SN∕T 4853.1-2017 转基因大米定量检测数字PCR法 第1部分：TT51-1品系

转基因大米定量检测数字PCR法I 本部分为SN/T4853的第1部分。1转基因大米定量检测数字PCR法第1部分：TT51-1品系1范围SN/T4853的本部分规定了稻谷和大米中TT51-1品系的数字PCR定量检测方法。本部分适用于稻谷和大米中TT51-1品系特异性的数字PCR定量检测。本方法的定量检测低限(LOQ)为0.1%(质量分数)。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.5转基因产品检测核酸定量PCR检测方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法下列术语和定义适用于本文件。SPS基因thegeneofsucrosephosphates蔗糖磷酸合成酶基因，大米单拷贝内参照基因。TT51-1转化体特异性序列event-specificsequenceofTT51-1外源DNA插入受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。定量检测低限limitofquantification;LOQ在相对标准差不超过25%的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量。2NC:阴性对照(negaitivecontrol)PC:阳性对照(positivecontrol)依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列(eventspecificsequence)和内参照基因(species37.596孔荧光定量PCR反应板和封膜。扩增基因名称序列(5'-3”)PCR扩增片段长度SPS基因下游引物VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA体特异性序列下游引物ATGAGTGGTAGCGTCCAGAAGGFAM-CTGGGGCAGATAAGCAGTAGTGGTGG注1:表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进行适当调式标记。48实验步骤按照GB/T19495.7的规定执行。8.2样品制备除另有规定外，样品制备按照GB/T19495.7或SN/T1194的规定执行。将样品适度破碎、均一化，取出至少200g,全部放入样品研磨机中，研磨至60目左右粒度。破碎和研磨过程中应凋整设备的操作参数，避免过热并防止样品粘连8.3核酸提取纯化8.3.1核酸提取及PCR抑制物的判断除另有规定外，DNA提取纯化及PCR抑制物的判断按照GB/T19495.3中的规定执行。称取2份(每份2g)研磨后样品作为测试样，分别提取基固组DNA。8.3.2模板浓度控制采用PicoGreendsDNA荧光定量试剂盒或其他具有等效结果的仪器/方法测定DNA溶液的浓度，具体操作步骤参照相关仪器/试剂盒说明书数字PCR体系中的模板数应不高于微反应体系数的5倍。为保证定量结果的准确性，体系中总模板数应不低于400个拷贝。将样品DNA溶液作适度稀释，选择模板浓度在100拷贝/μL～20000拷贝/pL范围内的稀释液分别用于SPS基因拷贝数和转化体特异性序列拷贝数的数字PCR定量检测。8.4数字PCR扩增8.4.1数字PCR体系配制按表2将各组分加入洁净离心管中，充分混匀内源基因反应体系SPS基因反向引物(10μmol/L)dH₂O(无菌水)外源基因反应体系5表2(续)终浓度外源基因反应体系一dH₂O(无菌水)注：数字PCR反应体系的总体积可根据不同厂家作说明生成微反应体系。将微反应体系放置于PCR扩增仪中，按以下参数进行PCR扩增：95℃,12℃保存反应产物。对微反应体系进行荧光检测性微反应体系数量及其比值。根据比值分别计算数字PCR反应体系中的SPS基因拷和TT51-1转化体特异性序列拷贝数a)NC:采用非转基因大米的基因组DNA作为数字PCR反应c)PC:采用质控样品的基因组DNA作为数字PCR反应模板。每个测试样和PC的SPS基因或TT51-1转化体特异性序列的数字PCR应设置至少3个平行，且3个平行实验结果的相对标准偏差应不高于20%。b)PC的SPS基因或TT51-1转化体特异性序列检测有阳性扩增；10.1数字PCR仪运行后经软件计算得出每个测试样的SPS基因拷贝数和TT51-1转化体特异性序6A——转基因大米品系TT51-1的含量，%;B——TT51-1转化体特异性序列拷贝数；D——转换系数。10.2如两个测试样的TT51-1品系含量的相对相差大于或等于35%,则测试结果应放弃，并应重做样品制备及后续试验。相对相差的计算参照GB/T19495.5中的规定执行。10.3如两个测试