预混合饲料中d-生物素的测定 征求意见稿

4.3仪器设备GB/T17778－202×预混合饲料中d-生物素的测定本文件描述了预混合饲料中d-生物素的分光光度和高效液相色谱测定方法。本文件适用于复合预混合饲料、维生素预混合饲料中d-生物素的测定。本文件分光光度法的检出限为4mg/kg、定量限为12mg/kg，高效液相色谱法的检出限为2mg/kg、定量限为6mg/kg。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制样3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4方法1——分光光度法4.1原理用无水乙醇将试样中d-生物素提取出来，在硫酸乙醇溶液中d-生物素和4-二甲基氨基肉桂醛生成橙色化合物，在530nm处颜色深浅与d-生物素含量成正比。4.2试剂或材料警示：强酸应小心操作，取用均需在通风橱中进行。除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.2.1水：GB/T6682，一级。4.2.2硫酸乙醇溶液：将2体积的硫酸与98体积的无水乙醇混匀。4.2.34-二甲基氨基肉桂醛无水乙醇溶液：2g/L。4.2.4标准储备溶液（1mg/mL准确称取d-生物素（纯度≥98%）标准品适量（精确至0.01mg）于50mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，混匀。于4℃保存，有效期为3个月。4.2.5标准工作溶液（20μg/mL准确移取d-生物素标准储备溶液（4.2.5）1mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，混匀。于4℃保存，有效期为2个月。GB/T17778－202×4.3.1分光光度计：±1nm。4.3.2分析天平：精度0.01mg、0.1mg。4.3.3超声清洗器。4.4样品按GB/T20195制备试样，至少200g，充分混匀，装入棕色磨口瓶中保存，备用。4.5试验步骤4.5.1试样溶液的制备称取维生素预混料2g（精确至0.0001g）、复合预混合饲料5g~10g（精确至0.0001g），置于50mL容量瓶中，加入30mL无水乙醇置于超声清洗器（4.3.3）中超声20min，用无水乙醇定容至刻度。过滤备用。4.5.2测定4.5.2.1标准工作曲线的绘制精确吸取d-生物素标准工作溶液（4.2.5）0.00mL、0.80mL、1.60mL、4.00mL、6.40mL、8.00mL于20mL容量瓶中，分别加入无水乙醇8.00mL、7.20mL、6.40mL、4.00mL、1.60mL、0.00mL，加入硫酸乙醇溶摇匀，室温下放置1h，用无水乙醇（4.2.1）稀释至刻度，混匀。用1cm比色皿在530nm波长处测定吸光度，以d-生物素的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。4.5.2.2样品测定精确吸取试样提取液（4.5.1）8.00mL于20mL容量瓶中，加入硫酸乙醇溶液（4.2.2）2mL和4-二甲基氨基肉桂醛无水乙醇溶液（4.2.3）2mL，摇匀，室温下放置1h，用无水乙醇（4.2.1）稀释至刻度，混匀。用试剂空白作为参比溶液，用1cm比色皿在530nm波长处测定吸光度。试样溶液中d-生物素的质量浓度应在标准曲线的线性范围内，若超出线性范围，应将试样溶液用无水乙醇稀释后，重新测定。单点校准定量时，试样溶液中d-生物素的质量浓度与标准溶液质量浓度相差不超过30%。4.6试验数据处理试样中d-生物素的含量，以质量分数w1表示，单位为毫克每千克（mg/kg多点校正按公式（1）计算，单点校正按公式（2）计算：w1=×n………（1）式中：ρ1——从标准曲线查得的试样溶液中d-生物素质量浓度，单位为微克每毫升(µg/mLm——试样质量，单位为克（g）；V1——试样提取液的总体积，单位为毫升（mL）；V2——从提取液（V1）中分取的溶液体积，单位为毫升（mL）。GB/T17778－202×n——超出标准曲线范围后的稀释倍数。w1=×n………（2）式中：A1——试样溶液中d-生物素吸光值；ρs1——标准溶液d-生物素质量浓度，单位为微克每毫升(µg/mL）；As1——标准溶液d-生物素吸光值；m——试样质量，单位为克（g）；V1——试样提取液的总体积，单位为毫升（mL）；V2——从提取液（V1）中分取的溶液体积，单位为毫升（mL）。n——超出标准曲线范围后的稀释倍数。