实时活细胞分析开启免疫细胞杀伤实验新格局

活细胞分析、细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞、免疫细SR正OZIUS在理解癌症并开发新治疗策略的持续不断的研究中，研究人员正在探索患者的自身免疫系统在抵御肿瘤时发挥的作用。这种抗癌反应的一个关键组成部分是某些免疫细胞（如细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞）通过免疫细胞杀伤（ICK）过程诱导恶传统上有多种用于评估ICK的技术，如流式细胞术及生化读数。虽然这些都是有效的手段，但它们只能从单个时间点的分析中得出测量结果，并不能对动态细胞相互作用进行表征，从而限制了可获得的生物学见解。因此，为了更全面地了解ICK，科学家们非常需要一些能够捕捉、可视化并量化ICK相关动态变化的方法。此外，随着转化模型的应用越来越广泛，研究人员需要一些可应用于3D肿瘤球体以及贴壁和非贴壁2D共培养物的灵活ICK分析方法。本白皮书展示了实时活细胞分析技2鉴于ICK的复杂性，研究人员在体外模拟这个流程时也会在共培养模型中测定细胞特异性细胞毒性信号。例如，使法确定信号是否来自共培养模型中的肿瘤细胞或免疫细胞胞特异性信号。然而，背景信号仍然会限制从该分析中得即使对肿瘤细胞的细胞毒性进行最可靠的分析，这种细胞死亡的总体指标也无法反映ICK中复杂细胞相互作用的微妙之处。举个例子，不同的T细胞亚群在诱导肿瘤细胞死亡时可能会发挥不同的功能作用。3探索这些行为差异的研究人员就需要研究激活的免疫细胞的形态特征以及其与癌细胞的空间关系。然而，用于评估ICK的传统方法并不是基于影像的，通常需要取出细胞。因此，科学家需要采用补充性技术，以便在这一动态过程中对表型和空间有深入除了难以获得可靠且全面的数据外，传统的分析方法还缺乏充分表征ICK过程所需要的时间分辨率。由于大多数方法是在预先确定的终点进行参数评估，因此无法深入了解生物学中的动态变化。4另外一个问题是收集数据时细胞成熟度和健康状况的可变性，这可能会限制结果的质量和可此外，当发现问题时，排除问题以确定问题原因可能会涉及反复的实验运行，这会消耗宝贵的材料，并可能要花费随着细胞培养模型变得越来越复杂，与ICK测定相关的挑战也变得更加难以克服。这是免疫肿瘤学研究中亟待解决的一个问题，因为科学家们经常需要从简单的2D培养系统转向更具生理相关性的先进3D模型。例如，越来越多的肿瘤球体模型被用于揭示肿瘤微环境（TME）如何影响癌症和免疫应答之间的相互作用。5、6作为获得更多转化见解的进一步策略，许多研究人员现在正在将活检组织或嵌合抗原受体（CAR）T细胞等患者来源的材料纳入ICK模型，这可能有助于释放个体化用药的全部潜力。在这种不断扩大的转化细胞研究领域，科学家们也在不断寻求可适应一这些转化模型所涉及的复杂培养物也越来越精细。因此，它们更容易受到环境条件变化的影响，进而使其在技术上很难获得可靠的结果。但是，由于这些脆弱的培养物比细研究人员认识到需要新的ICK方法来更好地监测细胞，并提供多用途功能，以便从尽可能少的材料中提取最多的信息。对于希望满足这些要求的科学家来说，活细胞分析是活细胞分析可利用实时成像来实时捕捉活细胞的行为。将培养物保存在培养箱内的成像平台上，以在整个实验过程中实时观察生物事件和行为的动态变化。因此，科学家可以在最合适的时候持续评估培养物并安排操作及测定。这种灵活性对研究人员来说是一个关键的优势，因为他们要应对不同培养物之间的生物差异，尤其是需要最大限度地活细胞分析技术可用于测定包括2D和3D培养物在内的各））抗体或磁珠激活。更常见的是，肿瘤细胞将用可作为增殖标记物定量的核限制荧光蛋白标记，而细胞凋亡将在第二个荧光通道中用试剂来测定，例如Incucyte®Caspase3/73或AnnexinV染料。