猫泛白细胞减少症检疫技术规范

猫泛白细胞减少症检疫技术规范本标准规定了猫泛白细胞减少症的病毒分离鉴定、琼脂免疫扩散试验(AGID)、聚合酶链式反应(PCR)诊断技术。本标准适用于猫科动物描泛白细胞减少症的检疫、监测及流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件。仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语3.2CRFK:CrandelFelineKidneyCells,猫肾传代3.4AGID:Agarimmunodifjision,琼脂免疫扩散实验。4临床诊断4.1临床症状FPV侵入猫体后，生病初期经2d-9d,平均4d,患猫就突然发病。根据临诊表现可分为最急性、急性、亚急性和隐性4个类最争性型的病猫突然死亡，见不到症状。急性型表现非典型症状，常在24h内死亡，往往被误流乃动猫多呈急性发病。临床常见该病主要为亚急性型，表现典型本病临床症状，体温高达40T以工，均24h降至常温，再经2d-3d重新上升。随着第2次发热，患猫频繁呕吐，初为无色黏液，后为含泡泳的黄绿包黏液，患猫水样腹泻，严重的粪中带血。由于呕吐和腹泻，迅速脱水。患猫精神沉郁、衰弱、伏卧，头搁于两前肢之间，被毛粗乱，第三眼睑突出。6个月以上的猫大多呈亚急性临床。妊娠母猫感染后可发生胚胎吸收、死胎、流产、早产或产出小脑发育不全的畸形胎儿，出生的仔猫表现共济失调等症状。其他参见附录A。4.2病理变化主要可见为胃肠道空虚，整个胃肠道黏膜有不同程度的充血、水肿以及被黏波纤维素渗出物所覆盖，其中以空肠的病变更为突出，肠壁常呈乳胶管状。肠腔内有灰红色或黄绿色纤维素性、坏死性假膜或纤维素条索，呈现明显的出血性肠炎病变。肠系膜淋巴结肿大，切面湿润，呈灰红、白相间的大理石样花纹，或呈一致的鲜红或暗红色。肝、肾等实质器官淤血变性。脾脏出血，肺充血、出血、空肠及回肠的末端肠绒毛上皮细胞及肠腺上皮细胞严重变性、坏死和脱落，固有膜内看不到白细胞反应。空肠和回肠固有膜内的孤立淋巴滤泡、集合淋巴滤泡及肠系膜淋巴结，生发中心均质红染网状细胞增生，淋巴细胞数量明显减少。本病的特征性病变是在小肠上皮细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞、大脑皮层锥体细胞、淋巴实上皮细胞等均见有大小不等的核内包涵体。另一病变特征是长骨的红骨髓呈脂样或胶陈样改变，红细胞生成部位不完全。血细胞成分稀疏，网状细胞数量减少，不见成4.3判定根据4.1临床症状及4.2病理变化特点可作出初步诊断，确诊需进行实验室诊断。5实验室诊断5.1病毒的分离鉴定5.1.1设备、试剂与材料生物安全柜、CO₂培养箱、倒置显微镜、高速冷冻离心机、组织匀浆器、细胞培养瓶。DMEM细胞培养液、细胞维持液、细胞消化液、双抗(青霉素、链霉素)(配制方法见附录B)、5.1.2样品采集与处理无菌取病死猫的易感动物肝、脾、胸腺、小肠细膜淋巴结等组织脏器，按1:10(WV)的比例用不含犊牛血清的DMEM培养液制成匀浆，反复冻融3次，3.000r/min离心30min,取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，加人双抗至终浓度为青霉素200U/mL、链霉素200mg/mL,短期4℃冷藏，长期-20℃冷冻保存备用取粪便按1:10(WV)的比例用不含犊牛血清的DMEM培养液制成悬液，然后12000r/min离无菌采取发病动物全血，加入柠橡酸钠抗凝剂，无菌采取全血并分离血清，加入双抗至终浓度为青霉素200U/mL、链霉素200mg/mL,冷藏备用。当CRFK细胞单层铺满80%时，弃去细胞培养液，用无血清细胞培养液冲洗细胞单层后，0.5%胰酶消化，进行细胞传代，一瓶传3瓶，细胞传代的同时，接种0.2mL-0.5mL处理过的样品，同时加0.2mL-0.5mLDMEM培养液作为阴性细胞对照，37℃恒温培养箱中吸附1h,倾去多余液体并用无血清细胞培养液冲洗一次，加入含10%新生犊牛血清(经过56℃水浴灭活30min)的DMEM培养液，置37℃的5%CO₂恒温培养箱中培养24h后，换用2%DMEM维持液继续培养4d-6d,逐日观察CPE。35.1.4结果判定如果正常细胞对照成立，接种样品的细胞出现细胞变圆、拉网、脱落等细胞病变，则判定为细胞培养阳性，收获细胞培养物，用于PCR鉴定。如果对照细胞与接种样品细胞无CPE,则于培养的第4d-6d收取上清，再按5.1.3方式盲传3代，如果盲传后出现CPE,则收获细胞培养物，放入-70℃冰箱中待用于PCR鉴定；若盲传3代未出现CPE,则判定为细胞培养阴性。