测定结果以平行测定的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字。4.7精密度4.7.1重复性在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的相对偏差规定如表，以大于规定的相对偏差的情况不超过5%为前提。d-生物素含量/（mg/kg）相对偏差/（%）20＜100304.7.2再现性在再现性条件下获得的两次独立测试结果的测定值的绝对差值不大于表2中所示的值，以大于表2中绝对差值的情况不超过5%为前提。d-生物素含量/（mg/kg）绝对差值/（%）＜1005方法2——高效液相色谱法（仲裁法）5.1原理试样中的d-生物素用水提取后，用高效液相色谱仪分离测定，外标法定量。GB/T17778－202×5.2试剂和材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.2.1水：GB/T6682，一级。5.2.2二乙烯三胺五乙酸（DTPA）。5.2.20.05%三氟乙酸溶液：量取5mL三氟酸，用水定容至100mL，用氢氧化钠溶液[c(NaOH)=5mol/L]调节pH至2.5。5.2.3乙腈：色谱纯。5.2.4标准储备溶液（0.2mg/mL准确称取d-生物素（纯度≥98%）标准品适量（精确至0.01mg）于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。于4℃保存，有效期为3个月。5.2.5标准中间溶液（20µg/mL）:准确量取d-生物素标准储备溶液1.00mL于50mL容量瓶中，用水稀释至刻度。于4℃保存，有效期为2个月。5.2.6标准系列溶液：准确移取适量标准中间溶液(5.2.5)，用水稀释定容配成标准系列溶液，浓度分别为:0μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL，临用现配。5.3仪器设备5.3.1超声清洗器。5.3.2分析天平：精度0.01mg、0.1mg。5.3.3高效液相色谱仪：配有紫外或二极管矩阵检测器。5.4样品5.5试验步骤5.5.1试样溶液制备称取维生素预混合饲料2g（精确至0.0001g）、复合预混合饲料5g（精确至0.0001g置于100mL容量瓶中（若预混合饲料中含有矿物质，加入0.1gDTPA加入三分之二体积的蒸馏水，在超声清洗器（5.3.1）中超声提取20min，冷却后用水定容至刻度，过0.45μm滤膜，待测定。5.5.2测定5.5.2.1高效液相色谱条件高效液相色谱参考条件如下：a）色谱柱：C18柱，柱长250nm，内径4.6nm，粒度5μm；或性能相当者；b）流动相：三氟乙酸溶液（5.2.2）+乙腈（5.2.3）=85+15；c）流动相流速：1.0mL/min；d）进样体积：20μL；e）柱温：30℃;f）检瘕波长：210nm。5.5.2.2标准系列溶液和试样溶液测定GB/T17778－202×在仪器的最佳条件下，分别取标准系列溶液（5.2.6）和试样溶液（5.5.1）上机测定。d-生物素标准溶液的液相色谱图见附录A。5.5.2.3定性以保留时间定性，试样溶液中待测物保留时间应与标准系列溶液中待测物的保留时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。5.5.2.4定量以标准系列溶液中的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数不应低于0.99。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出线性范围，应将试样提取液用水稀释（稀释倍数n）至线性范围内，重新试验。单点校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%。5.6试验数据处理试样中d-生物素的含量，以质量分数w1表示，单位为毫克每千克（mg/kg多点校正按公式（1）计算，单点校正按公式（2）计算：×n………式中：ρ1——从标准曲线查得的试样溶液中d-生物素质量浓度，单位为微克每毫升(µg/mLm——试样质量，单位为克（g）；V1——试样提取液的总体积，单位为毫升（mLn——超出标准曲线范围后的稀释倍数。×n………式中：A1——试样溶液中d-生物素峰面积；ρs1——标准溶液d-生物素质量浓度，单位为微克每毫升(µg/mLAs1——标准溶液d-生物素峰面积；m——试样质量，单位为克（g）；V1——