饲料中马、驴源性成分的定性检测 实时荧光PCR法 编制说明

实时荧光PCR法》（征求意见稿） 1 1 1 1 6 8 9 9 13 19 2.3.8绝对检测限（Absolutelimitofdetection)测试 2.3.9相对检测限（Relativelimitofdetection)测试 2.3.10方法的稳健性（Robust 33 33 34 1根据《国家标准化管理委员会关于下达2023年国家标准复审修订计划的通马、驴特异性检测标准的制定对于保障消费者的健康和基表1我国主要动物源性成分检测标准汇总饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法2常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法荧光PCR法荧光PCR法荧光PCR法转基因动物及其产品成分检测普通牛(Bostaurus)内标准基因定性黄羊源性成分检测实时荧光PCR法牛和山羊源性成分同步检测方法实时荧光PCR法牛和马源性成分同步检测方法实时荧光PCR法牛和猪源性成分同步检测方法实时荧光PCR法马源性成分检测方法实时荧光PCR法绵羊和山羊源性成分同步检测方法实时荧光PCR法饲料中羊源性成分检测方法（荧光定量PCR法）羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法动物产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法食品中马、驴源性成分定性检测方法实时荧光PCR法食品中鸡、鸭源性成分定性检测方法实时荧光PCR法现行有效的饲料中马、驴成分检测标准《GB/T21107-2006动物源性饲料中3使用GB/T21107-2007分别检测马、驴时，均出现PCR扩增检测结果不特异，规定通过限制性内切酶对PCR产物进行酶切来分辨，费时费力，该方法基2016年10月，上海某食品有限公司生产督局重新抽取样品分别送2个不同的社会检测机构进行检测，同样按照SN/T3730.5-2013检测，所得结果不一致：一个机构检测出马源性成分，另一个机构2017年3月，该市场监督局重新抽取牛肉干样品，送上海海关动植物与食4曾发生过一个真实的事例：曾有一个官方的政府检测机构使用SN/T3730.5-2013对驴肉进行检测，检测出马源性成分。客户和监管机构提出异议。（2）GB/T21107-2006检测灵敏度不够测的循环圈数一般为40-45圈导致检测灵敏度达不到实际检测工作的需要。51MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbmethod分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR检2MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR3MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part3Porcmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR4MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part4ChickenDNAdemethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR5MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR6MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR7MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part7Donkeymethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR8MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR9MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR6MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCRMolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Parmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR本项目参照ISO/TS20224-6:2020和ISO/TS20224-7发【2023】64号）中关于《饲料中马、驴源性成分的定性检测78 2024年6月，标准编制小组完成标准文本、编制说明定向征求意见稿编制9驴成分的实时荧光PCR定性检测，也适用于动物组织及加工品中马和驴成分的该检测方法的相对检测下限为0.1%（W/W绝对检测下限均为5拷贝参考ISO/TS20224-6:2020《分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成2020《分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR检测方法性成分的定性检测实时荧光PCR法》。的要求。所有试剂均使用无DNA酶污染的容器存储或分装。