为了减轻免疫细胞凋亡对结果的影响，采用尺寸筛选过滤器设置来排除较小的效应细胞，从而减成像平台也设在培养箱中，因此在整个分析过程中细胞都不会受到干扰。这对于需要稳定环境的精细培养物来说是为了说明活细胞分析对ICK测定的价值，将Incucyte®Nuclight细胞核红色荧光蛋白标记的A549肿瘤细胞（2000绿色染料，用以测定细胞凋亡情况。在选定的孔中加入抗胞核）计数评估靶细胞的增殖情况，使用绿色对象计数对4433112334实时图像可以捕捉形态肿瘤细胞增殖和凋亡情况则可以通过图像分析进行量化。3肿瘤细胞细胞质颗粒形成后立即进行），3000A549100004003002001000图1：使用活细胞分析在简单的2D共培物模型中评估免疫细胞杀伤情况。(A)免疫细胞和肿瘤细胞间相互作用的可视化。(B)肿瘤细胞增殖和凋亡的实时定量。分析图像中的红色对象计数，以评估肿瘤细胞增殖情况，分析图对象计数，评估肿瘤细胞凋亡情况。T细胞被激活的孔分析从这些孔中获得的图像清楚地表明免疫细胞和T细胞之间的相互作用，说明了T细胞攻击后是胞质粒化和Incucyte®Caspase3/7标记的过程。除了静态图像之外，还可视频来完整地捕捉ICK过程。这些丰富的视频数据不仅便于研究人员从中收集丰富的生物信息，也可能为故障排除上述研究证明，活细胞分析的基本用途是获得肿瘤细胞增殖和凋亡的总体指标，并为显示细胞类型之间相互作用提4随着活细胞分析能力的进步，科学家们获得了新的技能来算法来定义单个细胞。因此，科学家现在可以使用细胞圈的所有细胞，而不是简单地使用红色对象计数来量化肿瘤细胞。由于肿瘤细胞用RFP标记，因此可以根据是否存在这种用于区分不同细胞类型的技能也有几个优势。首先，研究人员可以在不使用标记物的情况下就识别出效应细胞。其次，科学家可以在涉及非贴壁靶细胞的研究中优化细胞分类。这些肿瘤细胞可能看起来与免疫细胞非常相似，因此很难通过标准分析中使用的尺寸筛选法从干扰的效应细为了说明细胞圈描软件在非贴壁培养中的使用，将Incucyte®Nuclight细胞核红色荧光蛋白标记的Ramos细胞（10000个细胞/孔）与越来越多的预活化或非活化的PBMC混合，并加入Incucyte®AnnexinV绿色染料作为凋件模块内的高级图像处理算法来圈描单个细胞，然后根据是否存在红色荧光将其分为靶细胞群和效应细胞群。随着效应细胞数量的增加，靶细胞群（红色）的增殖减少，凋亡增加。相比之下，效应细胞群（非红色）随着时间的推图像分析软件的进步也让科学家得以可视化并量化免疫细胞和肿瘤细胞之间的相互作用。例如，通过对两个细胞圈描的重合或重叠进行定量，即可以评估免疫和靶细胞的相互作用。为了证明这一点，在加入Incucyte®Fabfluor-488-α-CD45和Incucyte®Opti将Incucyte®Cytolight细胞质红色荧光蛋白标记的A549肿瘤细胞（5000个细胞/孔）与预活化或未活化的PBMC（25000个细胞/孔，T:E比率为1:5）一起培养，用以标记总淋巴细胞群（图3）。加入PBMC两个小时后，使用图像处理软件圈描细胞，以便对靶细胞和效应细胞的空间信息定量。与预期一致，结果显示活化的PBMC与靶细胞5100100 00244872604040202004800480++++500244872 于红色荧光区分靶细胞（蓝色）和效应细胞（黄色）亚群。(B)根据红色和绿色荧光对亚群进行分类。(6CD45，非活化PBMCCD45，预活化PBMC覆盖面积x覆盖面积x1052/孔)06040200图3：免疫和肿瘤细胞相互作用的可视化和量化科学家可通过测定和量化细胞间的相互作用，以获得更多的形态学和空间见解，从而更好地表征ICK过程。最终，这些信息可为新型候选疗法的鉴别提供支持。例如，评估细胞相互作用的持续时间可能对药物研发项目非常有价值，因为免疫细胞和癌细胞之间接触时间的延长可能与ICK的增强式图像处理的另一个应用是使用特定于表面标记物的特异性抗体来独立评估不同的效应细胞亚型。