实验室质量控制规范食品微生物检测-T27405-2008解读-教学课件

实验室质量控制规范

食品微生物检测GB/T27405-2008规范的内容引言前言适用范围引用文件术语管理要求技术要求过程控制要求内部质量控制和外部质量评估附录前言发布机构：国家质检总局和国标委负责起草单位：中国合格评定国家认可中心（CNAS）起草单位：CNAS、山东出入境检验检疫局实施日期：2008年10月1日引用文件GB14925实验动物环境及设施GB15981消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB/T18202室内空气中臭氧卫生标准GB19489实验室生物安全通用标准GB50436生物安全实验室建筑技术规范SN/T1538.1培养基制备指南第1部分实验室培养基制备质量保证通则SN/T1538.2培养基制备指南第2部分培养基性能测试实用指南ISO7218食品和动物饲料微生物学—微生物检验通则ISO16140食品和动物饲料微生物学—可替代方法确认规程ISO18593食品和动物饲料微生物学—使用接触平板和棉拭子的表面取样技术水平方法EA-04/10微生物实验室认可术语实验室最高管理者在最高层指挥和控制实验室的一个人或一组人实验室管理层在实验室最高管理者领导下负责管理实验室活动的人员实验室能力实验室进行相应检测所需的物质、环境、信息资源、人员、技术和专业知识样品取自某一整体的一个或多个部分，旨在提供该整体的相关信息，通常作为判断该整体的基础术语标准方法国际、区域、国家或行业发布的，经过严格确认的、公认的方法可替代方法用来检测某一特定产品中某种目标微生物的相关标准方法等效方法阴性偏差标准方法得出阳性结果，而可替代却得出未经证实的阴性结果，如果后者被证明为阳性，这种偏离便是一个假阴性阳性偏差标准方法得出阴性结果，而可替代却得出未经证实的性阳结果，如果后者被证明为阴性，这种偏离便是一个假阳性术语标准培养物标准菌株、标准储备菌株和工作菌株的统称标准菌株至少定义到属或种水平的菌株。按其特征进行分类和描述有明确的来源标准储备菌株标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株工作菌株由标准储备菌株转接后获得的同种菌株术语判定限进行定性微生物检测时，在特定评估方法规定的实验室条件下，可以引起特定变化的微生物的最小量。检出限进行定量微生物检测时，能检测到但无法给出精确数值的微生物的最小量。特异性阴性菌株或所确认菌落数与可疑检出物的比例规范中管理要求4.1组织4.2管理体系4.3文件控制4.4质量及技术记录4.5服务客户4.6投诉处理4.7不符合工作控制4.8纠正措施4.9预防措施4.10内部审核4.11管理评审4.12持续改进2024/7/25GB/T27405-200895.1人员

5.1.1实验室应由具有一定资质的微生物学或相近专业的人员来操作或指导微生物检测。

5.1.2如果实验室检测结果报告中包含意见和解释，那么授权的签署意见和解释的人员应具有相关的工作经验和专业知识。

5.1.3实验室的管理层应保证所有人员接受胜任工作所需的设备操作、微生物检测技能和实验室生物安全等方面的培训，并有针对所有级别检测人员的继续教育计划。

5.1.4实验室应通过参加内部质量控制、能力验证或使用标准菌株等方法客观评估检测人员的能力，必要时对其进行再培训并重新评估。当使用一种非经常使用的方法或技术时，在检测前确认微生物检测人员的操作技能是十分必要的。2024/7/25GB/T27405-200810解读（关键词）：人员资质、提供条件（资源和培训）、能力评估5.2设施和环境条件

5.2.1设施

5.2.1.1实验室应具有进行微生物检测所需的适宜、充分的设施条件，包括检测设施（专用于微生物检测和相关活动）及辅助设施（大门、走廊、管理区、样品室、清洁间、储存室、文档室等）。特殊设备要在特定环境下放置和操作。

依据所检测微生物的不同等级，实验室应对授权进入工作区域的人员采取严格的限制措施，并明确告知有关人员以下内容：

a）特殊区域的特定用途；

b）特殊工作区域的限制措施；

c）采取这些限制措施的原因；

d）合理的控制水平。2024/7/25GB/T27405-200811解读（关键词）：专门设施、限制进入5.2设施和环境条件

5.2.1设施

5.2.1.2应根据具体检测活动（如检测种类和数量等），有效分割不相容的业务活动。应采取措施将交叉污染的风险降低到最小。为达到这一目标可采取以下措施：

a）实验室建设应符合GB19489的规定，符合“无回路”原则；

b）在时间或空间上有效隔离各种检测活动；

c）为确保检测样品的完整性（如使用密封容器），操作时应按照规定的程序，并采取预处理措施。2024/7/25GB/T27405-200812解读（关键词）：分区、降低交叉污染风险、“无回路”原则5.2设施和环境条件

5.2.1.3按照良好操作规范，应考虑清楚标识的隔离场地或明确制定的区域：

a）样品接收和储藏区；

b）样品前处理区（如应在被隔离的区域处理极易样重污染的粉状产品）；

c）样品的微生物检测（包括培养）和可疑致病菌的鉴定区；

d）标准菌株和其他菌株的储藏区；

e）培养基和化学试剂储藏区（培养基和化学试剂分开存放，危险品和有毒药品应设有专柜保存）；

f）培养基和器材的准备和灭菌区；

g）无菌区；h）清洁间；i）污染物处理区；j）急救区；

k）行政区；l）文档处理区；m）更衣室；n）仓库；o）休息室。

5.2.1.4在分子生物学实验室，应限定在某个工作区域使用吸管、吸管头、离心管、试管等。2024/7/25GB/T27405-200813解读（关键词）：区域标识、培养基和化学试剂分开存放，危险品和有毒药品应设有专柜保存5.2设施和环境条件

