第二部分 提高性实验

第二部分提高性实验

实验十三核酸的制备及定量测定

I.动物肝脏DNA的提取

一、目的：

了解分离提取DNA的一般原理，掌握从动物肝脏中提取DNA的方法。

二、原理：

在浓氯化钠（l-2mol-L'）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的

溶解度很小。在稀氯化钠（0.14moi•L“）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖

核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核

蛋白从样品中分别抽提出来。

将抽提得到的核蛋白用SDS（十二烷基磺酸钠）处理，DNA（或RNA）即与蛋白质

分开，可用氯仿一异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适

量乙醇，DNA即析出。

为了防止DNA（或RNA）酶解，提取时加EDTA（ethy-lenediaminetetraceticacid,

乙二胺四乙酸）。

三'器材及试剂：

1.器材：

①新鲜猪肝（一次用不完一定要冷冻保存）

②匀浆器

③离心机5000r,min-1

④量筒50ml（XI）、10ml（XI）

⑤水浴锅

⑥纱布

⑦真空干燥器

2.试剂：

①5moi-L'NaCl溶液：将292.3gNaCl溶于水，稀释至1000ml0

@0.14mol-L'NaCl-O.lOmol•L'EDTA-Na溶液：溶8.18gNaCl及37.2gEDTA-Na于

蒸储水，稀释至1000ml«

③25%SDS溶液：溶25g十二烷基磺酸钠于100ml45%乙爵。

@0.015mol•L'NaCl-0.0015mol-L-1柠檬酸三钠（salineitrate）溶液：氯化钠0.828g

及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸僧水，稀释至1000mlo

⑤氯仿一异戊（丙）醇混合液：氯仿：异戊（丙）醇=24：1（V/V）

@1.5mol-L'NaCl-0.15mol-L-1柠檬酸三钠溶液：氯化钠82.8g及柠檬酸三钠34.1g

溶于蒸储水，稀释至1000mla

⑦3moi•1/乙酸钠-0.001mol・L-iEDTA-Na溶液：称取乙酸钠408g、EDTA-NaO.372g

溶于蒸储水，稀释至1000ml«

⑧70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇。

四'操作步骤：

1.取猪肝20~30g,用适量0.14mol•L」NaCl-0.10mol・L」EDTA溶液洗去血液，剪碎，

加入约30~50ml0.14mol•L'NaCl-O.lOmol•L'EDTA溶液，置匀浆器或研钵中研磨，研磨

一定要充分，待研成糊状后，用单层纱布滤去残渣，将滤液离心10分钟（4000r-min'）

弃去上清液，沉淀用0.14mol•L'NaCl-O.lOmol•L'EDTA溶液洗二、三次。所得沉淀为

脱氧核糖核蛋白粗制品。

2.向上述沉淀物加入0.14moH/NaCl-0.10mol•L'EDTA溶液,使总体积为37ml,

然后滴加25%SDS溶液3ml,边加边搅拌。加毕，置60℃水浴保温10分钟（不停搅拌）

溶液变得粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。

3.加入5mol-L-'NaCl溶液10ml,使NaCl最终浓度达到1mol-L1,搅拌10分钟，

加入约一倍体积的氯仿-异戊（丙）醇混合液，振摇10分钟，静置分层，取上、中两层液

离心10分钟（4000r-min-'）o去掉沉淀，上层清液徐徐加入1.5—2倍95%乙静:，DNA沉

淀即析出，用玻璃棒顺着一个方向慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒上。

4.将DNA粗品置于27mI0.015mol•L'NaCl-O.OOlSmol•L"柠檬酸三钠溶液中，再

加入3mll.5mol♦L'NaCl-0.15mol•L"柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿一异戊

（丙）醇混合液,振摇10分钟,离心（4000r・min”，10分钟）,倾出上层液（沉淀弃去）,

加入1.5倍体积95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本

操作步骤重复一次。

5.将上步所得沉淀溶于27m10.0l5moiL」NaCl-0.0015moi柠檬酸三钠溶液中，然

后以线状徐徐加入2倍95%乙醉，边加边搅，取出丝状DNA,依次用70%、80%、95%及

无水乙醇各洗一次，真空干燥。保存待用。

五、结果与讨论：

1.所提取的DNA是否是纯品？如何进一步提高其纯度？

2.DNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？

II.酵母RNA的提取

一、目的：

学习稀碱法提RNA的原理与技术。

二'原理：

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法

和盐酸IM法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶

于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以

白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活

性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA,用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA,