这种亚型分析与相互作用评估结合在一起，便于科学家确定与靶细胞相互作用的免疫细胞群。因此，这种方法可以将对小部分细胞的强治疗效果及对所有细胞的较差治疗效果区分开来。由于不同效应细胞类型之间的异质性是免疫肿瘤学药物发现中的主要复杂因素，所以，这些新功能与基于整合所有越来越多的证据强调组织环境和结构在调节免疫细胞和肿瘤细胞之间的复杂关系中的重要性。因此，在体外评估癌症免疫治疗药物时，许多科学家都会使用3D多生理相关的数据。事实上，已有证据表明，3D培养的肿瘤细胞可以表现出更强的抗细胞毒性，这也更能反映出体内情况。6肿瘤球模型结合了由癌细胞构成的3D细胞聚体，可提供一种反映3DTME的有力方法，因为它们会模拟细胞间接触使用单一球状体，这是一种可以通过将肿瘤细胞接种在超低附着板中而形成的聚集体。这为可能存在缺氧核心的实为了证明单一球状体模型在评估ICK中的作用，将Incucyte®Nuclight细胞核红色荧光蛋白标记的A549肿瘤细胞接种于圆底96孔板（2500个细胞/孔）中，并在三况下共同培养。然后使用Incucyte®HD相位和荧光图像监测球体在几天内的生长状况。结果显示，在有活化PBMC的情况下，球状体的荧光强度会显著降低，而这表明肿瘤第0天+Anti-CD3/IL-2(10ng/mL)第0天30仅A54920+AntiCD3/IL-20图4：活化PBMC对肿瘤球体增殖的影响。(A)高清相瘤球体增殖的影响。在有活化PBMC时，荧光强度明显降低。(B)时间进程图显示了球状体8包含细胞外基质（ECM）成分的多球体模型为免疫肿瘤学因为它可以影响细胞间的相互作用，进而影响免疫细胞在3D结构中的渗透。在多球体模型中，生物基质会改变球体5为此类研究的示例。该分析评估了赫赛汀对Her2阳性细胞的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。将稳定表达RFP的Her2阴性MCF-7细胞（Incucyte®Nuclight细胞核红色荧光蛋白标记的MCF-7）或稳定表达细胞质绿色荧光蛋白的光蛋白标记的BT-474）接种在平底96/孔）中的Matrigel®基底上。培养三天以形成多球体，然后在有或无PBMC（5000个七天里，使用明场和荧光图像来监测球状体。结果表明，只有在Her2阳性的BT-474细胞中存在赫赛汀的情况下，荧光出现浓度依赖性丢失，而在Her2阴性的MCF-7细胞中没有出现这种现象。在加入活化T细胞群（抗CD3和Incucyte®NuclightRedMCF-7100Incucyte®CytolightGreenBT-474Incucyte®NuclightRedMCF1002/图像)60600.041502550250log[赫赛汀]μg/mL图5：赫赛汀诱导的PBMC对多球体增殖的影响。(A)七天内（Incucyte®NuclightRedMCF-7）或十天内（Incucyte®CytolightGreenBT-474）拍摄的Incucyte®明场和荧光图像显示了在无（上图）和有（下图）PBMC的情况下，赫赛汀对球体增殖的影响。明场轮廓圈描以黄色显示。(B)时间进程9为了更好地理解ICK过程，科学家们正在通过更复杂的转化模型来寻求更深入的生物学见解。到目前为止，我们提供的证据表明，活细胞分析可以很容易地用于这项研究。随着免疫学研究领域的不断发展，这项技术也有可能应用多重培养：活细胞分析可用于涉及三种或三种以上细胞类型的多重培养。鉴于越来越多的证据表明基质细胞相互作用在肿瘤发生中发挥着重要的作用，这种模型可能会被越来越多地用于免疫肿瘤学研究。9对于需要在这些复杂模型另一个关键的转化方法是将活检组织或CAR-T细胞等来源于患者的材料纳入ICK分析。同样，活细胞分析也可轻松事实上，这种