5.1.5病毒培养物鉴定将分离病毒细胞培养物进行PCR鉴定。5.2聚合商链反应(PCR)5.2.1设备和试剂5.2.1.1设备与器材PCR扩增仪、低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析系统、冰箱、生物安全柜、组织匀浆器、可调微量移液器(200μ-1000μL,20μl-200μl、2μL-20μL、0.5μL-10μL)。Tris饱和酚、酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1)、无水乙醇、70%乙醇、RNaseA(20μg/mL)、蛋白酶K、TE(pH8.0)、50xTris-冰乙酸(TAE)电泳缓冲液、1%琼脂糖凝胶(配制方法见附5.2.1.3阳性对照由指定单位提供，或将FPV标准毒株的CRFK细胞培养物经过灭活制备而成。5.2.1.4阴性对照由指定单位提供，或将良好的CRFK细胞冻融2-3次，5000r/min离心10min,取上清备用。根据FPV标准毒株基因序列，在其保守的VP2基因序列内设计、合成一对特异性引物：5'GGATGGGTGGAAATCACAGC-3'、5-ATAACCAACCTCAGCTCCTC-3°,配成20μmol/L浓度，-20℃保存。取5.1.2处理样品或5.1.5病毒细胞培养物400μL,加入等体积的10%SDS及5μL蛋白酶K将上清转移到一新的离心管中，加入等体积的Ths饱和酚，充分振荡混匀，12.000mhain离心10min;取上层水相转移人一新的离心管中，加入等体积的酚：三氧甲烷：异戊醇(25:24:1)混匀后，12000mmin取上层水相转移入一新的离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇。在-20℃放置1h-2h或室温放置30min以沉淀病毒DNA。12000fmin离心10min,弃去上清，用70%乙醇洗涤沉淀，自然风干。用20μL含RNaseA(20μg/mL)的TE(pH8.0)或dH₂O溶解沉淀，-20℃保存备用。或按照等效的商品化DNA抽提试剂盒操作说明提取病毒DNA。10×PCR缓冲液5μLdNTPs(2.5mmol/L)灭菌水33.5μL总体积为50pL体系，用泼涡混匀器进行混匀，瞬间离心，备用。将PCR反应管置于PCR扩增仪。反应参数为：95℃预变性5min;再进行94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸45s,35个循环；然后72℃延伸10min,最后4℃保存。5.2.3.3PCR产物的电泳检测用TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶板(Goldkiew染料终浓度0.5μg/mL)。将平板放入水平电泳槽中，加人1×TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面。将PCR扩增产物5μL与相应的上样缓冲液混合，分别加入样品孔中，电压80V~100V,电流40mA-50mA,电泳30min-45min。5.2.4结果判定用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，阴性对照和空白对照应无该特异性条带，阳性对照扩增一条大小为845bp的特异性条带，在阴性和阳性对照成立情况下，如被检样品无845hp大小条带。如被检样品有845hp左右大小条带，对其测序分析，在和比对序列(参见附录C)同源性达到98.5%以上时。则判定为FPV阳性。如果无特异性条带出现，则判为阴性5.3.1.2平皿：常用直径6cm的平皿，要求底面平整光滑5.3.1.3模板：用璃板制作，由1个中央孔和6个均匀分布的周边孔组成，孔径和孔间距均为5mm。5.3.1.4打孔器：与模板配套制作的，外径为5mm的不锈钢管。5.3.1.71强叠氮纳。5.3.2操作程序5.3.2.11%(wv)琼脂糖凝胶板的制备称取琼脂糖(电泳级)1g,邻乙汞硫基苯甲酸钠0.04g,叠氮钠0.125g置于150mL容量的三角烧瓶中，加人生理盐水100mL。将三角烧瓶置于磁力加热搅拌器上，边搅拌边加热至沸腾使琼脂糖完全熔化。将熔化的琼脂糖溶液注入直径6cm的平皿中，每个平皿加8mL。琼脂糖自然冷却凝固后，凝胶板厚约3mm,盖好平皿倒置放在湿盒中，4℃冰箱保存备用揭开平皿，将模板放在瓣胶板上方，打孔器垂直插入模板孔中并穿透凝胶直至底面。逐个打完全部孔(孔径距离建议5mm,空间距建议5mm)后拿开模板，用细针头轻轻挑出孔中的凝胶块。