芒果品种鉴定技术规程SSR分子标记法地方标准编制说明

芒果品种鉴定技术规程SSR分子标记法地方标准编制说明

一、制定意义及任务来源

1目的意义

目前，通过分子生物学和生物信息学相结合的方法在基因

水平对种质资源生物多样性进行鉴定已经成为作物学领域研

究热点。20xx年4月，农业部印发《农作物品种DNA身份鉴

定体系构建实施方案》中指出“现代种业是国家战略性、基础

性核心产业，品种创新是现代种业发展的核心，品种保护与管

理是品种创新的必要保障。目前，生物技术的快速发展，移动

互联、大数据引发的产业变革，为品种管理向田间表型身份鉴

定与室内基因型（DNA,即脱氧核糖核酸）身份鉴定相结合的

方向发展提供了有力的技术支撑”。因此构建品种DNA身份鉴

定体系是加强种子管理、保障市场公平竞争、保护农民合法权

益、提升品种创新能力和推进种业信息化发展的需要。

分子标记鉴定是从DNA水平直接反映品种或亲子间的差

异，不受植物发育阶段、组织器官、季节、环境和表达等条件

的限制，同时DNA标记数量大、多态性丰富等诸多特点，现已

在品种鉴定、图谱构建、基因定位等研究中广泛应用。分子标

记技术之一SSR即简单重复序列(SimpleSequenceRepeat)