DNA提取试剂或DNA提取试剂盒、荧光定量PCR扩增实验配套试剂、蛋表3引物探针序列目标物种引物探针编号序列基因序列号真核生物18SrRNA参照方法118S-137bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’XR_003508809.118S-137bp-R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’18S-137bp-P5’-[FAM]-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-[TAMRA]-3’真核生物18SrRNA参照方法218S-136bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATG-3’18S-136bp-R5’-ATTTGCGCGCCTGCTG-3’18S-136bp-P5’-[FAM]-TGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGC-[TAMRA]-3’真核生物18SrRNA参照方法318S-179bp-F5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3’18S-179bp-R5’-CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3’18S-179bp-P5’-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3’真核生物18SrRNA参照方法418S-159bp-F5’-TACCCCAGGGATAACAGCGC-3’18S-159bp-R5’-TCCGGTCTGAACTCAGATCACG-3’18S-159bp-P5’-[FAM]-TGTTAATCGTTGAACAAACGA-[MGB]-3’马Horse-125bp-F5’-ACTCATCAAACGCCGCTCTC-3’NC_009171.3Horse-125bp-R5’-GCTGTGAAGACCCCGTTGG-3’Horse-125bp-P5’-[FAM]-CCAGGGCTCGGTGCTTCCAATCGC-[TAMRA]b-3’驴Donkey-95bp-F5’-TGAGTCAGGTGCTCCTTGAAC-3’NW_014638576.1Donkey-95bp-R5’-CTGAGGCACTCGTCTCTCTTG-3’Donkey-95bp-P5’-[FAM]-CCGCTTCCCGTCAGTTGTGTCCTTAGTTG-[TAMRA]-3’马第28号染色体中的特定DNA序列，EquCab3.0，全基因组鸟枪测序定仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Eppendorf5425小型台式高速离心机（德国Eppendorf公司）；UFE500AO型烘箱（德国Memeert公司）；SPEX6850型冷冻碾磨机（美国SPEXSamplePrep公司）；QX1）；国产精补饲料阳性样品的制备：使用犊牛精料补充料，分别添加5%含量的马+5%驴肉骨粉、1%含量的马+1%驴肉骨粉、0.1%含量的马+0.1%驴肉骨粉、国产浓缩饲料阳性样品的制备：使用种猪浓缩饲料，分别添加5%含量的马国产配合饲料阳性样品的制备：使用对虾配合饲料，分别添加5%含量的马核酸提取方法1：称取粉碎后的样品0.2~0.3g，按照GB/T19495.3附录C中核酸提取方法2：称取粉碎后的样品0.2~0.3g，使用天根生化科技（北京）为了保持检测结果的一致性和提取方法的简便性，本研究所用的DNA提取方法，除比较核酸提取方法1和核酸提取方法2的效果外，均采用核酸提取方法2表4PCR实验反应体系 表5PCR反应程序反应温度反应时间循环数预变性95℃10mins1热循环（扩增）95℃4060℃通过检测内参基因真核生物18SrRNA基因，可以判断样品所提取的DNA是否适合于PCR扩增。但目前关于18SrRNA基因检测，空白对照出现扩增曲实验样品包括：18种动物肉类、3种植物种子、3种细菌表618SrRNA检测实验样品1鸽23马4驴5螺678鸡9猪鹅鸭猫鹿狗18SrRNA时，这四对引物和探针的空白对照均会出现微弱扩增。但相对而言，表7四套引物和探针检测Ct区域比较部分动物样品DNACt值1234使用18S-179bp-F/18S-179bp-R/18S-179bp-P引物和探针进行检测，在样品之间，阴性对照（金葡球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等原核生物）和空白对照在表8检测18SrRNA各样品的Ct值Ct值样品名称123456789均值1普通牛20.3421.0320.8721.0920.3320.3420.752美洲野牛20.2120.2421.0820.3421.0420.2120.4821.3320.623马20.7620.2320.7820.2721.0121.2620.5620.7821.6521.4220.874驴19.0119.8819.5620.0120.3919.7520.3319.8419.0719.705螺19.8319.3220.2119.8720.4719.5619.3919.816绵羊19.9920.2220.2919.6719.8820.5620.3920.9820.6920.28718.4819.3418.7619.0118.7319.5220.3319.8718.2718.3819.078鸡21.9720.8821.2420.8621.3321.0522.3420.7721.0821.7621.339猪22.3522.3421.8922.7821.0921.3922.7722.2922.03鹅20.7119.3920.4420.2820.7820.2221.0119.5620.4920.3820.33鸭18.8219.0128.9819.3218.7318.5219.2218.5919.3319.3619.99猫24.9522.0523.7723.6223.7422.8524.2723.6223.6523.3223.58火鸡20.3621.2221.3221.2420.3120.4320.5421.0820.0820.68鹿21.2322.2221.3122.0821.8322.0822.7921.0622.3321.81骆驼20.7120.3921.3820.6620.3920.0621.3321.5620.0320.77狗19.3619.9920.2119.8320.6920.3319.0620.3519.7819.78鸽19.7120.3120.7719.7319.7719.3620.0120.0319.7919.3819.89大鼠18.9819.9819.0318