扩增检测相关资质，并需经过标准提出方的评价和许可。

（资料性）

PCR反应液配方表及反应程序PCR反应液配方表试剂名称浓度用量/µLPCR缓冲液10×2.0氯化镁溶液50mmol/L1.6dNTP/dUTPmix25mmol/L0.1DNA聚合酶5U/µL0.2UDG1U/µL0.2F/R引物10µmol/L0.6纯化水/13.4DNA≥5ng/µL2.0总量/20.0PCR反应程序步骤温度/℃时间循环数1372min129510min139520s556530s44*∞1PCR产物暂时不进行下一步实验操作，可4℃保存不超过12h。

（资料性）

SAP反应混合液配方表及反应程序SAP反应混合液配方表试剂名称浓度用量/µL10xSAP缓冲液10×0.17SAP1.7U/µL0.3水/1.53总量/2.0SAP反应程序步骤温度/℃时间循环数13740min12855min134∞1建议SAP反应产物及时进行下一步实验操作，若暂不进行下一步操作，可2～8℃保存不超过24h。

（资料性）

单碱基延伸反应混合液配方表及反应程序单碱基延伸反应混合液配方表试剂名称浓度用量/µL10x延伸缓冲液10×0.2ddATPmix/ddGTPmix/ddCTPmix/ddTTPmix/0.2单碱基延伸引物5µmol/L～15µmol/L0.94延伸酶32U/µL0.04纯化水/0.62总量/2.0单碱基延伸反应程序步骤温度/℃时间循环数19530s12955s140525s580