基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现课件

Microarray-baseddiscoveryofhighlyexpressedolfactorymucosalgenes:potentialrolesinthevariousfunctionsoftheolfactorysystem

基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现：在嗅觉系统多功能作用中扮演的潜在角色基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现实验目的：获得在嗅黏膜中组织特异性基因表达的全局观。Why？

OM呼吸道与神经系统的交界处，执行使两个器官系统连为一体的功能，是脊椎动物成体中神经发生和神经再生的主要位点。嗅觉器官的感觉神经元负责气味转换，呼入的空气中有毒媒介能够被鼻呼吸道和嗅觉组织中的黏膜纤毛结构和代谢酶清除。OM相对于其它神经组织的独特之处在于：OM有一个基底细胞群，能够不断地提供新的神经元，使因受伤或毒气损伤而丢失的神经元得以替换。基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现

MATERIALSANDMETHODS

SECTION1基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现MATERIALSANDMETHODS：1、Animals,tissuesamples,andRNApreparation2、Fluorescentprobepreparationandmicroarrayhybridization3、Dateanalyses4、confirmatorytest

5、Identificationofcis-elementsincoordinatelyexpressedgenes基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现组织来源：

成鼠的嗅黏膜（OM）、嗅球（olfactorybulb）、鼻呼吸道黏膜（nasalrespiratorymucosa）组织取自6-8周龄的C57BL/6雌性小鼠。Theethmoidturbinatesandcaudalone-thirdofthenasalseptumservedasthesourceofOMRNA,andthenasoturbinates,maxillo-turbinates,andanteriortwo-thirdsofthenasalseptumwerethesourceofrespiratorymucosalRNA.Othertissuesincludingmulti-plebrainsubregions,dorsalrootganglion,heart,lung,kidney,liver,reproductiveandendocrineorgans,immuneorgans,muscle,andskinarefromageneralizedmousegeneexpressiondatabase.RNA提取：用CO2吸入法处死小鼠解剖小鼠，迅速取出组织，液氮速冻将取自八只小鼠的组织在冰上匀浆TRIReagent提取总RNA总RNA用酒精、醋酸钠沉淀总RNA在DEPC水中溶解基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现ProbepreparationandmicroarrayhybridizationwereperformedbyIncyteGenomics(PaloAlto,CA)usingtheGEMBrightrandomprimerreversetranscriptionlabelingkit(IncyteGenomics).LabeledcDNAwaspreparedfromeachpoly(A)+RNAsampleusingnucle-otideslabeledwiththefluorescentdyeCy5.LabeledcDNAswerethensubjectedtocompetitivehybridizationtomouseGEM1microarrays,composedofspottedcDNAscorrespondingto8,638sequence-verifiedIMAGEexpressedsequencetag(EST)clones(500–5,000nucleotidesinlength)withalowredundancyratewithrespecttotheircorrespondinggeneproducts.Forallsamplesinthedatabase,hybridizationswereperformedincompetitionwithCy3-labeledmRNAfromwholepostnatalday1(P1)mouse.基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现ForeachmRNAsample,duplicatearrayswerehybridized.Additionaldye-flipcontrolexperimentsindicatedalowdyeeffect,particularlycomparedwithotherCy3/Cy5labelingmethods(datanotshown).Dyeeffectwas,however,subtractedfromrelativesample-specificgeneexpressionbasedonpergenemediannormalizationacrossalargenumberofsamples.FluorescenceintensityanalysesandbackgroundsubtractionwereperformedusinganAxonInstrumentsscannerandGenePixsoftware.基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现数据的预处理：数据分析、点几何学和背景荧光用IncyteGEMTools软件处理。1、芯片上有缺陷的点（不规则的几何形状、有刮痕、点的面积小于平均面积的40%）在数据集中被删除；2、数据的对数转化：所有数据集用Cy5测量通道中值除去Cy3测量通道中值进行平衡系数归一化；3、每张芯片包含192个对照基因，包括非哺乳动物单个基因和大多数细胞类型中表达的基因构成的复杂靶标。4、每个实验中mRNA样品用增加数量的非哺乳动物RNA（2-fold、4-fold、16-fold，etc）进行放大从而允许对从每张芯片中获得的动态范围进行评估。基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现第二阶段的数据分析用Gene-spring软件处理。1、基因的归一化处理：①Cy5对数值/Cy3对数值②用LOWESS方法进行局部加权归一化处理③一系列探针中每个基因的归一化每个测量值/全部测量值中值>=0.01每个基因在每个样本中的测量值/该基因在全部样本中的测量中值>=0.012、找出在MO中高表达的基因基因表达量与在数据库中所有其它组织中的表达中值之比>=1.7269个基因3、用分层树聚类方法对269个基因进行分类基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现对芯片数据的实验验证&组织原位杂交