5.2.1设施

……

5.2.1.5应保证工作区洁净无尘，空间应与微生物检测需要及实验室内部整体布局相称。实验室空间应符合GB19489和GB50346的相关规定。

5.2.1.6通过自然条件或换气装置或使用空调，保持良好的通风和适当的温度。使用空调时，应根据不同工作类别检查、维护和更换合适的过滤设备。2024/7/25GB/T27405-200814解读（关键词）：

环境的洁净度空调的维护和管理5.2设备与环境条件

5.2.1设备

5.2.1.7可通过以下途径减少污染

a）表面光滑的墙、天花板、地面和桌椅（光滑程度应取决于对其清洁的难以程度）；

b）地面、墙壁、天花板连接处应有弧，地面应防滑；

c）当进行检测室，应关闭门窗；

d）遮阳板应安装到室外或方便清洁；

e）除非密闭，液体运输管路不应在工作区上方穿过；

f）换气系统中应有空气过滤装置；

g）独立的洗手池非手动控制效果更好，最好在实验室的门附近；

h）不使用粗糙裸露的木块；

i）固定设备和室内装置的木质表面应密闭包裹；

j）试验可能低度污染空气时作业区应装备一台层流生物安全柜；

k）储存设施和设备的摆放应易于清洗；

l）只将检测必需的橱柜、文件或其他物品放在实验室内。解读（关键词）：减少污染5.2设备与环境条件

5.2.1设备

5.2.1.8理想天花板应具有光滑表面并附带充足照。如果无法实现,实验室应有书面材料来证明已有效控制了任何导致污染的风险同时具备有效的防治污染措施如清洗表面和检查程序

5.2.1.9实验室工作人员应清楚潜在的容易发生污染的检测区域并证明已经采取清洁措施。解读（关键词）：减少污染5.2设备与环境条件

5.2.2环境监测

5.2.2.1实验室应制定合理的环境监测程序（见ISO18593并参见附录D）。

5.2.2.2对环境监测结果进行数据分析（见ISO18593和ISO7218）。设定不同工作区域可接受的背景菌落总数量并且有文件化的程序处理背景菌落总数超标情况。

解读（关键词）：环境监测：洁净区空气、实验台、消毒效果监测等5.2设备与环境条件

5.2.3卫生

5.2.3.1制定清洁实验室固定装置、设备、表面等的文件化程序所制定的程序应考虑环境监测结果和交叉污染发生的概率。

5.2.3.2应有有害微生物发生污染时的处理程序。

5.2.3.3采取以下措施防止房间内洁净度降低：

a）提供足够空间；

b）尽可能减少在实验室进行文件处理；

c）禁止把植物和个人物品带入实验室工作区域。

5.2.3.4根据所检测的微生物危害等级的不同在实验室内穿着相应的防护服（如果需要包括保护头发、胡须、手和鞋等防护措施）。离开工作区域时脱下防护服。这对分子生物学实验室和危害等级II级以上的实验室尤为重要。

5.2.3.5应准备足够数量的洗手设施和急救材料。

5.2.3.6无菌室在使用前后应进行消毒并定期监测无菌室的消毒效果。（参见附录B和附录D）解读（关键词）：环境监测：洁净区空气、实验台、消毒效果监测等附录B.微生物无菌室基本要求及管理B.1.无菌室的基本建设要求B.1.1根据本实验室所涉及的生物安全等级无菌室的设计和建设应符合GB50364和GB19489的相关要求。B.1.2无菌室大小应能够满足检验工作的需求。内墙为浅色，墙面和地面应光滑，墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形无缝隙，无死角，易于清洁和消毒。B.1.3无菌室入口处应设置缓冲间，缓冲间内应安装非手动式开关的洗手盆，并可有毛巾。缓冲间应有足够的面积以保证操作人员更换工作服及鞋帽。B.1.4无菌室内工作台的高度约80cm，工作台应保持水平，工作台面应无渗漏耐腐蚀易于清洁、消毒。B.1.5无菌室内光照应分布均匀，工作台面的光照度应不低于540lx。B.1.6无菌室应具备适当的通风和温度调节的条件。无菌室的推荐温度为20相对湿度为40-60%。B.1.7缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置。附录B.2微生物无菌室的管理B.2.1无菌室在使用前后应进行有效的消毒，消毒方法参见附录D。B.2.2无菌室的灭菌效果应至少每两周验证一次。B.2.3应制定清洁、消毒、灭菌、使用和应急处理程序。B.2.4应记录环境监测结果，并归档保存。B.2.5不符合规定时应立即停止使用。附录D无菌室消毒方法D.1.1紫外线消毒D.1.1.1在室温20-25时，220V30W紫外灯下方垂直位置1m处的253.7nm紫外线辐射强度应大于70uW/cm2，低于此值时应更换。适当数量的紫外灯确保平均每立方米不少于1.5W。D.1.1.2紫外线消毒时，无菌室内应保持清洁干燥。D.1.1.3在无人条件下，可采取紫外线消毒最用时间不少于30分钟，室内温度在20-40度之外、相对湿度大于60%时应适当延长照射时间。D.1.1.4用紫外线消毒物品表面时，应使照射表面受到紫外线的直接照射且应达到足够的照射剂量。D.1.1.5人员在关闭紫外灯至少30分钟方可入内作业。D.1.1.6按照GB15981的规定，评价紫外线的消毒与杀菌效果。附录D无菌室消毒方法D.1.2臭氧消毒D.1.2.1封闭无菌室内，无人条件下，采用20mg/m3浓度的臭氧，作用时间应大于30分钟。消毒后室内臭氧浓度低于0.2mg/3时方可入内作业。D.1.2.2按照GB18202的规定，检测室内臭氧浓度。5.3设备