主要用作制备核甘酸的原料•，其工艺比较简单。浓盐法是用10%左右氯化钠溶液，90℃提

取3—4h,迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。

稀碱法使用稀碱(本实验用0.2%NaOH溶液)使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去

蛋白质和菌体后的上清液用乙僧:沉淀RNA(本实验)或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的

RNA有不同程度的降解。

酵母含RNA达2.67—10.0%,而DNA含量仅为0.03—0.516%,为此，提取RNA多

以酵母为原料。

三'器材与试剂：

1.器材：

①干酵母粉(市售)。

②鲜酵母(市售)。

③pH试纸(pHl—10)»

④台天平(100g)。

⑤烧杯100ml(Xl)«

⑥量筒50ml(X1)、10ml(XI)。

⑦抽滤瓶500ml(X1)、布氏漏斗。10cm(XI),

⑧吸管0.5ml(XI)、1ml(义2)、2ml(X2)、5ml(XI)。

⑨离心机5000r•min」。

2.试剂：

①0.2%氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸储水并稀释至1000ml0

②乙酸（A•R）。

③95%乙醇。

④无水乙醛（C•P）。

⑤氨水（C•P）。

⑥10%硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）10mh缓缓倾于水中，稀释至100ml。

⑦5%硝酸银溶液：5gAgNO3溶于蒸储水并稀释至100mL贮于棕色瓶中。

⑧苔黑酚一三氯化铁试剂：将lOOmg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入

lOOmgFeCh,6H2O.临用时配制。

四'操作步骤：

1.RNA的提取：置4g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml,沸水

浴加热30分钟，经常搅拌。加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（石蕊试纸），离心10—15

