慢病毒安全培训

慢病毒安全培训纲要慢病毒概述实验室个人防护与安全操作废弃物处理实验室安全事故处理一、慢病毒是什么--慢病毒的结构慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒是一种RNA病毒，因其潜伏期较长而被称为慢病毒。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力3慢病毒的载体改进4第一代慢病毒载体第二代慢病毒载体第三代慢病毒载体Gag-polrev5’LTR-ψ-外源基因-3’LTRVSV-GGag-pol-rev-Vif-Vpr-Vpu-Nef-tat5’LTR-ψ-外源基因-3’LTRVSV-GGag-pol-rev5’LTR-ψ-外源基因-3’LTRVSV-G每一代的慢病毒载体改造都使慢病毒的载体更加安全，1，只有含有包装信号ψ的序列才能被包装入慢病毒的遗传信息，由于编码结构蛋白，酶类和膜蛋白的片段都不含有包装信息，所以他们变成了一次性的消耗品，在进入靶细胞后不能复制扩增；2，将一些对细胞有影响的毒性基因剔除；3，将不同的信息放在不同的载体中，降低重组几率《病原微生物实验室生物安全管理条例》中规定HIV活病毒为第二类病原微生物，培养、分离要在BSL-3中操作的；抗体、血清检测在BSL-2级别实验室进行；《慢病毒生物安全手册》中规定所有与慢病毒载体有关的工作必须在BSL2实验室进行。这包括但不限于一间具有负压和门封闭的特点用于组织培养的房间，并配备认证的二级生物安全柜(BSC)和专用的细菌培养箱。HIV病毒通常通过体液接触传播

病毒利器损伤皮肤皮肤黏膜裸露操作不慎溢出暴露10%漂白剂5%酚，0.5%碘伏，70%酒精灭活慢病毒暴露途径与病毒灭活形成气溶胶人员设备操作废弃物管理样品接收危险事故应急等二、个人防护与实验室安全操作实验室安全文件涉及WHO各级生物安全实验室的个体防护要求BSL-1：工作服、手套，工作服不穿离实验区，出实验室前洗手。BSL-2：背开式防护服、手套、帽子、口罩、必要时面部保护装置BSL-3：两层防护服、两层手套、帽子、专业防护口罩、必要时防护镜和呼吸保护装置。可再次使用的工作服要先去除污染再清洗。BSL-4：进入BSL-4实验室时要更换全套服装，工作后脱下所有防护服，出口淋浴后离开。不同类型的BSL-4实验室中，个体防护装备有所不同：在生物安全柜型BSL-4实验室，个体防护装备同BSL—3，在防护服型实验室中，使用正压防护服。混合型实验室同时使用三级生物安全柜和正压一体式防护服。二、个人防护与实验室安全操作个人防护人员：专人负责，未经许可，禁止进入。细胞房的门应保持常闭状态穿戴：戴两双手套，穿实验室外套，建议穿连体无菌服，并把实验服外套袖子的袖口塞进手套里；戴口罩，戴护目镜或面罩；注意事项：1、禁止任何皮肤暴露，2、避免带伤、病工作；3、禁止在实验区域进食、饮水、化妆和处理隐形眼镜，储存食品和饮料等；

4、避免戴着未经消毒的手套触碰物品；5、禁止穿着实验室防护服离开实验室；

二、个人防护与实验室安全操作眼睛防护装备安全眼镜和护目镜防飞溅，撞击，腐蚀性液体，强酸碱等安全眼镜、护目镜或面罩使用后未经去除污染，不得带离实验区洗眼装置感染性物质或腐蚀性物质溅至眼睛，就近的洗眼装置用大量清水冲洗眼睛表面至少15-30分钟。注意：速度是决定性的。二、个人防护与安全操作头面部防护装备口罩口罩可以保护部分面部免受有毒有害物质等喷溅物的污染。二、个人防护与安全操作防护面罩由防碎塑料制成，保护工作人员免受脸部碰撞或切割伤、感染性物质或化学物质的飞溅或滴液接触至脸部，或污染眼睛、鼻子以及口。防护帽可以保护工作人员避免化学和生物危害物质飞溅至头部（头发）所造成的污染。手部防护装备手套的选择乳胶手套,耐热，耐冷，不锈钢网手套的检查是否褪色、穿孔或有裂缝。手套的使用双层，覆盖袖口，消毒后脱弃避免手套的“触摸污染”身体，物品脱手套过程二、个人防护与安全操作用过的个人防护用品的处理凡在生物安全实验室使用过的个人防护装备均应视为被污染过。一次性用品可高压灭菌后作为废物统一处理。可重复使用的防护服帽子等高压灭菌后再洗涤处理，重复使用。其它根据物品性质选择物理或化学方法处理。二、个人防护与安全操作安全操作操作原则：要求所有的技术操作尽量规范，操作病毒时要特别小心，谨慎，避免发生危险。1、位置：关于慢病毒一切操作都要在Ⅱ级安全柜内进行。2、细胞培养：细胞培养或传代过程中，动作要轻柔，以免损伤细胞。3、细胞观察：使用显微镜观察细胞时，拧紧培养瓶或盖紧培养板。用