5.3.1总则

5.3.1.1实验室应制定并实施设备维护、校准和性能验证程序（参见附录C）

5.3.1.2设备应达到规定的性能参数并符合相关检测指标。无论如何，只要发现设备故障，应立即停止使用必要时检查对以前结果的影响。

5.3.1.3每台设备均应有唯一性标识。

5.3.1.4如果设备脱离实验室直接控制或被修理，恢复使用前应对其检查或校准，以确保其性能满足要求。解读（关键词）：设备要控制5.3设备

5.3.1总则

5.3.1.5使用计算机或自动化设备收集、处理、记录、报告、存储或检索数据应确保：

a）由使用者开发的计算机软件应被制定成足够详细的文件，并对其适用性进行适当验证；

b）制定并执行相应程序以随时保护数据和记录的完整性，防止无意的或未经授权者访问、修改或破坏；

c）应维护计算机和自动化设备，以确保其正常运转，并应提供相应的环境和操作条件。

5.2.1.6为避免偶然发生的交叉污染，实验室的设备不应频繁移动解读（关键词）：涉及计算机参与的活动的控制5.3设备

5.3.2维护

5.3.2.1设备的安装和布局应便于操作，易于维护、清洁和校准5.3.2.2应定期验证和维护设备，以确保其处于良好工作状态。应根据使用频率在特定时间间隔内进行维护和性能验证，并保存相关记录。

5.3.2.3新购置的玻璃器皿用5%氢氧化钠和3%稀酸分别浸泡24小时，清洗后使用。

5.3.2.4应注意以下交叉污染：

a）一次性设备和重复使用的玻璃器皿应洁净无菌；

b）建议实验室使用专门处理污染物的高压灭菌锅；解读（关键词）：设备维护5.3设备

5.3.2维护

5.3.2.5以下设备需要清洁、维护、定期进行损坏检验，必要时进行灭菌：

a）一般设备：滤器、玻璃和塑料容器（瓶子、试管、培养皿）、取样工具、接种环或接种针等

b）测量器具：温度计、计时器、天平、酸度计、菌落计数器等；

c）定容设备：吸管、自动分液器、微量移液器等；

d）其他设备：水浴锅、培养箱、超净工作台或生物安全柜、高压灭菌锅、均质器、冷藏箱、冷冻柜等。解读（关键词）：需要维护的设备5.3设备

5.3.3校准和性能验证

5.3.3.1总则：

应制定影响检测结果的设备的校准和性能验证程序。实验室选择使用的校准服务应确保其测量可溯源至国际单位制（SI）；若测量无法溯源到SI单位或与之无关时，应能够溯源到诸如有证标准物质（参考物质）、约定的方法和协议标准等。根据设备以前的性能状况以及经验和实际需要，确定设备使用性能验证的频率。应在设备使用前，确认其性能使用后要记录。

应定期维护以保证设备处于良好的工作状态。

附录C规定了不同设备的校准、性能验证和维护方法。解读（关键词）：校准、验证、维护、溯源5.3校准和性能验证

5.3.3.2测温装置

a）温度是直接影响检测结果或设备正常运转的因素。安装在培养箱、高压灭菌锅温度计、热电偶和铂电阻温度计应进行校准。

b）测温装置监控相关设备的温度，设备使用前应验证此类装置的性能。2024/7/25GB/T27405-200828解读（关键词）：

温度是影响微生物检验结果的重要因素.

温度计需要检定或校准.5.3校准和性能验证

5.3.3.3培养箱、水浴锅和干热灭菌箱

a）首次安装使用时对温度的稳定和一致性进行校准。

b）应确定并记录设备的温度稳定性、温度分布的均匀性和达到平衡状态所需要的时间，尤其要注意使用状况（如培养皿的位置、间距、高度和层叠数量）。

c）每次维修和校准后，都应检查和记录最初确认设备时所记录的各参数的稳定性。应监测设备的运行温度，并保存记录。

d）应定期清洁和消毒内外壁。2024/7/25GB/T27405-200829解读（关键词）：培养箱、水浴锅、干热灭菌箱校准、性能验证5.3校准和性能验证

5.3.3.4高压灭菌锅（包括培养基制备仪）

a）时间和温度知识的准确度应满足使用要求，不能仅靠眼里表测定时间，应使用感应器控制和监控运转循环情况。

b）初次使用前、大型维修或调试（更换温度调节器的探测仪或程序器、调整安装位置及工作循环）或需要对培养基的质量进行控制时，应在每批物品不同位置放置足够的温度感应器（已于充满水或培养基的容器中）以显示不同位置的温度。

c）在验证过程中，应提供基于加热分布图的清晰明了的操作说明。确定接受（拒绝）的标准和使用记录，包括每个运转循环的温度时间。

d）监控措施：应用热电偶和记录仪打印输出图表、直接观察和记录最高温度及达到最高温度值的时间、化学或生物指示剂检查每个灭菌循环的运转效果。

e）应及时除锈和排水。2024/7/25GB/T27405-200830解读（关键词）：高压灭菌锅、校准、维护、性能验证5.3校准和性能验证

5.3.3.5砝码和天平

a）砝码和天平应在规定时间间隔内进行校准和检定。

b）使用中可能造成污染时，应使用非腐蚀性消毒剂进行清洁和消毒。

5.3.3.6定容设备

a）应进行初始验证，以后定期检查。已经过校准或检定证明符合使用要求的玻璃器皿不必进行初始验证。应检查移取不同体积的准确度（如在体积可变设备的几个不同设置），测定反复移取液体所得的精密度。

b）对于单用途的一次性定容设备，应要求供应商具备保证产品质量稳定可靠的质量体系，并对其稳定性进行初始验证，对其准确度进行随机抽查。必要时对每批定容设备的实用性进行核查。2024/7/25GB/T27405-200831解读（关键词）：