.8818.3218.7519.0319.2218.7318.9618.99玉米13.6913.7513.4414.2113.9913.2413.6414.2213.6913.7313.7620大豆14.5513.9913.7614.2214.3514.5214.2913.6614.8914.7214.3021苜蓿14.0114.6513.5714.4314.0913.7714.8214.8813.7914.0314.2022猪皮明胶31.7630.7731.2532.0831.4431.0531.3732.3331.8431.6023明胶药壳28.8728.6729.3228.3529.4529.8829.0328.0728.4928.7828.8924牛奶巧克力24.9325.7124.9925.3225.4824.8924.7725.4125.3925.2025豆粉花生24.7725.3824.9624.7935.2725.3324.8424.3125.0325.4426.0126芥末南瓜籽25.8125.4425.7926.0425.4125.8825.9225.4725.9625.7827曲奇饼干20.8120.0820.9820.7821.9121.3321.4921.0620.8728牛奶粉32.0332.3932.3932.3333.4532.0932.8432.4929羊奶粉32.7933.4132.0532.5833.0932.4832.6232.7732.7130NegativeControl(金葡球菌)38.6240.5238.9939.3240.7741.0739.3838.7938.2240.6339.6331NegativeControl(沙门氏菌)37.6538.9538.7739.0337.7237.8838.6939.4138.0537.2138.3432NegativeControl(大肠杆菌)39.4739.7739.5340.7341.0839.4438.7839.6939.8839.0639.7433BlankControl(H2O)40.1940.7740.1737.7540.0741.0138.6239.2437.5139.25本研究在18SrRNA检测组的阴性对照和空白对照中观察到了微弱的扩增（2）本研究使用上海生工生物工程公司、大连宝生物、华大基因、上海英骏生物技术有限公司、ThermoFisherScientific等5（3）本研究将上海生工生物工程公司合成的引物和探针干粉直接寄至上海本项目在深入研究的基础上，分析其原因可能是：TaqDNA聚合酶（Taq酶）中可能还有真核生物DNA残留，Taq酶是一种来源于嗜热菌（Thermusaquaticus）的高度热稳定的DNA聚合酶。嗜热菌（Thermusaquaticus）是一种原核生物，按理说，是不能够扩增出18SrRNA的。但是在人工培养嗜热菌（Thermusaquaticus）时，培养基中含有真核生物成化TaqDNA聚合酶过程中，可能会含有少量的真核生物DNA。所以利用18S表9样品DNA稀释浓度及对应Ct值123456利用数字PCR对梯度稀释的样品DNA进行检测对9种牛和玉米各8个浓度样品进行了数字PCR检测，每个浓度设置了6表10数字PCR反应体系PCR反应总体积20(μL)样品4正/反引物探针0.5PCR扩增酶混合物表11样品浓度与拷贝数12345622注释:“---”超出检测线性范围在相同总DNA浓度下，植物细胞核糖体18SrRNA基因的拷贝数明显高于动物细胞核糖体18SrRNA基因的拷贝数。实时荧光PCR检测显示，植物样品的Ct值比动物样品高出6-7个单位。数字PCR结果进一步确认，植物细胞中核rRNA基因的拷贝数大约是牛细胞的60倍。20表1218SrRNA、马、驴检测方法特异性测试物种种类18SrRNA动物++-++++++普氏野马（Equusprzewalskii）++-++++-++--+--+--+--狗（Canisfamiliaris）+--+--鸭（Anasplatyrhynchos）+--+--+--+--+--+--+--+--+--21+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--植物+--+--+--+--+--+--+--2.3.8绝对检测限（Absolut质粒的拷贝数进行精确定量检测，准确稀释到1000拷贝/μL。将定量后的样品0.1拷贝，每个浓度点设置12个重复。分别使用马、驴成分实时荧光PCR检测方法的绝对检测限可达5拷表13马、驴检测方法的绝对检测限测试马驴质粒样品DNA浓度/（拷贝/μL）靶序列拷贝数/（拷贝/PCR反应）阳性结果百分比（%）质粒样品DNA浓度/（拷贝/μL）靶序列拷贝数/（拷贝/PCR反应）阳性结果百分比（%）420420221515220.4290.20.4293.10.2170.80.21750.10.537.50.0.9相对检测限（Relativ将含有马肉和驴肉的肉骨粉与不含动物成分的精饲料研磨成60目大小的粉浓度下能100%检测到特异性DNA（见表14）。这表明，该方法的相对检测限为表14马、驴检测方法的相对检测限测试质量百分比阳性结果百分比（%）质量百分比阳性结果百分比（%）5.05.02.02.0142.3%0.0138.6%0.0010%0.0010.0%将含有马和驴的肉骨粉粉末和不含有动物成分的配合饲料碾磨成60目大小23表15马、驴检测方法的相对检测限测试质量百分比阳性结果百分比(%)质量百分比（W/W，%）阳性结果百分比(%)5.05.02.02.0133.3%0.0141.7%0.0010%0.0010.0%Fast、EppendorfRealplex4分别对马、驴DNA样品（20ng/μL)进行了测试，均表16不同仪器型号对测试结果的影响仪器型号马驴ABI7500++BioRadCFX96++ABI7900HTFast++EppendorfRealplex4++表17不同反应体积对测试结果的影响反应体积(µL）++2420++21++表18不同退火温度对测试结果的影响退火温度(℃)马驴59++60++61++表19不同引物探针浓度对测试结果的影响引物探针工作液浓度(μmol/L）加样体积上游引物1++上游引物1探针0.5上游引物0.85++上游引物0.85探针0.425上游引物0.7++上游引物0.7探针0.35以上实验结果证明，所建立的马、驴的实时25结果如表20所示，表明这些方法适合精补表20实际饲料样品的检测序号名称123456789 