选取在MO中高表达的基因进行分析定位

(Sgpl1、Cyp2f2、Dmbt1、Ltf）&免疫组织化学

抗血清、二抗的制备、组织切片&Sgpl1蛋白活性测定

材料：maleLong-Evansrats方法：用sphinganine-1-phos-phate测定活力基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现共表达基因顺式作用元件的确定&geneontology&选取三个亚分类(每个亚分类选取三个基因）进行分析&通过数据库获得选定的基因在人和小鼠中的全序列分析&序列比对找出保守的顺式作用元件&通过TRANSFACTDatebase和DNA-bindingsiteprofiles定位作用元件位点&找出选定基因的相同顺式作用元件位点基因分类基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现SECTION2RESULTS基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现

RESULTS1、IdentificationofgeneshighlyexpressedinadultOM.

成熟OM组织中高表达基因的鉴定2、Sgpl1activitymeasurements.

Sgpl1基因活力的测定3、Insituhybridizationandimmunohistochemistrystudies.

原位杂交和免疫组化学分析4、Functionalclassificationofgeneshighlyexpressedintheadultmouseolfactorysystem.

成熟OM系统中高表达基因的功能分类5、Genediscoveryintheolfactorysystem.

嗅觉系统基因的发现6、Commoncis-elementsincoordinatelyexpressedgenes.

共表达基因共同顺式作用元件的鉴出基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现GENEEXPRESSIONINOLFACTORYMUCOSAPEARSONcorrelation269/8734(1.7-foldhigher)ROW：geneCOLUMN:tissueRED:upregulatedBLUE:downregulated→temporallyandspatiallyrestrictedexpression基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现MaleLong-EvansratsNormalizedexpressionPvalue(UC-CHMCCgeneexpressiondatabase)Activity(VanVeldhovenPP.Sphingosine-1-phosphatelyase.MethodsEnzymol311:244–254,2000)→activityofSgpl1inOMwasindeedhigh基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现TheBowman’sglandstheepithelialsurfaceofthedorsalseptum&theturbinatesliningthedorsalmedialairwaysductandacinarcellsofBowman’sglandsapicalcytoplasmofsustentacularcellsantisenceCyp2f2anti-Cyp2f2antibody基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现***olfactoryepitheliallayer(olfactorysensoryneurons)subepithelialcompartmentsustentacular(supporting)cells***negativenegativeantisenseSgpl1senseSgpl1基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现perinuclearlayerofmatureolfactorysensoryneurons***olfactoryepithelialcompartmentsubepithelialstructuresanti-Sgpl1antibodyantisenseAlms1基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现lateralnasal

glandolfactoryepithelium(oftendisplayinghigh

expressionatthejunctionsofOMandrespiratory

mucosa)antisenceDmbt1antisencePlunc基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现*upstream3-kbregion*TraFaCserver基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现discussionsection3基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现特色一、充分运用了各种数据库资源NCBI、ENSEMBLUC-CHMCCEST→全基因序列SwissProt、Geneontology基因功能注释功能分类BlastNTransfact序列比对结构域确定顺式作用元件确定基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现特色二、就OM组织解剖学与生理学对其基因表达模式进行了细致分析1.OM中神经细胞直接与外界接触→高表达与解毒代谢相关的基因（与LungandLiver比较得出）2.OM有神经细胞再生功能→高表达与神经再生与神经发育的基因芯片杂交结果显示：OM、胚胎、出生一天小鼠脑都高表达一些与神经分化、迁