或微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)。它通常是指以2〜5

个核甘酸为单位的多次串联重复DNA序列，长度大多在

100^200bpoSSR在基因组中分布广泛，由于重复次数的不同

而引起不同材料间的差异，通常表现为共显性。SSR两端有一

段相对保守的序歹U,根据保守序列设计引物进行PCR扩增就可

获得SSR片段。由于SSR分布广泛，具有多态性好、表现为共

显性、对DNA质量要求低且用量少的诸多特点，已经广泛应用

于植物遗传多样性分析、杂种鉴定、指纹图谱构建、基因定位

等方面。可以用于植物品种权精准授权、打假与维权，为《种

子法》的实施提供了可靠的技术手段。

芒果(MangiferaindicaL.),漆树科，杞果属。果皮颜

色有红中带黄、黄中带青、青中带黄、纯青色等。果肉为黄色,

鲜美多汁，有浓郁的芳香气味。内部有一粒种子，种子为扁平

形。素有“热带果王”之美誉，是世界上著名的热带水果，据

世界粮农组织(FA0)统计，20xx年全世界芒果实际收获面积

和产量分别为9616.6万亩和5127.9万吨；芒果亦是我国重

要的热带水果之一，我国主要种植地区为广东、XX、海南、云

南、福建和台湾等地，5-9月为盛产期。在面积上仅次于香蕉、

荔枝和龙眼，居第四位，据农业部南亚办数据显示，20xx年

全国芒果种植面积达484.2万亩，产量278.2万吨（台湾未

计入），产值190.3亿元。20xx年，xx芒果产量超过海南成

为最大的芒果产地，居全国首位。20xx年xx芒果果园面积

153.93万亩，产量79.81万吨，产值50.7亿元。xx百色与海

南、攀枝花并称我国三大芒果之乡，百色市是我国最大的芒果

生产基地，近年来百色为xx芒果贡献了大部分产量，芒果产

业已成为当地农业支柱产业之一，是当地农民收入的主要来

源。

xx芒果品种主要有台农1号芒、金煌芒、红象牙芒、桂

热芒82号、桂七芒、贵妃芒、桂热芒10号、凯特芒、新世纪

芒等29个品种。单从形态上鉴定存在一定困难，这就给芒果

品种的选育、生产、经营和使用等方面造成不同程度的困扰,

同时也给种子管理部门带来一定的挑战。我国已出台了一系列

主要农作物品种的SSR分子标记鉴定行业标准和地方标准，而

目前尚无利用SSR标记技术鉴定芒果品种真伪的方法标准。制

定相应的xx地方标准，规范利用SSR标记技术鉴定芒果品种

真实性，对品种管理、质量监控等方面具有重要意义，且对杂

种优势群的划分、种质创新及新品种的选育等具有指导意义。

2任务来源

20xx年由xx检验检疫标准化技术委员会提出的《芒果品

种鉴定技术规程SSR分子标记法》的制定计划，20xx年xx区

质量技术监督局在关于下达《20xx年第一批xx地方标准制定

项目计划的通知》附件文中批准将其列入20xx年第一批xx

地方标准制定项目计划(序号：20xx-0114),由xx益谱检测技

术有限公司、xx出入境检验检疫局技术中心、南宁维尔凯生

物科技有限公司等主要负责起草该地方标准的制定任务。

二、工作概述

1国内外相关研究

忙果(Mango/MangiferaindicaL.),别名芒果、檬果、

望果、渗果、闷果、蜜望子、庵波罗果等，为漆树科

(Anacardiaceae)忙果属(Mangifera^)植物，常绿果树，

有“热带果王”之美誉，世界五大名果之一。由于松果从起源

到驯化的过程复杂、不同地区之间引种、地方品种没有确切的

科学名称等，近年来，我国各地科研工作者在种质资源调查和

收集研究时，大多都局限于某一地区，各自从不同的角度对忙

果进行了种下分类，同一个品种在不同省份的参试和审定的进

程往往也不一致，同一品种在不同省份通过审定后该品种的标

准样品存在差异，另外，在多个省份审定的情况下，不同单位

对同一品种的不同命名，还有窃用他人品种后换名审定的，从

而导致一定数量上的仿冒雷同，品种间亲缘关系不明确，而且

从形态特征上很难将其准确归类,给忙果品种管理带来一定的

混乱。因此，为了更好的保护现有松果的品种权和新品种的鉴

定，应坚持品种命名的唯一性原则，需要建立起一种快速、准

确、可靠、高效的松果种质资源鉴定方法，而传统鉴定评价方

法，都有一定的局限性。目前世界上约有机果品种1000多

个，我国约有200个忙果品种或品系。杞果具有丰富的遗传

多样性，果实的大小、形状、色泽、纤维多少、核大小等是区

别松果品种的主要依据，但忙果的品种、品系很多，过去多用

实生苗繁殖，产生了许多自然杂交种，新的品种又不断地被人

工培育出来，由于存在饰变和观察标准不同，依据植物学性状

难以对忙果资源进行准确分类，导致同物异名、同名异物和资

源重复保存等现象严重。

M.T.%力而〃等利用SSR标记对42对引物进行了筛选，

其中36对引物具有可重复的多态性可扩增模式。在这两个

品种的水果中，60.7%的得分片段被认为是假定的基因型特异

性标记。多态信息含量QPIC)在0.25~0.75之间，平均为

0.51。Hania和Ami品种的水果的杂合度分别为0.68和0.53。

通过对这36对引物的条带分析，可以区分出不同的品种的水

果，说明利用SS7?引物进行是一种有效的基因型鉴定方法，

可以利用DNA指纹图谱描述和鉴定两个埃及芒果新品系的园

艺初步研究(PreliminaryHorticulturalStudiesTo