这些都是影响准确度的因素

5.3校准和性能验证

5.3.3.7生物安全柜

应定期对生物安全柜进行校准和性能确认，方法和频率见GB50346。2024/7/25GB/T27405-200832解读（关键词）：生物安全柜

10.3生物安全柜的现场检测（GB50346）10.3.1有下列情况之一时，应对生物安全柜进行现场检测：a）安装完毕，投入使用前；b）被移动位置；c）检修后；d）一年一度的常规检测10.3.2生物安全柜必须具有合格的出厂检测报告和安装完成后的现场检测合格并出具的检测报告。2024/7/25GB/T27405-20083310.3.3生物安全柜必检项目：项目情况执行条款备注安装位置静态9.4垂直气流速度正常运转10.3.4II级安全柜工作窗口气流流向正常运转10.3.5I、II级安全柜工作窗口气流流速正常运转10.3.6I、II级安全柜工作区洁净度正常运转10.3.7II级安全柜噪声正常运转10.3.8照度正常运转10.3.9排风高效过滤器检漏检测状态10.3.10接触电流正常运转10.3.11接地电阻正常运转10.3.122024/7/25GB/T27405-20083410.3生物安全柜的现场检测（GB50346）10.3.4生物安全柜垂直气流平均风速检测

方法：在高效过滤器以下0.15m处的截面上，采用风速仪均匀布点测量截面风速。测点间距不大于0.15m，每列至少3点，每行至少5点。评价标准：平均风速不低于0.25m/s，与生产厂家给定值不大于±0.025m/s，且单点风速与平均风速之差不大于±20%。2024/7/25GB/T27405-20083510.3生物安全柜的现场检测（GB50346）10.3.5生物安全柜工作窗口的气流流向检测

方法：采用发烟法或丝线法在工作窗口断面检测，检测位置包括工作窗口的四周边缘和中间区域。评价标准：工作窗口断面所有位置的气流均向内。2024/7/25GB/T27405-20083610.3生物安全柜的现场检测（GB50346）10.3.6生物安全柜工作窗口气流流速检测

方法：采用风速计测量工作窗口断面风速。测点间距不大于0.01m，每列至少2点，每行至少5点。评价标准：其断面上的风速均不低于产品标准要求。2024/7/25GB/T27405-20083710.3生物安全柜的现场检测

（GB50346）10.3.7生物安全柜工作区洁净度检测

方法：采用尘埃粒子计数器在工作区检测。计数器的采样口置于工作台面上20cm高度位置，其测量点服从行、列均为20cm网格分布。每列至少3点，每行至少5点。评价标准：工作区洁净度应达到5级（100级）。2024/7/25GB/T27405-20083810.3生物安全柜的现场检测

（GB50346）10.3.8生物安全柜噪声检测

方法：生物安全柜前面板水平中心向外300mm，且高于工作太380mm处用声级计测量噪声。评价标准：噪声不得高于产品标准要求。2024/7/25GB/T27405-20083910.3生物安全柜的现场检测

（GB50346）10.3.9生物安全柜照度检测方法：沿工作台面长度方向中心线每隔30cm设置一个测量点。与边墙距离＜15cm时，不再设置。评价标准：平均照度不低于产品标准要求。10.3.10生物安全柜箱体漏泄检测密封并加压到500Pa的压力下用皂泡检漏。可以检出小的泄漏点。大的泄漏点会产生细微的空气流动声。2024/7/25GB/T27405-20084010.3生物安全柜的现场检测（GB50346）10.3.8生物安全柜工作窗口气流流速检测

方法：采用风速计测量工作窗口断面风速。测点间距不大于0.01m，每列至少2点，每行至少5点。评价标准：其断面上的风速均不低于产品标准要求。2024/7/25GB/T27405-2008415.3校准和性能验证