70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。4、移液：用移液枪吸液体时，枪头要带滤芯且动作要轻柔，避免液体倒吸移液枪内，造成污染以及损坏仪器。5、包装和感染：包装和感染病毒的细胞一律只能放在单独的培养箱中培养，防止污染其他细胞

6、在生物安全柜以外的接触到任何事物比如冰箱、离心机或细菌培养器，先去掉可能污染的手套，换上新的手套。

二、个人防护与安全操作7、存放：要保存的病毒存放前管子需用封口膜严密封口，做好标记；临时放置于4度冰箱的病毒请在管子外面再单独套上较厚的塑料袋并做好标记。8、消毒：每次实验操作时均需用70%酒精处理工作台面和双手，试验完毕后同样用70%酒精处理。9、只要有可能，应该尽量避免使用利器；10、需要带出实验室的手写文件必须保证在实验室内没有受到污染。11、污染的液体或使用过的器皿在实验完成后要及时处理。12、超净台和显微镜用完随手关闭电源，盖上水浴锅盖子并关上电源。13、病毒实验完成请务必用洗手液彻底洗手。14、出现溢出事故以及明显或可能暴露于感染性物质时，必须向实验室负责人报告。实验室应保存这些事件或事故的书面报告，并制订关于如何处理溢出物的书面操作程序便于后人遇到类似事情快速处理。二、个人防护与安全操作生物安全柜:在工作开始时，不锈钢工作表面可以用70%的酒精擦拭。当带双手套时，在从生物安全柜中移出双手之前，消毒，取下外层的手套并将其存放在一个固体废物袋中。在工作结束时，必须消毒所有从生物安全柜中拿出的物品。生物安全柜的表面必须用70%的酒精擦拭和降低视窗。安全柜内壁和空间均喷洒大量

70%酒精，擦拭。擦拭用纸也一起投入灭菌袋，实验完毕立即系紧袋口拿出病毒间，连同口罩、帽子、病毒衣等一起进行高压灭菌。使用过的移液枪喷洒大量

70%酒精处理后置于安全柜中紫外灭菌，安全柜紫外灭菌30分钟后方可继续使用。二、个人防护与安全操作离心分离：需要离心时，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心。确保管子适当平衡；离心分离后，离心机盖子必须小心打开；危险性样品在生物安全柜中打开；从生物安全柜中移出转头之前应该用70%的酒精进行喷洒整个转头。安全罩时，必须装上安全罩，防止气溶胶，关闭。生物安全柜移走之前用75%的酒精擦拭在结束时，必须消毒离心机转子和/或桶。二、个人防护与安全操作处理一般流程三、废弃物处理①不要把实验废物放到办公区的废物内②把利器放入专用容器内；③废弃物离开实验室前要对其外表进行消毒；④做上标记；⑤贴封条或扎进袋子，并保持到高压灭菌结束；⑥安全的运送到高压灭菌处。固体废弃物:包括废弃枪头、EP管，细胞培养皿，玻璃器皿等，放入预先装有10%新洁尔灭液体的塑料盒或容器中浸泡。消毒液需新鲜配制。在工作结束时，使用70%的酒精进行喷洒并将浸泡过的物品放入生物危险废物袋中。高压灭菌后再洗涤或丢弃处理。处理频次：每次实验完成后

三、废弃物处理液体废弃物：通常被吸入一个真空瓶中，其中真空瓶内包含1/10容量的浓缩漂白剂；没有吸入的液体垃圾必须用漂白剂处理使其最终浓度达到至少10%并且放置最少30分钟来灭活病毒。去污染后再排放。三、废弃物处理四、实验室安全事故处理