分钟（4000r・min」）。取上清液，加入95%乙醛30ml,边加边搅。加毕，静置，待完全沉

淀，过滤。滤渣先用95%乙醇洗2次（每次约10ml）,继用无水乙醛洗2次（每次10ml）,

洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。乙醛滤干后，滤渣即为粗RNA,可作鉴定。

2.鉴定：取上述RNA约0.5g,加10%硫酸液5mL加热至沸1一2分钟，将RNA7K

解。

（1）取水解液0.5ml,加苔黑酚一FeCb试剂1mL加热至沸1分钟，观察颜色变化。

（2）水解液2ml,加氨水2ml及5%硝酸银溶液1ml,观察是否产生絮状喋吟银化合

物（有时絮状物出现较慢，可放置十几分钟）。

五、结果与讨论：

1.所得RNA是否是纯品？如何进一步纯化？

2.RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？

m.核酸的定量测定（一）一一定磷法

一、目的：

掌握定磷法测定核酸的含量。

二、原理：

在酸性环境中，定磷试剂中的铝酸镂以铝酸形式与样品中的磷酸反应生成磷铝酸，当

有还原剂存在时磷钳酸立即转变蓝色的还原产物一一铜蓝。

H3PO4+12H2Mo04fH3P（M03C）10）4+12H2O

I还原剂

铝蓝

铝蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适

范围为1-10微克无机磷。

测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去

未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可以计算出核酸含量。

三'器材及试剂：

1.器材：

①分析天平。

②容量瓶（50及100毫升）。

③台式离心机。

④离心管。

⑤凯氏烧瓶（25毫升）。

⑥恒温水浴锅。

⑦200℃烘箱。

⑧硬质玻璃试管。

⑨吸量管。

⑩分光光度计。

2.试剂：

以下试剂均用分析纯，溶液要用重蒸水配制。

①标准磷溶液：将分析纯磷酸二氢钾（KH2P。4）预先置于105℃烘箱烘至恒重。然后

放在干燥器内使温度降到室温，精确称取0.2195克（含磷50毫克），用水溶解，定容至

50毫升（含磷量为1毫克/毫升），作为贮存液置冰箱中待用。测定时，取此溶液稀释100

倍，使含磷量为10微克/毫升。

②定磷试剂3mol•1?硫酸：水：2.5%铜酸铁：10%抗坏血酸=1：2：1：1（体积比）］：

配制时按上述顺序加试剂。溶液配制后当天使用。正常颜色呈浅黄绿色，如呈棕黄色或深

绿色不能使用，抗坏血酸溶液在冰箱放置可用1个月。

③沉淀剂：称取1克铝酸镀溶于14毫升70%过氯酸中，加386毫升水。

④5moi,L"硫酸。

⑤30%过氧化氢。

四'操作步骤：

1.标准曲线的绘制：取12支洗净烘干的硬质玻璃试管，按下表加入标准磷溶液、水

及定磷试剂，平行作两份。

标准磷溶液水相当于无机磷量定磷试剂

编号

（毫升）（毫升）（微克）（毫升）

103.003

20.22.823

30.42.643

40.62.463

50.82.283

61.02.0103

将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温25分钟。取出冷却至室温，于660nm

处测定光密度。

取两管平均值，以标准磷含量（微克）为横坐标，光密度为纵坐标，绘出标准曲线。

2.测总磷量：取4个微量凯氏烧瓶，1、2号瓶内各加0.5毫升蒸储水作为空白对照，

3、4号各加0.5毫升制备的RNA溶液（约3毫克RNA）,然后各加毫升5mol-L-1

硫酸。将凯氏烧瓶置烘箱内。于140—160℃消化2—4小时。待溶液呈黄褐色后，取出稍

冷，加入1—2滴30%过氧化氢（勿滴于瓶壁），继续消化，直至溶液透明为止。取出，冷

却后加0.5毫升蒸储水，于沸水浴中加热10分钟，以分解消化过程中形成的焦磷酸。然后

将凯氏烧瓶中的内容物用蒸储水定量地转移到50毫升容量瓶内，定容至刻度。

取4支硬质玻璃试管，分成两组，分别加入1毫升上述消化后定容的样品和空白溶液,

如前法进行定磷比色测定。测得的样品光密度减去空白光密度，并从标准曲线中查出磷的

微克数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的总磷量。