5.3.3.8其他设备

a）应定期或在使用前验证传导计、氧气表、pH计和其他类似设备的性能。在适当调节爱你想储存验证用的缓冲液，并且标记有效期。

b）如果适度对于检测结果很重要，则应对湿度计进行校准。

c）若所测量时间对检测结果有影响，应使用经过校准的定时器或计时器。

d）若检测过程中使用离心机，应评估离心力的危险程度，如果离心机是关键的，则需要校准。2024/7/25GB/T27405-200842解读（关键词）：

检定:强检设备如天平、pH计、温度计、压力表等校准：根据检验需要，对影响检验结果准确性的应进行设备校准要求和频率（ISO7218和EA-04/10）设备类型要求推荐频率参考玻璃温度计校准五年一次单点核查一年一次参考热电偶校准三年一次用参考温度计核查一年一次工作温度计零点和工作温度范围核查一年一次工作热电偶零点和工作温度范围核查一年一次天平校准一年一次校准砝码校准五年一次核查砝码校准砝码和校准天平核查一年一次设备校准要求和频率（ISO7218和EA-04/10）设备类型要求推荐频率玻璃定容器具重量法校准值所需公差一年一次显微镜测微器校准初次使用时湿度计校准一年一次离心机校准一年一次压力表校准一年一次设备的性能验证设备类型要求推荐频率温控设备（培养箱、水浴锅、冰箱等）确定温度的稳定和均匀性初次使用前，此后两年一次和维修后监测温度每个工作日一次或每次使用前干热灭菌器确定温度的稳定和均匀性初次使用前，此后两年一次和维修后监测温度每次使用前设备的性能验证设备类型要求推荐频率高压灭菌器确定运转特性初次使用前，此后两年一次和维修后监测温度和时间每一次使用前生物安全柜确定性能初次使用前，此后一年一次和维修后微生物监测每两周气流监测每次使用前设备的性能验证设备类型要求推荐频率超净工作台确定性能初次使用前，每次维修后琼脂平板检测每两周定时器核查每年一次显微镜检查调准装置每工作日一次或每次使用前pH计至少两种缓冲液调整每工作日一次或每次使用前设备的性能验证设备类型要求推荐频率天平清零并砝码核查每工作日一次或每次使用前去离子器和反渗透装置检查传导率每周一次检查微生物污染每月一次重量稀释机检查所分配部分的重量每工作日一次检查稀释比例每工作日一次设备的性能验证设备类型要求推荐频率培养基分装器检查所分配的量初次使用前，每次调整或替换时移液器（管）准确性和精密度有规律地（使用频率）螺旋菌接种仪确定其性能初次使用前，此后每年一次检测针突状况以及始端和终端每工作日一次或每次使用前检查所分配的量每月一次设备的性能验证设备类型要求推荐频率菌落计数器对照手动计数器核查每年一次离心机旋速计核查每年一次厌氧罐（箱）厌氧指示剂确认每次使用时无菌室使用采样器、沉降平板、接触盘或棉拭子方法监测微生物污染每两周一次设备的性能验证设备类型要求推荐频率培养箱、冰箱、冻干机、干热灭菌器清洁和消毒内表面每月一次水浴锅倒空、清洁、消毒、再注水每月一次，使用消毒剂是每6月一次离心机检修每两周一次清洁和消毒每次使用前生物安全柜全面检修和机械检查每年一次或生产商推荐设备的性能验证设备类型要求推荐频率高压灭菌器检查衬垫、清洁和排空内室生产商推荐全面检修每年一次或生产商推荐压力容器的安全检查每年显微镜全面维修保养每年一次pH计清洁电极每次使用前设备的性能验证设备类型要求推荐频率天平、重量稀释机清洁每次使用前检修每年一次蒸馏锅清洁和除垢必要时（如3月一次）去离子机和反渗透装置更换柱体或滤膜生产商推荐厌氧罐清洁和消毒每次使用后培养基分装器、定容设备、移液器必要时去污染、清洁和灭菌每次使用前设备的性能验证设备类型要求推荐频率螺旋菌落接种仪检修每年一次去污染、清洁和灭菌每次使用前实验室清洁和消毒工作区表面每个工作日一次或使用期间清洁地板、消毒洗涤槽每周一次清洁和消毒其他表面每三月一次5.4试剂和培养基

5.4.1试剂

5.4.1.1应有对试剂进行检查、接受（拒收）和储存的程序，确保所有试剂质量符合相关检测需要。应使用有证的国家或国际质控微生物（标准微生物），在初次使用和保存期限内验证并记录每一批对检测其决定作用的试剂的适用性，不得使用未达到相关标准的试剂。

5.4.1.2应对试剂进行管理控制，包括全部相关试剂、质控材料以及校准品的批号、实验室接受日期以及这些材料投入使用的日期。

5.4.1.3化学药品和培养基应分类存放，其中无机物可按酸、碱、盐分区存放。2024/7/25GB/T27405-200855解读（关键词）：

试剂的验收试剂的存放，分区存放5.4校准和性能验证

5.4.2实验室制备培养基

5.4.2.1实验室培养基制备和使用等应按照SN/T1538.1的要求执行。

5.4.2.2应检查自制培养基，稀释剂和其他悬浮液的适用性检查方式如下，按SN/T1538.2的定量程序评估目标微生物在培养基的复苏或存活力。

a）目标微生物的复苏或存活力的保持；

b）对非目标微生物的控制；

c）生化（分离的和鉴定的）性质；

d）理化性质（例如pH、体积）。

5.4.2.3原料（包括商业脱水配料和单独配方组分）应在适当的条件下储存，如低温、干燥、避光。所有的容器应密封，尤其盛放脱水培养基的容器。不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。

5.4.2.4要确定和验证已制备的培养基在适当的储存条件下的保存期限。

5.4.2.5除非方法有特殊要求，培养基、试剂及稀释剂配制用水应经蒸馏、去离子或反渗透处理并无菌、无干扰剂和抑制剂，配制用水应满足下列参数：

a）电阻率在25℃时，应≥300000Ω•cm，建议每检测一次；

b）重金属（镉、铬、铜、镍、铅等）＜0.05mg/L，重金属总量＜10mg/L，建议每年检测一次。2024/7/25GB/T27405-200856解读（关键词）：SN/T1538.15.4校准和性能验证

5.4.3即用型培养基

5.4.3.1在使用前需验证所有即用型或部分完成的培养基（包括稀释剂和其他悬浮液），应充分定量评估其对目标微生物的复苏或存活力以及对非目标微生物抑制性能，应使用客观的标准对其品质（如感官和生化性质）进行评估。