打孔好的平皿在酒精灯上方稍微加热，封住孔底用微量移液器每孔加样40μL-50gl。抗原孔(中尖孔)加FPV抗原；周围1、3、5孔FPV阳性对照血清；其余各孔加待检血清样品。每次试验设立1个阴性标准血清对照，阴性标准血清对照用阳性标准血清与被检血清隔开加完样后盖上平皿，放人湿盒中。置于室温15℃~25℃或恒温箱中任其自由扩散。5.3.3结果判定加样24h-48h后判定结果。当阳性对照与抗原孔之间出现1条清晰沉淀线，阴性标准血清对照成立时，试验成立。待检血清与抗原孔之间出现1条沉淀线，并与阳性对照沉淀线末端相融，该血清判定为FPV抗待检血清与抗原孔之间未出现沉淀线，该血清判定为FPV抗体检测阴性。猫泛白细胞减少症概述猫泛白细胞减少症是由猫泛白细胞减少症病毒(FelinePamleukopeniaVinus,FPV)引起的。FPV又名猫瘟热病毒、猫传染性肠炎病毒、猫肠炎细小病毒，主要引起高热、呕吐、脱水、白细胞严重减少及出血性肠炎为主要特征的急性、高度接触性传染病。在自然条件下，FPV可感染虎、豹、狮、水貂、浣熊等多种食肉类动物，具有很高的致死率，是目前对虎等大型野生猫科动物危害严重的病原之一。该病多发于家猫较为集中的地区和猫饲养场，一岁以下断乳不久的幼猫最易感，但未接触过的成年猫也可感染。此外，大多数的野生猫科动物如野猫、虎、豹、师子、山猫、豹猫及小灵猫等均易感以幼畜最为易感。该病的流行具有明显的季节性，通常发生于秋冬季，尤其母猫繁育季节多发。12月至次年3月的发病率可占全年的60%猫感染发病后，生病初期经2d-9d,平均4d,患猫就突然发病。根据临诊表现可分为最急性、急性、亚急性和隐性等4个类型。最急性型的病猫突然死亡，见不到症状。急性型表现非典型症状。常在24h内死亡，往往被误认为中毒，幼猫多呈急性发病。临床常见该病主要为亚急性型，表现典型本病临床症状，体温高达40℃以上，约持续24h降至常温，再经2d-3d重新上升。随着第2次发热，患猫频繁呕吐，初为无色黏液，后为含泡沫的黄绿色黏液，患猫水样腹泻，严重的粪中带血。由于呕吐和腹泻，迅速脱水。患猫精神沉郁、衰弱、伏卧，头搁于两前肢之间，被毛粗乱，第三眼脸突出。6个月以上的猫大多呈亚急性临床。妊娠母猫感染后可发生胚胎吸收、死胎、流产、早产或产出小脑发育不全的畸形胎儿，出生的仔猫表现共济失调等症状。此外，还可造成病猫的视网膜异常血液检查时，白细胞数量明显减少，降至每立方毫米4000以下。年龄较大的猫感染后，症状轻微。体温轻度上升，食欲不振，白细胞数表现轻度减少。剖检病理变化：可见胃肠道空虚，整个胃肠道黏膜有不同程度的充血、水肿以及被黏液纤维素渗出物所覆盖，其中以空肠的病变更为突出，肠壁常呈乳胶管状。肠腔内有灰红色或黄绿色纤维素性、坏死性假膜或纤维素条索，呈现明显的出血性肠炎病变。肠系膜淋巴结肿大，切面湿润，呈灰红、白相间的大理石样花纹，或呈一致的鲜红或暗红色。肝、肾等实质器官淤血变性。脾脏出血，肺充血、出血、水肿。空肠及同肠的宋端肠绒毛上皮细胞及肠腺上皮细胞严重变性、坏死和脱落，固有膜内看不到白细胞反应。空肠和同肠固有膜内的孤立淋巴滤泡、集合淋巴滤泡及肠系膜淋巴结，生发中心均质红染，网状细胞增生，淋巴细胞数量明显减少。本病的特征性病变是在小肠上皮细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞、大脑皮层锥体细胞、津巴窦上皮细胞等均见有大小不等的核内包涵体。另一病变特征是长骨的红骨髓呈脂样或胶陈样改变，红细胞生成部位不完全。血细胞成分稀疏，网状细胞数量减少，不见成熟的嗜中性白细胞。7(规范性附录)试剂配制DMEM培养基粉10g,NaHCO,3.7g溶于1000mL双蒸水中，抽滤分装，4℃保存。DMEM培养基加10%覆牛血清，内含青霉素100U/mL,链毒素100mg/mL,抽滤除菌。DMEM培养基加2%犊牛血清，内含者霉素100Uml、链霉素100mg/mL,抽滤除菌B.4细胞消化液无钙镁PBS1.000mL抽滤除菌，4℃保存备用。三羟甲基氨基甲烷(Thig)(乙二胺四乙酸(EDTA)1.86mg(0.005mmol/L)SDS三蒸水1000mL加入蛋白酶K,使之成为20mg/ml,即为贮存液，使用浓度为50μg/mL。10mmolLImnolLEDTA(pH8.0);去离子水800mL调节pH值至8.0,用去离子水定容至1000mL。B.750xTris-冰乙酸(TAE)电泳缓冲液Tris冰乙酸57.100.5moMLEDTA(pH8.0)三蒸水定容至1000mL,0.105MPa蒸汽高压30min,备用。B.81%琼脂糖凝胶的配制琼脂糖灭菌三蒸水98mL,微波炉中完全融化，加溴化乙锭(EB