3.测无机磷量：取4支离心管，于2支中各加水0.5毫升，另2支中各加0.5毫升制

备的RNA溶液，然后于4支离心管中各加0.5毫升沉淀剂，摇匀，以3500转/分离心15

分钟，取0.1毫升上清液，加2.9毫升水和3毫升定磷试剂，同上法比色，由标准曲线查

出无机磷的微克数，再乘以稀释倍数即得每毫升样品中的无机磷量。

五、结果与讨论：

1.绘制出标准曲线。

2.计算

RNA的含磷量为9.5%,因此可以根据磷含量计算出核酸量，即1微克RNA磷相当于

10.5微克RNAo将测得的总磷量减去无机磷量即RNA磷量。如样品中含有DNA时，RNA

磷量尚需减去DNA磷量，才得到RNA磷量。DNA的含磷量平均为9.9%。

RNA量=（总磷量一无机磷量一DNA量X9.9%）X10.5

核酸％=待测液中测得的如微克数义I。。

待测液中制品的微克数

思考题

定磷法的操作中有哪些关键环节？为什么所用水的质量、消化时间、铝酸铉的质量和显色时酸的浓

度对测定结果影响很大？操作中应如何控制？

IV.核酸的定量测定（二）一一紫外吸收法

一、目的：

学习和掌握应用紫外分光光度法直接测定核酸含量的原理及技术。熟悉紫外分光光度

计的基本原理与使用。

二、原理：

DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光

的性质是喋吟环和口密嘘环的共规双键系统所具有的，所以喋吟和口密咤以及一切含有它们的

物质，不论是核甘、核甘酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核昔酸的摩尔消光系数

（或称吸收系数）用E（尸）来表示，E（P）为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光

值（即光密度或称光吸收）。RNA的E（P）260nm（pH7）为7700—7800。RNA的含磷量

约为9.5%,因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.022—0.024。小牛胸腺DNA

钠盐的E（P）260nm（pH7）为6600,含磷量为9.2%,因此每毫升溶液含1微克DNA钠

盐的光密度值为0.020。

蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm

波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低

时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的

260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。

三、器材与试剂：

1.器材：

①容量瓶（50毫升）。

②离心管。

③离心机。

④紫外分光光度计。

2.试剂：

①相酸筱-过氯酸沉淀剂［0.25%铝酸钱-2.5%过氯酸溶液］:取3.6毫升70%过氯酸和

0.25克铝酸镂溶于96.4毫升蒸储水中。

②样品RNA或DNA干粉。

四、操作步骤：

将样品配制成每毫升含5-50微克核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm和

280nm吸收值，计算核酸浓度和两者吸收比值。

O-D

RNA浓度（微克/毫升）=—~"X稀释倍数

0.024xL

DNA浓度（微克/毫升）=0.0260x稀释倍数

0.020xL

式中：O.D260为260nm波长处光密度读数；L为比色杯的厚度；0.024为每毫升溶液内含

1微克RNA的光密度；0.020为每毫升溶液内含1微克DNA钠盐时的光密度。

如果待测的核酸样品中含有酸溶性核甘酸或可透析的低聚多核甘酸，则在测定时需加

铝酸镀-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260nm处吸收值作为对照。具

体操作如下：

取两支小离心管，甲管加入0.5毫升样品和0.5毫升蒸储水；乙管加入0.5毫升样品和

0.5毫升铝酸锈-过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴中放置30分钟，以3000转/分离心10分钟，