工作人员发生意外事故时，如针刺损伤、感染性标本溅及体表或口鼻眼内，或污染实验台面等均视为安全事故，应立即进行紧急处理。（一）紧急处理：根据事故情况采用相应的处理方法1、小型事故：任何一种小的损伤，包括皮肤的破损或刺伤等都可能与传染性物质接触，必须用肥皂和水冲洗，如果可能尽量挤出损伤处的血液，使用70%乙醇或其他皮肤消毒剂，立即进行医疗处理；2、皮肤污染：皮肤污染部位用水和肥皂冲洗，并用适当的消毒剂浸泡，例如，70%乙醇或皮肤消毒剂（外科用药）.3、针刺和切割伤：怀疑皮肤有损伤或针刺时，建议尽可能挤压伤口，然后用大量的水冲洗.4、眼睛溅入液体：眼睛溅入液体，立即用水冲洗。必须迅速。避免揉擦眼睛。连续冲洗至少十分钟.5、衣物污染（1）尽快脱掉隔离衣以防止感染物触及皮肤并防止进一步扩散。脱掉防护手套。洗手并更换隔离衣及手套.（2）将已污染的隔离衣及手套放入高压灭菌器.（3）清理发生污染的地方及放置隔离衣的地方.（4）如果个人衣物被污染，应立即将污染处浸入消毒剂.（5）应立即寻求帮助，抛弃已污染的衣物并更换干净的衣物或一次性衣物。四、实验室安全事故处理6、重大事故：指的是严重损伤或暴露。皮肤受损处理同上。实验室重大损失及泼溅，应按下述第7项立即行动起来，主管领导和专家到场并提供指导。所有事故和意外必须记录在事故登记簿和意外事故/危险登记簿上，这些记录本必须由单位保存备案。7、涉及污染物的重大损伤及泼溅当感染性培养物泼溅出来后，气溶胶会造成最大危害；发生泼溅事故后应立即采取措施保护易污染物质；如果怀疑有严重事故，应按较严重情况处理并采取以下措施：（1）污染处疏散人员，但要防止污染扩散；（2）控制污染—-锁门并防止进一步进入；（3）通知实验室主管领导、安全负责人，以便查清情况，确定消毒的程序；（4）如果认为合适，可进行生物安全柜和/或实验室的熏蒸消毒；（5）消毒：发生溢出后应离开房间约30分钟。四、实验室安全事故处理（一）生物安全柜内少量溢出(<25ml)1.确保柜机继续运行，等待5分钟允许气溶胶通过HEPA过滤器被清除；2.穿戴防护衣服，轻轻地用10%的漂白剂(5%的酚，或2.5%的碘伏)从外围开始向中心覆盖。在清理之前确保足够的接触灭活时间（20分以上）；3.将浸泡过的纸巾丢进生物安全柜中生化危险袋中。擦干净残留的脏污。再用70%的酒精擦拭表面，将毛巾丢在生物危险品袋中。4.降低视窗5分钟，使用鼓风机通过HEPA过滤器通风

含病毒样本的溢出通常分四种生物安全柜内溢出生物安全柜外溢出少量溢出（＜25ml）严重溢出（＞25ml）少量溢出（＜10ml）严重溢出（＞10ml）四、实验室安全事故处理（二）生物安全柜内清理较大量溢出流程(＞25ml)1.撤离房间，尽可能少的呼吸气溶胶；2.关门离开房间3.脱掉个人防护用品和任何被污染的衣物，将其放入密封的塑胶容器内4.贴警告标示不要进入-慢病毒溢出5.在溢出发生时房间的每个人应该使用消毒皂彻底洗手和洗脸6.等待30分钟让气溶胶沉淀，在此期间，通知安全人员及负责人，如果溢出到生物安全柜外，处理方式如生物安全柜外的溢出处理方式7.然后按少量溢出处理方式；消毒所有使用的设备或者有可能被污染的表面8.如果溢出量大，需要消毒整个机器包括风扇，过滤器，空气室。四、实验室安全事故处理（三）生物安全柜外清理少量溢出流程(＜10ml)通知附近的人员。确定溢出的范围-检查鞋子。如果有必要消毒鞋子。撤离房间，关门。丢弃可能受污染的个人防护用品，并脱掉被污染的衣物。彻底洗手洗脸。贴警告标示不要进入-慢病毒溢出等待30分钟同时通知安全人员和负责人。穿上新个人防护用品:实验服、手套、面罩、护眼设备。重新进入房间，用纸巾覆盖溢出物。用10%的漂白剂浸泡纸巾，从外围开始向中心覆盖。确保20分钟的接触时间，灭活病毒。继续清理:浸泡过的纸巾或毛巾投入生物安全袋。用钳子夹起尖锐物。用纸巾擦去残余物。丢弃在生物危害袋。用75%的酒精擦拭溢出区域。与负责人一起写一份报告给生物安全顾问。四、实验室安全事故处理（四）生物安全柜外的严重溢出（在大区域内>10ml）通知附近的人员。确定溢出的范围-检查鞋子。如果有必要消毒鞋子。撤离房间，关门。丢弃可能受污染的个人防护用品，并脱掉被污染的衣物。彻底洗手洗脸。如果眼镜暴露在外面，清洗眼窝贴警告标示不要进入-