DescribeAndIdentifyOfTwoNewEgyptianMangoStrains

UsingDNAFingerprint.?；A.Sennhenn等用19个简单序列

重复标记对38棵芒果干叶片进行分子分类，研究肯尼亚东部

和中部芒果地方品种的形态和分子特征。利用Nei，s遗传距

离和邻居连接方法建立了芒果样品间的遗传亲缘关系树状图o

形态学鉴定得出6个不同的聚类(7加ofmango

(MangiferaindicaL.)landracesfromEasternandCentral

Kenyausingamorphologicalandmolecularapproach)；

ManalEidt等采用-简单序列重复(SSRs)技术对25个埃及芒

果品种的遗传变异程度进行了分析，并建立了指纹图谱。根据

35个SSR标记的可重复性、可分离性和品种间的分离能力，

选择了35个SSR标记。35个SSR位点产生219个多态性高的

等位基因（约100%）o通过多态位点百分比、观察到的等位基

因数、有效等位基因数、观察到的杂合度、预期杂合度、固定

指数和基因流等参数，计算了栽培种质的等位基因初变异率和

遗传基础（EfficiencyParametersofSSRMarkersfor

CharacterizationofSomeMangoCultivarsandTheir

SuitabilityinMolecularBar-codingSSRyo

石胜友，张燕梅，武红霞等采用SSR标记方法，对来自7

个国家的36份忙果品种进行了遗传相似性分析，目的是为忙

果育种亲本合理选配、现有国外种质的充分发掘利用提供科学

依据；王静毅等人应用SSR技术对xx主要忙果资源遗传关系

进行SSR分析，对48个松果品种（系）的遗传关系进行了检

测。xx主要忙果资源品种间的遗传相似系数在0.45591）.9412

之间，平均为0.7053,以桂热忙06-3号与桂热忙06-5号两

者之间的相似系数最小，而Keitt与红凯特忙及玉文忙与蜜

桃松之间相似系数最大。UPGMA聚类分析将48个品种分为5

大类群。聚类结果表明，在分子水平上，杞果品种间的亲缘关

系与胚性无直接关系；且xx本地忙果品种（系）多是象牙松、

青皮杞、吕宋杞或秋杜等的杂交子代或实生后代。芒果种质资

源真伪鉴定的相关文献资料有：

1、王静毅等.XX主要忙果资源遗传关系的SSR分析[J].热带

作物学2009,30(9):1301-1307；

2、石胜友,张燕梅.武红霞,等.36个忙果引进品种的遗传相似

性研究[J].果树学报20xx,27(6):914-917；

3、黄丽芳,雷新涛,姚全胜,等.芒果SSR-PCR反应体系的优化

[J].热带作物学20xx,31(3):410-414；

4、黄丽芳，闫林,范睿,等人.芒果实生资源遗传多样性的SSR

分析[J].热带作物学20xx,32(10):1828-1832；

5、罗纯,武红霞,姚全胜,等人.芒果转录组中SSR位点信息分

析与引物筛选[J].热带作物学报20xx,36(7):1261-1266;

6、覃昱茗,张宇,黄国弟,等.松果SC-SSR分子标记反应体系

的建立与优化[J].农业研究与应用，20xx,34(3)：37-43.

7、王明,应东山，王琴飞,等.我国芒果主栽品种遗传多样性分

析及指纹图谱构建[J].南方农业学报JournalofSouthern

Agriculture20xx,46(7):1154-1159;

8、闫慧清,刘泽标,吉海旺,等.芒果EST-SSR位点分析及引物

开发[J].分子植物育种，20xx,18(11)

9、周立,罗聪，何堂熹,等.基于EST-SSR标记的芒果品种遗传

多样性与亲缘关系分析[J].分子植物育种.20xx,18(11)

10、PreliminaryHorticulturalStudiesToDescribeAnd

IdentifyOfTwoNewEgyptianMangoStrainsUsingDNA

Fingerprint(利用DNA指纹图谱描述和鉴定两个埃及芒果新

品系的园艺初步研究)[J].JournalofAmericanScience,

20xx,7(2):641-650;

11>A.Sennhenn•K.Prinz•J.Gebauer•,A.Whitbread•R.

Jamnadass•K.Kehlenbeck.Identificationofmango

(MangiferaindicaL.)landracesfromEasternandCentral

Kenyausingamorphologicalandmolecularapproach(肯

尼亚东部和中部芒果地方品种的形态学和分子鉴定)[J].

GenetResourCropEvol,20xx,61:7-22.

12>ManalEid,M.A.Hussein.EfficiencyParametersofSSR

MarkersforCharacterizationofSomeMangoCultivarsand

TheirSuitabilityinMolecularBar-codingSSR(标记在

芒果品种鉴定中的有效性参数及其在分子条形码中的适用

性)[J].NewYorkScienceJournal20xx;10(8):68~76.