5.4.2.2作为培养基验证的一部分，应充分了解制造商所提供的产品之说明书，其中至少应包括：

a）培养基的名称和组成成分，包括所有添加剂；

b）保存期限和验收标准；

c）储存条件；

d）产品特性（级别）；

e）无菌检查；

f）目标和非目标对照微生物的生长状态的检查以及验收标准；

g）感官检测和验收标准；

h）说明书上的生产日期。

5.4.2.3应验证每一批培养基，确保所接收的每批培养基满足质量要求。2024/7/25GB/T27405-200857解读（关键词）：培养基验证D.2培养基和试剂消毒处理方法D.2.1培养基通常采用高压湿热灭菌法121℃灭菌15分钟，特殊培养基按使用者的特殊要求进行灭菌（如含糖培养基115℃灭菌20分钟）。D.2.2部分培养基（如嗜盐琼脂培养基、胆硫乳培养基），只能煮沸灭菌。D.2.3对热敏感的培养基或添加物质，应采用膜过滤方法进行过滤除菌。D.2.4即用型试剂不需灭菌，应参见相关国际标准或供应商使用说明，直接使用。D.3器具和设备消毒处理方法D.3.1湿热灭菌：采用高压灭菌器，121℃灭菌20分钟，适用于玻璃器皿、移液器吸头、塑料瓶等。按照GB15981的规定，评价高压灭菌器的杀菌效果。D.3.2干热灭菌：采用干燥箱灭菌，160℃灭菌2h，180℃灭菌2h，适用于玻璃器皿，不锈钢器具等。D.3.4液体消毒剂消毒：使用适当浓度的自配或商业液体消毒剂（参见表1）对工作台面、器具或设备表面进行消毒。可按照GB15981的规定，评价自配或商业消毒剂的消毒效：可按照ISO18593检测工作台面、器具或设备表面的消毒效果。D.4实验室废弃物消毒处理方法D.4.1对于培养物及其污染的物品（如斜面、api20E测试条、api20NE测试条、生物鉴定管、血清学鉴定用载玻片、mini-VIDAS测试条、用过的移液器吸头、细菌培养皿、注射器等），应使用适当浓度的自配或商业液体消毒剂（见表1）对处理后一定时间或121℃高压灭菌至少30分钟，或者其他有效处置措施，将处理物倒入特殊标识的垃圾袋内直接送到指定地点。D.4.2对于实验室动物尸体及相关废弃物，按照GB14925的规定进行处理。D.4.3记录并保留废弃物和实验动物尸体处理的记录。表1某些消毒剂的特性（ISO7218）抗活性毒性皮肤眼睛肺次氯酸盐a+++乙醇b+甲醛a+++戊二醛a+++++++++碘载体a++-a:真菌、细菌、分枝杆菌、孢子、亲脂病毒b:细菌、分枝杆菌、孢子5.4.标识

应标明所有试剂（包括储存液）、培养基、稀释剂和其他悬浮液名称，可行时应标明适用性、特性、浓度、储存条件、配置日期、有效期或推荐保存期限。负责微生物检测准备的试验人员可以通过记录加以识别。

5.5标准物质和标准培养物

5.5.1标准物质

5.5.1标准物质和有证标准物质提供了测量中基本的可溯源性，其可用来：

a）证明结果的准确性；

b）校准设备；

c）监测实验室运转；

d）验证试验方法；

e）比较试验方法。2024/7/25GB/T27405-200862解读（关键词）：标识

标准物质（诊断血清等）5.5标准物质和标准培养物

5.5.2标准培养物

5.5.2.1实验室应制定并实施特定程序管理和使用标准培养物。

5.5.2.2实验室应通过标准培养物来验收培养基（包括试剂盒）、验证方法和评估实验操作。实验室可使用来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株，确定试剂盒的性能和验证方法，并证实其可追溯性（见SN/T1538.2）。

5.5.2.3将标准菌株传代培养一次，制得标准储备菌株，应同时进行确认试验（纯度和生化检查）。建议使用深度冰冻或冻干的方法制备标准储备菌株。标准储备菌株经继代培养获得日常微生物检测所需要的工作菌株（见附录A）。一旦标准储备菌株被解冻，最好不要重新冷冻和再次使用。

5.5.2.4所有标准培养物从储备菌株传代培养次数不得超过5次，除非标准方法中要求并规定或实验室能够提供文件化证据证明其相关特性没有改变。

5.5.2.5工作菌株不可代替标准菌株。标准菌株的商业派生菌株仅可用作工作菌株。

5.5.2.6标准菌株如已老化、退化或变异、污染等，经确认试验不符合的或该菌种已无使用需要的，应及时销毁。2024/7/25GB/T27405-200863解读（关键词）标准菌株、标准储备菌株、工作菌株附录D.1.3无菌室空气灭菌效果验证方法（沉降法）1.在消毒处理后与开展检验活动之前期间采样。2.取样位点的选择应基于人员流量情况和做试验的频率。