26 27检测结果一致，但使用修订前的标准方法检测0.1%含量的马驴肉骨粉样本时，表21修订后标准和修订前标准检测结果比较样品检测项目本方法GB/T21107-2007是否一致种猪浓缩饲料+5%含量的马肉骨粉马源性成分++一致种猪浓缩饲料+5%含量的驴肉骨粉驴源性成分++一致种猪浓缩饲料+1%含量的马肉骨粉马源性成分++一致种猪浓缩饲料+1%含量的驴肉骨粉驴源性成分++一致种猪浓缩饲料+0.1%含量的马肉骨粉马源性成分+-不一致种猪浓缩饲料+0.1%含量的驴肉骨粉驴源性成分+-不一致准在检测原理上较为落后，导致其不单要完成一轮普通PCR需要进行繁琐的后严重增加了实验人员的工作负担。修订后的实时荧光PCR检测标准则大幅缩短2.6不同DNA提取方法对检测结果的影响比较285%含量的马肉骨粉、5%含量的驴肉骨粉、1%含量的马肉骨粉、1%含量的驴肉骨粉、0.1%含量的马肉骨粉、0.1%含量的驴肉骨粉的六个样品，分别使用修订后标准的方法和修订前标准的方法进行检测，结果表明，使用两种DNA提取方法的PCR标准检测结果一致见表22）。表22不同DNA提取方法对检测结果的影响比较序号12345----6----29在制定ISO标准的过程中，为了验证所建立的马、驴检测方法的假阳性率、行，参与国家包括德国、法国、马来西亚、美国、品全未检出（表20方法的假阳性率和假阴性率均为0%，表明所建立的马、表23假阳性、假阴性率测试样品参加协同实验的实验室数量提交结果的实验室数量每个实验室收到的样品数量总样品数量含有检测靶序列的样品数量7272不含检测靶序列的样品数量7272假阳性结果的数量00假阳性率/%00假阴性结果的数量00假阴性率/%0030LOD和POD验证：通过协同实验统计结果表明，样品浓度在1copy拷贝/PCR反应）时检出率为100%表24表明所建立的2种动物源性成分表24绝对检测限的协同实验结果分析马驴靶序列拷贝数（拷贝/PCRP/TP（%）P/TP（%）2078/7878/7878/7878/78578/7878/78269/7888.573/7893.6145/7847.750/7864.10.527/7834.632/7841.00.18/787/789.0表25检出概率（POD）的协同实验结果实验室数量每个稀释水平的PCR重复数量66实验室间平均POD0,790,81实验室间平均POD的95%置信区间0.68-0.880.69-0.89相对于理想POD曲线（b=1）的斜率b实验室间相对标准偏差σL0,300.30理论中位数实验室的LOD95%（以拷贝/PCR反应表示）3,2312024年6月，标准编制小组委托国家食品质量检验检测中心（上海）、四川对本标准的复核验证结论为：本标准所建立的检测方法的相对检测下限为0.1%料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料）中马和驴成分的检测。表26国内外实验室之间的样品检测结果比对（马成分检测方法）Horse-125bp-F/Horse-125bp-R/Horse-125b号1+-+-+-+-+-+-2+-+-+-+-+-+-3+-+-+-+-+-+-4+-+-+-+-+-+-325+-+-+-+-+-+-6+-+-+-+-+-+-7+-+-+-+-+-+-8+-+-+-+-+-+-9+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-结果结果结果结果结果结果结果结果结果结果结果表27国内外实验室之间的样品检测结果比对（驴成分检测方法）Donkey-95bp-F/Donkey-95bp-R/Donkey-95号1+-+-+-+-+-+-2+-+-+-+-+-+-3+-+-+-+-+-+-4+-+-+-+-+-+-5+-+-+-+-+-+-6+-+-+-+-+-+-7+-+-+-+-+-+-8+-+-+-+-+-+-9+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-3320Molecularbiomarkeranalysis—DetectiofHorseDNAdetectionmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实2.ISO/TS20224-7:2020Molecularbiomarkeranalysis—DetectionofDonkeyDNAdetectionmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分34（2）发布后、实施前应将信息在媒体上广为宣传，建议全国饲料工（3）建议本标准正式发布后，设定6个月的过渡期，过渡6个月后实施。35[2]国家质量监督检验检疫总局.饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应(PCR)法:GB/T[3]国家质量监督检验检疫总局.明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法:GB/T[4]国家质量监督检验检疫总局.动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛,羊,鹿)定性检测方法PCR方法:[5]国家质量监督检验检疫总局.食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法:SN/T[6]国家质量监督检验检疫总局.动物产品中牛、山羊和绵羊源性成[9]中华人民共和国农业部.转基因动物及其产品成分检[10]中华人民共和国工业和信息化部.肉类罐头中牛、羊、猪、鸡、鸭源性成分检测方法PCR法:QB/T[12]中华人民共和国海关总署.出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第7部分:绵羊成分检测[16]国家质量监督检验检疫总局.动物源性产品中鸡源性成分PCR检测