从甲、乙两管中分别吸取0.4毫升上清液到两个50毫升容量瓶内，定容到刻度。于紫外分

光光度计上测定260nm处吸收值。

五、结果与讨论：

A。匕

RNA（或DNA）浓度（微克/毫升）=x稀释倍数

0.024（或0.020）xL

式中：△O.D260为甲管稀释液在260nm波长处吸收值减去乙管稀释液在260nm波长处吸

收值。

核酸％方测液中测得的核酸微克鳌X1。。

待测液中制品的微克数

思考题

1.用该法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？

2.若样品中含有蛋白质，如何排除干扰？你认为最简便的方法是什么？

V.核酸的定量测定（三）一一二苯胺法

一、目的；

学习并掌握二苯胺法定量测定DNA含量的原理与方法。

二'原理：

脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在

595nm处有最大吸收。DNA在40—400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比。在反

应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样

反应。其它多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。

DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成3-羟基-Y-酮基戊醛，与二苯胺试剂作

用生成蓝色化合物（Amax=595nm）。可用比色法测定。

H+

DNA（脱氧戊糖基）11.HO—CH2—C—CH2—CH2—CHO

II

二苯胺O

-＞蓝色化合物

三、器材与试剂：

1.器材：

①分析天平。

②恒温水浴锅。

③试管。

④吸量管（2毫升和5毫升）。

⑤分光光度计。

2.试剂：

①DNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取小牛胸腺DNA钠盐以5mmol•L-1氢氧

化钠溶液配成200微克/毫升的溶液。

②样品待测液：准确称取DNA干燥制品以5mmol•L”氢氧化钠溶液配成50-200微

克/毫升的溶液。在测定RNA制品中的DNA含量时，要求RNA制品的每毫升待测液中至

少含有20微克DNA,才能进行测定。

③二苯胺试剂：

A液：称取1克重结晶二苯胺，溶于100毫升分析纯的冰乙酸中，再加入10毫升过

氯酸（60%以上），混匀贮于棕色瓶中待用。

B液：配制1.6%的乙醛液，临用前配制。

临用时将A液20ml与B液0.1ml混合即得二苯胺试剂。

四、操作步骤：

1.标准曲线绘制：取干燥试管7支，按下表0—6号管操作。

2.样液测定：取2支试管按下表中7、8两号管操作。

管号

试剂（肃尸012345678

DNA标准液

00.40.81.01.21.62.000

(200ug・ml1)

蒸储水2.01.61.21.00.80.4000

二苯胺试剂4.04.04.04.04.04.04.04.04.0

DNA待测液00000002.02.0

摇匀，70匕水浴保温lh,在595nm处测吸光度（OD值或A值）

OD595

DNA含量(Ug)080160200240320400

五、结果与讨论:

1.DNA标准曲线绘制:

根据测定数据，以DNA含量（ug）为横坐标，OD595值为纵坐标，绘制出标准曲线。

2.DNA含量的计算：

按下式计算样品中DNA的百分令量

样液中测得的DNA置〃g）

产样液中所含样品量（爆）X100

思考题

利用二苯胺法测定DNA含量时，若DNA样品中混有DNA或蛋白质、糖类时，是否会有干扰？

VI.核酸的定量测定（四）一一地衣酚（苔黑酚）法

一、目的：

了解并掌握地衣酚法测定RNA含量的基本原理和具体方法。

二'原理：

RNA含量测定，除可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法测定。其反应原理是:

当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3,5-二羟基

甲苯（地衣酚orcinol）反应，在Fe3+或Cd+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm

处有最大吸收。RNA浓度在20—250ug・mH范围内，光吸收与RNA浓度成正比。地衣

酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。

因此，测定PNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量。

三'器材与试剂：

1.器材：

①分析天平。

②沸水浴锅。

③试管。

④吸量管。

⑤分光光度计。

2.试剂

①RNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取酵母RNA配成100微克/毫升的溶液。

②样品待测液：配成每毫升溶液含RNA干燥制品50-100微克。

③地衣酚试剂：先配0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实验前用此溶液作为溶

剂配成0.1%地衣酚溶液。

四、操作步骤：

1.标准曲线的制作

取12支干净烘干试管，按下表编号及加入试剂。平等作两份。加毕置沸水浴加热

25min,取出冷却，以零号管作对照，于670nm波长处测定光吸收值。取两管平均值，以

RNA浓度为横坐标，光吸收为纵坐标作图，绘制标准曲线。

Jj组(X2)

012345

试剂

标准RNA溶液/ml00.40.81.21.62.0

蒸储水/ml2.01.61.20.80.40.0

地衣酚-Cu2+/ml2.02.02.02.02.02.0

2.样品的测定

取两支试管，各加入2.0ml样品液，再加2.0ml地衣酚-Ci?+试剂。如前述进行测定。

五、结果与讨论：

1.绘制出标准曲线

2.RNA含量的计算

根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量，按下式计算出

制品中RNA的百分含量：

=待测液中测得的含量(〃g/4)ion

产待测液中制品的含量(爆/血)一

注意事项

(1)样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。

(2)本法特异性较差，凡属戊糖均有反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时，

亦有干扰作用。如在试剂中加入适量CuCl2-2H2O可减少DNA的干扰，甚至某些已糖在

持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。此外，利用RNA和

DNA显色复合物的最大光吸收不同，且在不同时间显示最大色度加以区分。反应2min后,

DNA在600nm呈现最大光吸收，而RNA则在反应15min后，在670nm下呈现最大光吸

收。

思考题

利用本法测定RNA的含量，灵敏度较高，但特异性较差，有哪些干扰因素？如何排除干扰？

实验十四离子交换柱层析分离核昔酸

一、目的：

学习离子交换柱层析法分离核昔酸的原理及方法。

二'原理：

离子交换作用一般指在固相和液相之间发生的可逆的离子交换反应，它可用于分离各

种可解离的物质。通常离子交换剂是在一种高分子的不溶性母体上引入若干活性基团。这

样人工会成的离子交换剂具有各种各样的性能。作为不溶性母体的离分子有树脂、纤维素、

葡聚糖、琼脂糖或无机聚合物等，引入的活性基团可以是酸性基团，如强酸型的含有磺酸

基（-S03H）、中强酸型的含磷酸基（一PO3H2）、亚磷酸基（一PChH）、弱酸型的含有竣

基（一COOH）或酚竣基（-0H）等。也可以是碱性基团，如强碱型的含季较［-N+（CH3）3］、

弱碱型的含叔胺［―N（CH3）2］、仲胺（一NHC%）、伯胺（一NH2）等。

在一定条件下，离子交换树脂吸附的物质数量和在溶液中的物质数量达到平衡时，两

者数量之比叫分配系数（平衡常数）。理想的情况是洗脱曲线和分配系数相符合，待分离

的各种物质的分配系数，应有足够的差别，以K”表示分配系数：

式中M和M分别代表单位重量离子交换树脂和单位体积溶液中溶质的摩尔数。当有4、

B两种溶质进行离子交换柱层析时，吸附在离子交换树脂上的溶质为高浓度的竞争性离子

所交换并被洗脱下来。溶质的迁移速度与分配系数成反比，因此由原点到A、8两种物质

四种及枝根相对分正系数与pH的美索（阴炸

波峰间距离的比值决定于它们分配系数的比值。各波峰的幅度和形状由柱长及其他因素

（如交换树脂颗粒的大小形状、交联度、流速等）所决定。溶质的分配系数不仅与其电荷

有关，也受到它与离子交换树脂的非极性亲和力以及两者之间的空间关系等因素的影响。

在一定条件下，离子交换树脂对不同单核甘酸的吸附能力是不同的，因此选择适当类

型的离子交换树脂，控制吸附及洗脱的条件便可分离各种单核甘酸。

为了增加单核甘酸在离子交换树脂上的吸附能力，需要：（1）控制条件，使单核甘酸

带上大量相应的电荷。这主要是通过调节pH值，使单核甘酸的一些可解离基团（磷酸基、

氨基、烯醇基）解离，四种单核甘酸相对分配系数与pH的关系如图14-1,（2）减少上柱

溶液中除单核甘酸外的其它离子的强度。洗脱时则相反：使被吸附的单核昔酸的相应电荷

降低；增加洗脱液中竞争性的离子的强度，必要时提高温度使离子交换树脂对单核甘酸的

非极性吸引作用减弱。

RNA可被碱水解成2'-或3'-核甘酸。可利用阳离子交换树脂（聚苯乙烯一二乙烯

苯，磺酸型）或阴离子交换树脂（聚苯乙烯一二乙烯苯，季镂碱型）分离单核甘酸。本实

验利用强碱型阴离子交换树指（强碱型201X8、强碱型201X7、国产717、Dowexl、Amberlite

IRA-400或ZerolitFF等）将各类核甘酸分开，测定核甘酸的紫外吸收光谱的比值：

0.D250/O.D260、0.D280/O.D260、0.D290/O.D260对照标准比值（表14-1）,可以确定

其为何种核甘酸，同时也能算出RNA中核昔酸的相对摩尔比。

三'试剂及器材：

1.试剂：

①RNA（酵母RNA,商品）

②强碱型阴离子交换树脂201X8（聚苯乙烯一二乙烯苯、三甲胺季筱碱型，全交换量

大于3毫摩尔/克干树脂，100—200目）：用水浸泡并利用浮选法除去细小颗粒，使用时先

用0.5mol-1/氢氧化钠溶液浸泡1小时，以除去碱溶性杂质，然后用无离子水洗至中性。

再用1N盐酸浸泡半小时，除去酸溶性杂质，再用无离子水洗至中性，然后用lmol・L"

甲酸钠溶液浸泡，使树脂转变成甲酸型。将树脂装入柱内，继续用甲酸钠溶液

洗，直到流出液中不含氯离子（用1%硝酸银溶液检查）.最后用ImokU甲酸洗，直到

260nm处光密度值低于0.020,并用蒸储水洗至接近中性，即可使用（装置见图14一2）。

@lmol•L“甲酸:取21.4毫升88%甲酸定容至500毫升。

@lmol-L-1甲酸钠溶液：称34.15克甲酸钠用水溶解定容至500毫升。

@0.02mol•1/甲酸:取10毫升Imol•L」甲酸定容至500毫升。

(§)0.15mol•L"甲酸：取75毫升Imol•L-1甲酸定容至500毫升。

®0.01mol-L-1甲酸一0.05mol•L“甲酸钠溶液(pH4.44)：取5毫升Imol•L-1甲酸、25

毫升Imol-L"甲酸钠溶液定容至500毫升。

毫升Imol•L"甲酸钠溶液定容至500亳升.