30m2以下从所设定的一条对角线上选取3个点（中心1点两端各距墙1m处各取1点）

30m2以上东南西北中5点，东南西北各距墙1m处）3.琼脂平板或菌落总数测试片置于选点上距地面80cm处，开盖暴露15min。4.36±

1℃,培养48±

1小时。5.确认菌落总数。如大于设定的风险值。应分析原因并采取适当措施。净化工作台的控制水平流净化工作台工作区域，要求洁净度为100级。空气沉降30min，细菌数＜1个/皿。垂直流净化工作台，细菌数＜0.49个/皿.净化工作台运行检查频次：1次/月主要是细菌沉降检测。净化工作台高效过滤膜一般为一年更换一次，并同时进行粒子与细菌沉降检测。2024/7/2565GB/T27405-2008紫外线灯的控制检测方法：仪器测试法和生物测试法。前者是通过专用仪器检测紫外灯管发射的紫外光强度。国家消毒技术规范中表明在距离照射无1米处，要求其强度为90。生物测试法：采用一定的菌培养物，经一定比例稀释，菌量控制在200-250个/0.5ml，涂布平板在紫外灯光下照射，2min，同时设置普通光源的对照组，后置37℃48h，计算其杀灭率。要求杀灭率达99%。2024/7/2566GB/T27405-2008规范中过程控制要求6.1合同评审6.2分包6.3检测方法的确认和验证6.3.1满足客户要求6.3.2对非标方法、实验室制定的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改的标准方法进行确认。6.3.2.1定性微生物检测方法，确认其特异性、阳性偏差、阴性偏差、判定限、培养基影响、重复性和再现性6.3.2.2定量微生物检测方法，确认其特异性、灵敏度、阳性偏差、阴性偏差、重复性和再现性以及规定的可变范围内的判定限。在检测不同种类样品时，应考虑不同培养基的差异。应使用适当的统计方法评估检测结果。6.3.3实验室应保留制造者或第三方机构提供的所用商业检测系统（试剂盒）的确认数据。这些数据应为合作试验获得的。如果没有或不完全适用，实验室有责任完成所用商业检测系统的确认2024/7/25GB/T27405-200867规范中过程控制要求6.4测量不确定度6.4.1检测实验室应具有并应用评定测量不确定度的程序。应识别和证实不确定度分量处于控制之中，并评估处它们对结果的影响程度。6.4.2了解待检微生物的分布情况，分样时予以考虑。但建议不把不确定度包括在内，除非委托人有这方面要求。6.4.3不确定度概念不能直接用于定性检测结果。但应识别并证明个别的可变因素（如试剂的浓度）处于控制之中。对于判定限是一个重要的适用性指标的检测而言，应慎重评估有关接种量的不确定度极其重要性。应意识到定性试验中出现的假阴性和假阳性结果。2024/7/25GB/T27405-200868规范中过程控制要求6.5取样6.5.1保证质量。6.5.2保持完整性，保证运输和储存条件。6.5.3无菌取样。检测和记录取样地点的环境状况（如空气污染、温度等）。6.6样品的处置和确认6.6.7没有特殊要求的，实验室一般不保留样品。6.6.8有严重污染的样品，去污染后再废弃。6.7污染废物的处理6.8检测报告2024/7/25GB/T27405-2008697.内部质量控制和外部质量控制7.1内部质量控制7.1.1内部质控是实验室对其所承担工作进行连续评估的所有程序组成。7.1.2制定周期检查程序以证实检测的可变性在控制范围之下。控制方法举例：使用添加已知水平的标准培养物的样品使用标准物质平行实验检测结果的平行评估很少进行的项目，与检测同时进行的验证程序更为适合7.2外部质量控制7.2.1尽可能参加实验室间比对7.2.2比对可以评定结果偏差，也可以检查质量管理体系的有效性内部质量控制评估食品和动物饲料微生物学.微生物计数的水平法.30℃时的菌落计数技术.(ISO4833:2003)重复性极限:相同方法,同一试验材料,在相同条件下和短暂的时间间隔,所测得的两个独立结果之差的绝对值不能大于重复性极限(r=0.25)举例:结果1:105,另一结果的范围为log104.75-log105.25=56000-178000再现性极限:相同方法,同一试验材料,在不同条件下所测得的两个测试结果之差的绝对值不能大于重复性极限(r=0.45)举例:结果1:105,另一结果的范围为log104.55-log105.45=36000-280000培养基的质量控制

SN/T1538.1培养基制备指南第1部分实验室培养基制备质量保证通则

SN/T1538.2培养基制备指南第2部分培养基性能测试实用指南4.3培养基的制备（SN/T1538.1）4.3.1概述商品化培养基应按厂商提供的说明使用。包括质量/体积、pH、制备条件、灭菌条件和操作步骤等。使用个别成分配制时，应记录其特性（如代号和批号等）4.3.2水蒸馏水或相同质量的水，如果是氯消毒水，蒸馏前应对氯进行中和（GB/T6682）。盛放水的容器在初次使用前要确认不含有任何抑制因子，最好是中性材料制成的（如中性玻璃、聚乙烯等）。水的电阻率最少应达300000m最好不适用离子交换器（去离子）生产的去离子水。因为这种水微生物含量较高，过滤灭菌后，仍可带有细菌生长抑制因子。4.3培养基的制备（SN/T1538.1）4.3.3称量和复水称量时注意培养基粉末，必要时佩戴口罩或在通风橱中操作。先加少量水，充分混匀（避免结块），然后再加水之所需要的量。4.3.4溶解和分类脱水培养基，加水后适当加热不停搅拌使其快速溶解琼脂培养基加热前应浸泡几分钟。含个别成分培养基，应将不同成分分别加入适量水中，并充分溶解后再加至所需要的量。4.3培养基的制备（SN/T1538.1）4.3.5pH的测定和调整用pH计测pH。自制培养基灭菌后冷却到25℃，pH的变化不应超过0.2个单位。使用40g/L氢氧化钠和36.5g/L的盐酸调整pH

