T-CVMA 160-2024 猪链球菌与副猪格拉菌双重TaqMan实时荧光PCR检测方法

T/CVMA160—2024猪链球菌与副猪格拉菌双重TaqMan实时荧光PCR检测方法DetectionmethodofduplextheTaqManreal-timePCRassayforStreptococcussuisandGlaesserellaparasuis2024-5-8发布2024-5-8实施中国兽医协会发布I12规范性引用文件NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-timepolymerasechainCt值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数（CyclethreshoDNA：脱氧核糖核苷酸（DeoxyriTAMRA：6-羧基四甲基若丹明（Carboxytetramethylrhodamine）BHQ：无荧光淬灭基团（Blackholequencher）DEPC：焦碳酸二乙酯（DiethylpddH2O：双蒸水（Distillation-DistillationH2O）gdh：谷氨酸脱氢酶（glucosedehydrogenase）infB：翻译起始因子（translationinitiationfactorIF2-IF2alphaandIF2be5试剂和耗材25.1试剂5.1.5酚/氯仿/异戊醇混合液按5.1.9PCR试剂及DNA凝胶回收试20µL、200µL和1000µL）、冰箱（2℃~8℃和−20℃以下）、组织匀浆器、混匀器。8细菌核酸的提取38.2猪鼻/口拭子、唾液、关节液及环境样品DNA提取重悬，水浴锅沸水中煮10min，冰浴5min，12000r/min离心1min，取上清作为PCR扩增模板。8.3临床组织样品（扁桃体、肺脏等）DNA提取8.3.1用无菌剪刀和镊子剪取典型病变组织0.5g~1.0g，消化液II，反复吹吸混匀，置55℃,水浴30min~60min。9.1反应体系双重TaqMan实时荧光定量PCR反应体系见9.2反应程序双重TaqMan实时荧光定量PCR反应程序见9.3结果判定9.3.1质控标准当所有阳性对照的FAM和TAMRA检测通道均有典型的S型扩增曲线，阴性对照的FAM和TAMRA9.3.2结果判定45A.1猪链球菌gdh基因片段参考序列（GenBankAccessionNo.AM946016.CACCTGCAAGGTAGTCTGTACCAAGGTCGTATTTTTCAGCAGTTTCTTTGTGGCCATGATGTCTTTAAGACGGCCGTCTACTTCTTCACGAGTCCATGACAAGCGTGACTCATTTCAAGGGCAGATACAGCTACACCACCAGCGTTGGCAGCTTTTGCGAGTAACGCCATTTTCCTTGTAGACTTTGATGGCATCAAGGTCAGATGGCATGCACAGTACACGCCATTTTTTACAAGGGCAGCAGCTTGTTTGCCGTTGATCTCATTTTGAGTATGGAAGGGCAATATCAGCCTTGCCATCGTAGTTCCATACAGAACCTTTGAAGTACGATTTTTCTGCAGCGTATTCTGTCAAACGAGCGCGGCGTTTTTCTTTGATGTCCACCAAAAGTCGATACCAGTTTCGTCAATGATGTAACCATTTGAGTCTGAAACAGAAATAAAAGTTCAGTCGCTTTTTGAACAGCATATTGGGCAACGTTACCAGAACCTGAGATAAGGTCTTTGAAGGATTTACCGTTTGCTGCCAACATGTTATCAGTGAAGTAAACCAAACCGTGTTGCTTCTGGGCGGATCAATGAACCACCGAAGCCAAGAGGTTTACCAGTCAAGACACAAACTGGCGGAGGCGTTTGTATTGACCGTACATGTAACCGATCTCACGACCACCGACCACCAGCAGGGACGTCAAGTGAAGGTCCGATGTGTTTTTGCAATTCAGTCATGAAGCTAAGCGCATGATTTCAGCATCAGTTTTTCCTTTAGGATCAAAGTCTGAACCACCTTTACATTGGAAGACCAGTCAAGACGTTTTTGAAGATTTGCTCAAAACCGAGGAACTTCAAGATGGATTGGTTTACAGTTGGGTGGAAGCGAAGACCGCCTTTATAAGGACCTACAGCTGAGTTGAACGGTAGCCACGGTTGACTTGAACATTTCCATCTTTATCTGTCCATGGAACACGGGATACGCTCAGGCTCAACGATACGAGCCAAGATGTTTTCTTCGATGTATTCTGGAAACAGGCTCAAGTGTAGAGAAGAGCTCTTCTACAGCTTGGAGGAATTCTGTTTCATCGGGCTTTGACTGCTTCAAAAGAAGCTTGGATGTAAGCTTTGGCATTTGACAT-3'注：下划线部分为连入pMD-18T载体中的包含猪链球菌gdh目标检测片段部分，粗体为引物和探针A.2副猪格拉菌infB基因片段参考序列（GenBankAccessionNo.CP071489.1）5＇-GTTACGGACTTCTGAAACGTCGTCTTTGAAACGACGGAAATTACCACGTTATCACGTAATACACGGATTGGGTTGTTACGTTTGACGATACCTTCATACAACCTGCAATTGCACCAAATTTCGGGTGACGGAAGACATTACGCACTATTTCTTGTTTAAATTCAGGTTGTAACATACCGCTCATTGCTGCTTTGATTTCGTTTAATAGCTCATAAATGATTGAATAATAACGTAAATCAATGTTTTCGCTTTCGATAATGCGACCTGCACGGACGTTAAAGCCAAGTACAATAGCGTTAGACGCTGCCGCTAAGGTTGCATCCGTAATACCACCTACGCCAGAGCCAACTACTTTCACTTTTACTTCTGCCGTTGAAAGCAAAGATTGAACAATCGCTTCTACAGAGCCTTGTACGTCTGCTTTCACAATCACGTTCAACATCGCCTTCCGCCATATTGCTAAACATATTTTCAAGTTTCGCTTTTTGTTGGCGAGCCAAACATCACGGAATTTACCTTGACGGTATAACGCCACTTCACGCGCTTTTTTCTCATCACGGTCGCTTCATCACCTGCGGCTGGTACGCCTGAAAGTCCTAATACTTCCACAGGAATTGATGGG6GGCTGATTCAATGTCTTTACCATTTTCATCACGCATTGCACGAACACGGCCATATTCAAAGTACGATGTCGCCTTTGTTTAACGTACCTGATTGAACAAGGATAGTTGCAACTGGCCTTTATCGAGGTAAGATTCGATAACCACACCGCTTGCCATACCCTCTTTCACTGCACTTAAATACTTCCGATTGAAGAAGAATGGCTTCAAGTAAGTCGTCAATCCCCATTCCTTTTTTACAGGAACAAATTGAACATCACCACCGAATTTCTCAGAAATCACTTCGTGTTGTAATAACTTTCTACACGCTCTAGGTTTGCTTCTGGTTTATCAATTTTGTTTACCGCAACCACAGCTGCTTTCGCGTGTTGGATTGCTTCAATGGTTTGTGGCATTACGCCATCGTCAGCTAAGAACAACGATATCCGTTGCTTTCGCACCACGCGCACGCATTGAGGTAAATGGTGTATCTAAGAAGGTAATCATCTTACCGTCGTCGGTTTCAACGTGATATGCACCGATATGTAATACCGCCAGCTTCACCTGCTGCTACTTTCGCTTTACGGATATAATCTAATAA注：下划线部分为连入pMD-18T载体中的包含副猪格拉菌infB基因目标增，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接至pMD18-T载体构建重组质粒pMD-SS光度计检测2种阳性质粒浓度，并按下面公式将浓度换算成拷贝数，DNA为猪链球菌和副猪格拉菌双重TaqMan荧光PCR检测方法的阳性对照使A.4阴性对照的制备灭菌生理盐水：称取0.9g氯化钠，溶解在7gdhGdh-RGdh-ProbeinfB-FinfB-RinfB-Probe8Tris-HCl（pH值8.0）终浓度为10mmol/L；EDTA（pH值8.0）终浓度为250mmol/L；SDS终浓度为200ug/mL；NaCl终浓度为100mmol/L。杯中加入约400mlddH2O均匀混合；将溶液定容到509表D.1双重TaqMan实时荧光PCR反应体体积(μL）终浓度(μM）2×AnimalDetectionU+ProbeqPCRSuperPreSsuis探针（FAM标记）Gparasuis探针（TAMRA标记）25.0注：1.此反应体积以Animal