O,P

fAHCOOH-I—n-一LO.OIMHCOOH|-0.10MHCOOH_

4—0.02MHCUUH—|0.15MHCOOH—[—0,05MHCOON，-j^(M0MHCOON■一

n

12j*

CMPAMpjlUMPGMP

1.0

©O.lmol•L-1甲酸一O.lmol•L-1甲酸钠溶液（pH3.74）：取50毫升Imol•L-1甲酸、

50毫升Imol-L-1甲酸钠溶液定容至500毫升。

@0.3mol•L1氢氧化钾溶液：取1.68克氢氧化钾用水溶解定容至100毫升。

⑩2moi•L-1过氯酸：取17毫升70—72%过氯酸定容至100毫升。

⑪Imol,L-1盐酸。

00.5mol•L-1氢氧化钠溶液。

2.器材：

①玻璃柱（内径1.1厘米、高20厘米）。

②下口瓶。

③部份收集器。

④紫外分光光度计。

⑤紫外检测仪。

⑥恒温水浴锅。

四、操作步骤：

1.样品处理：取20毫克酵母RNA,溶于2毫升0.3mol氢氧化钾溶液中，于37℃

水解20小时，RNA在碱作用下水解成单核甘酸，水解完成后，用2moi•U过氯酸溶液

高至pH2以下，以4000转/分离心10分钟，取上清液，用2mol•L」氢氧化钠溶液调至

pH8,并用紫外分光光度计准确测得含量后待用。

2.离子交换柱的安装：取内径1.1—1.2厘米、高20厘米的玻璃管柱。下端橡皮塞中

央插入一玻璃滴管供收集流出液，橡皮塞上盖以尼龙网和薄绢以防止离子交换树脂流出9

见图14-2）,

将处理好的强碱型阴离子交换树脂悬浮液一次倒入玻璃柱内，使树脂自由沉降至柱下

部，用一小片圆滤纸盖在树脂面上。缓慢放出液体，使液面降至滤纸片下树脂面上。（注

意在整个操作过程中防止液面低于树脂，当液面低于树脂表面时空气将进入，在树脂柱内

形成气泡，妨碍层析结果）。经沉积后离子交换树脂柱床高7—8厘米。

3.加样：将RNA水解液小心地用滴管加到离子交换树脂柱上，待样品液面降低到滤

纸片内时，用50毫升蒸微水淋洗树脂柱。碱基、核昔及其他不被阴离子交换树脂吸附的

杂质均被洗出。

4、核甘酸混合物的洗脱：收集蒸储水洗脱液，在紫外分光光度计上测260nm处光密

度，待洗脱液不含紫外吸收物质（光密度值低于0.020）时，可用甲酸及甲酸钠溶液进行

洗脱。

依次用下列洗脱液分段洗脱，500毫升0.02mol-L-1甲酸；500毫升0.15mol•L」甲

酸;500毫升0.01molL"甲酸-0.05molV甲酸钠溶液（pH4.44）；最后用500毫升O.lmol<L"

甲酸-O.lmol-L-1甲酸钠溶液（pH3.74）。用部份收集器收集流出液，控制流速8毫升/10

分，8毫升/管。

5、由层析柱所得各部分洗脱液的分析：以相应浓度的甲酸或甲酸钠溶液作为空白对

照，用紫外光分光光度计测定各管溶液在260nm波长处光密度值，以洗脱液体积（或管数）

为横坐标，光密度值为纵坐标作图，分析各部分的波峰位置（见图14-3）。

五'结果分析：

根据各部分核甘酸在不同波长时光密度的比值（O.D250/O.D260、O.D280/O.D260>

O.D290/O.D260）,对照标准比值（见表14-1）以及洗脱时相对位置，确定其为何种核昔

酸。由洗脱液的体积和它们在紫外部分的光密度值，计算各种核甘酸的含量（各种核甘酸

的摩尔消光系数见表5-1）,

表14-1部分核甘酸的物理常数

紫外吸收光谱性质

摩尔消光系数光密度比值

核甘酸分子量

E26OX10-3250/260280/260290/260

27272727

2'14.515.30.850.80.230.150.0380.009

腺喋吟核甘-

2-3「或5」347.23,14.515.30.850.80.230.150.0380.009

磷酸

5，14.515.30.850.80.220.150.030.009

12.312.00.901.150.680.680.480.285

鸟口票岭核昔-2'

2'-、3'-或5'-363.23,12.312.00.901.150.680.680.480.285

磷酸

5'11.611.71.221.150.680.680.400.28

6.97.750.480.861.830.861.220.26

胞啼咤核昔-2,

2'-、3'-或5'-323.23，6.67.60.460.842.000.931.450.30

磷酸

5，6.37.40.460.842.100.991.550.30

尿嚓噬核昔-324.22'9.99.90.790.850.300.250.030.02

2'・、3'•或5'-

3(9.99.90.740.830.330.250.030.02

磷酸

5'9.99.90.740.730.380.400.030.03

思考题

本实验用阴离子交换树脂分离各单核甘酸，若用阳离子交换树脂能否分离各单核甘酸？

实验十五聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）分离血清蛋白质

（核黄素-TEMED聚合系统）

一、目的：

1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

2.掌握聚丙烯酰胺园盘电泳的操作技术。

3.比较醋酸纤维薄膜电泳与本法分离血清蛋白质的效果。

二、原理：

（-）盘状电泳原理

盘状电泳是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持

物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH

的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区

带（厚度为10-2厘米），然后再进行电泳分离。

盘状电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质不连续性（discontinuity）,凑巧分离