商品化培养基用优质蒸馏水或去离子水配制时，灭菌前无需调节pH值。4.3.6分装容器体积可为培养基的1、2、3倍。4.3培养基的制备（SN/T1538.1）4.3.7灭菌4.3.7.1概述应采用湿热和过滤灭菌。亮绿等特定培养基中含有对光和热敏感的物质只能煮沸灭菌。煮沸后应迅速冷却，避光保存明胶、血清、糖类等不耐热高温物质，应采用高压锅低温灭菌法/间歇灭菌法灭菌。有些试剂不需要灭菌，可直接使用。4.3培养基的制备（SN/T1538.1）4.3.7灭菌4.3.7.2湿热灭菌高压锅或制备培养基中进行高压湿热灭菌一般采用121℃灭菌15分钟。当体积超过1000mL时（容易导致过度加热），对灭菌条件进行适当调整，但应按照标准或使用说明的规定进行。灭菌过程应有效果监测（特定位置的热电偶或测试条）加热后采用适当的冷却方法，防止加热过度，对肠道菌培养基和大容器中的培养基十分重要。4.3培养基的制备（SN/T1538.1）4.3.7灭菌4.3.7.3过滤灭菌可在真空负压或正压的条件下进行。滤膜或滤垫孔径0.22um。滤膜或滤垫使用前应灭菌。滤器于121℃灭菌15分钟，灭菌后在无菌条件下组装。注意滤膜上附着有蛋白质（如抗生素）。使用时先将滤膜用无菌水润湿。4.3.7.4监测pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行监测4.3培养基的制备（SN/T1538.1）4.3.8添加成分的制备制备含有有毒物质的添加成分（尤其是抗生素）时应小心操作（必要时在通风橱中操作）。按说明书操作，注意有效期。抗生素工作溶液应现用现配。批量配制抗生素溶液分装后冷冻储存，解冻后不能再次冷冻使用。厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的有关资料，也可由使用者自行测定。4.4培养基的使用（SN/T1538.1）4.4.1琼脂培养基的融化经过高压的培养基应尽量减少重加热时间47+2℃恒温水浴锅保温，放置时间不超过4小时。4.4.2培养基的脱气必要时，沸水浴加热15分钟后（松开盖子），迅速冷却。4.4.3添加成分的加入注意避免过冷或过热4.4培养基的使用（SN/T1538.1）4.4.4平板的制备和储存平皿形成2mm厚的琼脂层。培养中，培养基损失量大于总量15%时，会影响微生物的生长。培养过程中培养基水分损失的因素如培养基成分、培养基总量、培养箱类型（如带风扇、湿度偏低、位置靠近加热管、培养温度过高等）凝固后的培养基应立即使用或存放与暗处和（或）在4-12℃冰箱的密封袋中，最多存放一周，或按照厂商提供的标准执行。平板应冷却后装入密闭袋中，储存前不要进行表面干燥处理。在平板底部做好标识（包括名称、制备日期和有效期）。也可使用适宜的培养基编码系统。表面接种的固体培养基可进行表面干燥，但注意不要过分干燥。4.4培养基的使用（SN/T1538.1）4.4.5培养培养时最多堆放6个平板（使用厌氧罐除外）平板间留空隙。液体培养基温度与培养箱温度一致取决于体积、容器类型、培养类型等4.5培养基的弃置符合法律法规及规范要求。5培养基的质量控制（SN/T1538.1）5.1物理指标控制pH值（20-25℃）加入培养基的量、琼脂层的厚度。色泽透明度和是否存在肉眼可见杂质凝胶稳定性、粘稠度和湿度5培养基的质量控制（SN/T1538.1）5.2微生物指标控制5.2.1污染的控制每批抽样进行污染测试。5.2.2测试菌株来源：标准菌种保藏中心或自己分离的具有良好特性的菌株，最好使用食品中分离的菌株。新复苏的菌株可能会有非特异性反应。记录标注菌株的特性。每种培养基的测试菌株应包括据典型反应特性的强阳性菌株微弱生长的阳性菌株（对培养基中选择性试剂敏感性强）非特异性菌株，如产生不同发酵和荧光反应的菌株阴性菌株5培养基的质量控制（SN/T1538.1）5.2微生物指标控制5.2.3即用型培养基和试剂指以即用形式置于容器内（如平皿、试管或其他容器）供应的培养基生产企业提供商品化的即用型培养基ISO9001体系认证或满足相应质量要求，使用者在保证储存条件的前提下，不必进行培养基测试工作。5.2.4商品化合成脱水培养基制备的培养基每批除用标准菌株测试，还应用实际样品进行测试。不含指示剂或选择剂的，只需用阳性菌株进行检测含指示剂或选择剂的应使用能证明其指示或选择作用的菌株进行试验复合培养基（加入添加成分）的培养基需要用5.2.2性能的菌株逐批进行验证。实验室制备的具有添加成分的即用型培养基基本条款同样适用。5培养基的质量控制（SN/T1538.1）5.2微生物指标控制5.2.5个别成分制备的培养基按照5.2.4条款进行测试另用Miles&Misra技术、螺旋平板技术或菌落总数技术进行测试。附录B质控菌种的保藏和使用（SN/T1538.1）B.1概述（冻干法、液氮法、-70℃玻璃珠保存法）标准菌株标准储备菌株工作菌株由标准储备菌株经过一次传代得到的菌株标准菌株在实验室经过一次传代获得的一组相同的菌株从标准菌株保藏中心获得的真空保存的菌株。或至少定义导属或种水平，来源已知，性能稳定附录B质控菌种的保藏和使用（SN/T1538.1）B.2商业途径获得的标准菌株以原始包装形式进行保藏、复苏和使用。B.3实验室制备的标准菌株的保藏标准储备菌株制备被多份保存超低温或冻干测试菌株在每种培养基的生长特性应文件化。

B.4工作菌株转接时避免交叉污染和菌株退化。应将参考原株转接到多份非选择培养基中培养得到稳定期的菌株。工作菌株不能再传代。但工作菌株处理或储存得当如不存在交叉污染或在一周内不退化，则可多次使用。附录B质控菌种的保藏和使用（SN/T1538.1）B.2商业途径获得的标准菌株以原始包装形式进行保藏、复苏和使用。B.3实验室制备的标准菌株的保藏标准储备菌株制备被多份保存超低温或冻干测试菌株在每种培养基的生长特性应文件化。

B.4工作菌株转接时避免交叉污染和菌株退化。应将参考原株转接到多份非选择培养基中培养得到稳定期的菌株。工作菌株不能再传代。但工作菌株处理或储存得当如不存在交叉污染或在一周内不退化，则可多次使用。附录C培养基质量保证—常见问题解答（SN/T1538.1）异常现象可能原因培养基不能凝固制备过程中过度加热低pH值造成培养基酸解称量不正确琼脂未完成溶解培养基成分未充分混匀附录C培养基质量保证—常见问题解答（SN/T1538.1）异常现象可能原因pH值不正确制备过程中过度加