《磷酸化抗体在信号转到研究中的应用》

磷酸化抗体在信号转导研究中的应用张成

博士高级产品经理北京义翘神州科技股份有限公司义翘神州CONTENT信号转导中的蛋白质磷酸化1磷酸化抗体开发2磷酸化抗体的选择标准3磷酸化WB检测注意事项4义翘神州信号转导中的蛋白质磷酸化01义翘神州蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化：是指在蛋白质激酶催化下把ATP或GTPγ位磷酸基团转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程。蛋白质磷酸类型：蛋白质磷酸化类型蛋白质磷酸化位点氨基酸与磷酸基团之间的bondO-磷酸化丝氨酸（Serine；Ser；S）磷脂键苏氨酸（Threonine；Thr；T）酪氨酸（Tyrosine；Tyr；Y）N-磷酸化组氨酸（Histidine；His；H）氨基磷酸酯键精氨酸（Arginine；Arg；R）赖氨酸（Lysine；Lys；K）S-磷酸化天冬氨酸（Asparticacid；Asp；D）酸酐键谷氨酸（Glutamicacid；Glu；E）酰基磷酸化半胱氨酸（Cysteine；Cys；C）硫代磷酸酯键蛋白质蛋白质义翘神州信号转导中的蛋白质磷酸化义翘神州ERK通路示意图细胞应答反应蛋白磷酸化是信号转导最重要的途径之一，通过信号转导，可以将胞外信号转导至胞内，经过级联放大，细胞进行应答反应。HowERK1/2activationcontrolscellproliferationandcelldeath:Issubcellularlocalizationtheanswer?ERKsignalling:amasterregulatorofcellbehaviour,lifeandfateEGFR磷酸化激活义翘神州EGFR磷酸化激活ERK通路示意图HowERK1/2activationcontrolscellproliferationandcelldeath:Issubcellularlocalizationtheanswer?ChapterSix-TheUbiquitinNetworkintheControlofEGFREndocytosisandSignalingEGFR磷酸化调控义翘神州不同磷酸化位点与不同配体结合磷酸化程度与泛素化调控（受体脱敏）ChapterSix-TheUbiquitinNetworkintheControlofEGFREndocytosisandSignaling研究中不仅需要关注蛋白是否磷酸化，还须关注蛋白磷酸化的位点。ERK通路的级联调控义翘神州MAPKKKMAPKMAPKKMAPK/ERKPathwayasaCentralRegulatorinVertebrateOrganRegeneration级联调控有效放大了刺激信号，磷酸化蛋白能够使细胞进行快、慢反应。磷酸化抗体检测蛋白磷酸化义翘神州ERK通路示意图磷酸化抗体检测TKI活性HowERK1/2activationcontrolscellproliferationandcelldeath:Issubcellularlocalizationtheanswer?AZD9291,anirreversibleEGFRTKI,overcomesT790M-mediatedresistancetoEGFRinhibitorsinlungcancer磷酸化抗体能够检测蛋白质磷酸化状态，反映信号通路活性，为药物开发提供方向。磷酸化抗体开发02义翘神州磷酸化抗体要求义翘神州更高的特异性识别特定蛋白的特定位点是否发生磷酸化更高的灵敏度磷酸化蛋白丰度低于总蛋白磷酸化抗体主要类型磷酸化兔多克隆抗体优点：制备周期短、价格低缺点：非特异结合，批间有差异磷酸化鼠单克隆抗体优点：技术成熟，批间稳定缺点：筛选难度大磷酸化兔单克隆抗体优点：特异性好、灵敏度高缺点：价格高义翘神州多肽设计原则：长度10-16氨基酸多肽结构序列亲水性序列免疫原性序列同源性免疫原设计义翘神州兔多克隆抗体制备01多肽合成02动物免疫03抗体纯化04抗体质控05磷酸化多肽非磷酸化多肽多肽纯度>95%两只兔子4-5次免疫免疫成功率95%ProteinA纯化磷酸化多肽纯化非磷酸化多肽纯化与非磷酸化多肽交叉反应<10%天然样本检测义翘神州杂交瘤技术流程YYYYYYYYYYYYYYYYYSplenocytesMyelomaHybridomacellsScreeningAmplificationpurification技术路线成熟，可进行多种功能性筛选，成本低、易操作义翘神州免疫效价与阳性克隆关系磷酸化多肽效价与非磷酸化多肽效价差值越大，获得磷酸化特异性抗体的成功率越高义翘神州更多阳性抗体更好的多样性识别更多表位开发人鼠蛋白抗体结构更稳定亲和力更高特异性更好灵敏度更高兔单抗的特点和优势义翘神州优势：种属多样、可介入、筛选方式灵活局限：周期长、非天然配对、特异性一般应用：大分子抗原、纳米抗体、突变改造噬菌体Beacon优势：周期短、效率高、天然配对局限：成本高应用：成药性抗体开发兔单抗筛选平台比较义翘神州优势：周期短、天然配对、可介入、多样性好局限：抗原需要标记、培养效率应用：小分子、功能基团的特殊表位抗体开发流式分选ImmunizationorInfectedSplenocytes

&

PBMCSingleBCellSortingRT-PCR&

InsertVectorExpressionRT-PCRFunctionAssayBCellCulture兔单克隆抗体制备义翘神州

义翘神州

多肽设计保证95%的免疫成功率分选后>90%靶点可获得特异性抗体单B细胞培养成功率90%单B上清检测抗体特异性单B细胞上清筛选高亲和力抗体

单B细胞上清筛选功能性抗体1功能活性的磷酸化抗体磷酸化兔单抗开发总结123456Phospho-ERK1/2(Thr202,Tyr204)

兔单抗开发01动物免疫02流式分选03单细胞培养04抗体质控05免疫效价OD-B磷酸化多肽:0.65非磷酸化多肽:0.01磷酸化特异性B细胞：0.1%磷酸化特异性克隆比例：35%WB阳性磷酸化特异性克隆比例：50%义翘神州磷酸化抗体选择标准03义翘神州特异性验证天然样品验证

多肽阻断义翘神州AB+CalyculinA(100nM，30min)3510070554025KDaHelaHela抗体特异性识别磷酸化蛋白，磷酸化多肽可以阻断抗体与细胞裂解的结合Phospho-ERK1/2(Thr202,Tyr204)Antibody,RabbitMab,Cat:110441-R0072多应用特异性验证

WB

IHC义翘神州多种应用中验证特异性磷酸酶验证磷酸化特异性

IFΛ磷酸酶处理UVΛ磷酸酶---+++Phospho-p38MAPK(Thr180,Tyr182)Antibody,RabbitMonoclonal,Cat:110435-R0004多种属验证HelaNIH-3T3Human细胞样本Mouse细胞样本义翘神州抗体可以检测不同种属的细胞裂解液Phospho-ERK1/2(Thr202,Tyr204)Antibody,RabbitMab,Cat:110441-R0072灵敏度验证义翘神州抗体亲和力高，适用于检测低丰度的磷酸化蛋白Phospho-p70S6Kinase1(Thr389)Antibody,RabbitMab,Cat:110396-R0001磷酸化WB检测注意事项04义翘神州义翘神州样本高表达样本合理的刺激阴阳对照磷酸酶抑制剂低温裂解样本保存抗体充分验证优先单抗内参、总蛋白4℃过夜孵育TBS-T洗涤封闭液磷酸化WB检测注意事项关于“北京义翘神州”坚持自主研发生产打造中国生命科学研究“一站式”试剂与服务支撑平台人才与设施荣誉资质设施：---25,000+平米研发中心

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