出的区带也很象圆盘状（discoidshape）,取“不连续性”及“圆盘状”的英文字头“disc”。

因此，英文名称为discelectrophoresis,中文直译为盘状电泳。

仪器装置：（见图15-1）。上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液。上下槽的缓冲

液中分别有正、负电极通入。上槽底部有很多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃管。

这里仅以Davis和Orstein（1964）用分析血清蛋白的高pH的不连续系统为便说明其

基本原理。此系统是一个高pH的碱性系统，或称阴离子系统，最初用于分析血清蛋白，

但也适用于其他的酸性和中性蛋白。很多细胞蛋白质，或病毒的结构蛋白在此系统中（pH8

-9）解离成阴离子，向阳极移动。系统由下列三种不连续的凝胶组成。即在每支玻璃管

中装有三层不同的凝胶（见图15-2）。最上层为样品胶，中层为浓缩胶（又称间隔胶或积

层胶），下层为分离胶（又称电泳胶）。

n

H

u4

iB

O

慎络皎（闰代皎或根层皎）uD

sE

s

在我席皆中要存三县不同的RE!示直用

在盘状电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一

般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。例如人血清

用纸电泳（PH8.6）可以分成5-7个成分，而用盘状电泳也可分成20-30个条带清晰的成分

（参看图15-3）。若采用不连续的浓度梯度凝胶柱，则可增至62个条带。又如人的唾液经

盘状电泳。可分出10多个蛋白质条带（参看图15-4）。

下面就盘状电泳过程中三种物理效应的原理加以说明。

1.样品的浓缩效应：由于电泳基质的四个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓

缩，然后再被分离。

（1）凝胶层的不连续性：三层不同的凝胶，其作用如下：

样品胶：为大孔凝胶，用光聚合法制备，样品预先加在其中再聚合起防止对流的作用，

避免样品跑到上面的缓冲液中。

浓缩胶：为大孔凝胶，用光聚合法制备，有防对流作用。样品在其中浓缩，并按其迁

移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。

分离胶：为小孔胶，一般采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离。

也有防对流作用。

蛋白质分子在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔凝胶时遇到的阻力大,

速度就减慢了。由于凝胶层的不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品浓缩，区

带变窄。

（2）缓冲液离子成分的不连续性

在电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方面泳动，其迁移率不同，两种离子若

能形成界面，则走在前面的离子称为快离子（又称先行离子），走在后面的离子称为慢离

子（又称随后离子）。为使样品达到浓缩的目的，需在电泳缓冲系统中加入有效迁移率大

小不相同的两种离子。并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的两相。即在三层凝胶中

加入快离子，在电极缓冲液中加入慢离子。

为了保持溶液的电中性及一定的pH,需加入一种与快、慢离子符号相反的离子，称

为缓冲配对离子。使缓冲配对离子分布于全部电泳缓冲系统中（即三层凝胶及电极缓冲液

中）。例如分离蛋白质样品时，通常用cr为快离子，NH2cH2co0-为慢离子，采用三羟甲

基氨基甲烷（简称Tris）作为缓冲配对离子。

Hx上7尔6工W人0

电泳开始前，如图15-5A所示，慢离子位于两个电极槽中，快离子分布在三层凝胶中，

样品在样品凝胶中，缓冲配对离子位于全部系统中。电泳进行中如图15-5B所示，快离子

与慢离子的界面向下移动，由于选择适当的pH缓冲液，使蛋白质样品的有效迁移率（有

效迁移率=机。，机为迁移率，a为解离度）介于快离子与慢离子的界面处，而浓缩成为极

窄的区带。它们的有效迁移率按下列次序排列：恨1。4g,<^>恨!。6（0代表氯离子，

P代表蛋白质，G代表甘氨酸负离子）。样品若是有颜色的，可以看到样品在界面处浓缩成

极窄的区带。样品的分离，如图15-5C所示。当样品达到浓缩胶与分离胶界面处，离子界

面继续前进，蛋白质被留在后面，然后分成多个区带。

（3）电位梯度的不连续性

电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关，因为电泳速度等于电位梯度与迁移率的乘

积。迁移率低的离子，在高电位梯度中可以与具有高迁移率而处于低电位梯度的离子具有

相似的速度。在不连续系统中，电位梯度差异是自动形成的。电泳开始后，由于快离子的

迁移率最大，就会很快超过蛋白质，因此在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低

电导区。电导与电位梯度是成反比的：

9

Ij电极缓冲液

E=-

|样品胶

7高电位梯度Ei

（不连续性）

式中E为电位梯度，I为电流强度，n为电导率.，浓缩胶

所以低电导区就有了较高的电位梯度。这种高电低电位梯度Ei

|分离皎

位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。©

当快离子、慢离子和蛋白质迁移率和电位梯度的

乘积彼此相等时，则三种离子移动速度相同.在回

快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立慢离壬快离子蛋白H

不连续系统浓缩效应示意图.

之后，则在快离子和慢离子之间形成一个稳定而03

又不断向阳极移动的界面。也就是说在高电位梯度区和低电位梯度区之间的地方形成一个

迅速移动的界面（图15-6）o由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因

此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。

（4）pH的不连续性

在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，这是为了控制慢离子的解离度，从而控制

其有效迁移率。要求在样品胶和浓缩胶中，慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以

使样品夹