上述这引些研究都表明：SSR标记与毛细管凝胶电泳相结

合的分子标记技术可以鉴定芒果品种，可为芒果的遗传分析、

指纹图谱构建、杂交效率评定等提供可靠、快速的方法。

2标准起草的主要工作过程

2.1引物的来源

本技术规范编制过程中使用的38对SSR引物主要来源于

中国热带农业科学院南亚热带作物研究所、xx大学农学院、

农业部热带果树生物学重点实验室等科研院所和高校发表的

文章中所使用的，以及查阅其它文献上使用的芒果基因组序列

引物。

2.2芒果品种类型的收集

本实验收集了20个芒果品种，分别是桂热芒07-2号、桂

热芒07-3号、桂热芒08-10号、桂热芒10-1号、桂热芒16-1

号、桂热芒285号、桂热芒290号、三年芒、PULMER、安宁红

芒、金煌芒、桂热芒10号、圣心、桂热芒82号、桂热芒60

号、桂热芒4号、泰国芒14号、桂热芒08-6号、台农、桂七,

其主要来源于xx区亚热带作物研究所芒果种质资源圃种植基

地（南宁市邕武路）。

2.3技术路线与实验

选取20个xx区内种植的不同芒果品种。用筛选出的38

对SSR引物进行PCR扩增，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，对

SSR引物的扩增稳定性及多态性进行分析，并采用毛细管电泳

对扩增产物进行同步分析验证。

根据峰图简单易读取、多态性高、扩增稳定性高、染色体

上分布均匀的原则，最终确定了38对核心引物用于芒果品种

鉴定。

2.4技术验证

经xx益谱检测技术有限公司、xx作物遗传改良生物技

术重点开放实验室和南宁国拓生物科技有限公司等三家单位,

对技术规程的可操作性和检测数据的可重现性进行了验证。其

中xx益谱检测技术有限公司对20个xx区内种植的不同芒果

品种的38对SSR引物的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电

泳检测验证；6个xx区内种植的不同芒果品种的6对SSR引

物的PCR扩增产物进行毛细管电泳检测验证。xx作物遗传改

良生物技术重点开放实验室和南宁国拓生物科技有限公司分

别对6个xx区内种植的不同芒果品种的38对SSR引物的PCR

扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测验证；6个xx区内种

植的不同芒果品种的6对SSR引物的PCR扩增产物进行毛细管

电泳检测验证。经验证，《芒果品种鉴定技术规程SSR分子标

记法》技术规程中的DNA提取、PCR扩增及产物检测方法具有

可操作性，按照技术规程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳条带明显,

清晰可辩;毛细管电泳检测方法中扩增的PCR产物均能获得清

晰、稳定的主峰，且易于识别。

三、标准编制原则和标准的主要内容

1标准编制原则

规范性原则：本技术规范的制定符合法律法规，符合有关

标准规范的要求，包括GB/T1.l-20xx《标准化工作导则第

1部分：标准化文件的结构和起草规则》、NY/T2594《植物

品种鉴定DNA分子标记法总则》、NY/T2440-20xx《植物新

品种特异性、一致性和稳定性测试指南芒果》、GB/T6682《分

析实验室用水规格和试验方法》。

适用性原则：本规程的全部内容具有可操作性。

统一性原则：本规程与现行相关标准协调统一，不发生冲

突。

先进性原则：本规程采用目前国际国内外品种鉴定领域均

认可的、成熟的SSR标记技术，以非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

平台为主，兼顾毛细管电泳检测平台的芒果品种鉴定技术，与

田间小区鉴定方法对比，该方法的先进性在于不受环境影响和

季节约束，检验周期短。

2标准主要内容

标准编写主要内容包括样品处理、聚合酶链式反应法

（PCR）、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳操作过程以及结果

判定，适用于芒果种质资源真伪的检测。

标准规程编制的过程主要进行了以下试验和工作：

2.1原理

不同品种芒果的遗传组成不同，其基因组（DNA）中SSR

的重复次数存在差异，根据SSR的差异，通过PCR扩增及电泳技

术可以鉴定芒果品种。

2.2样品来源

样品采自xx区亚热带作物研究所芒果种质资源圃种植基

地（南宁市邕武路）的芒果叶片。

2.3仪器

电子天平、高速冷冻离心机、水浴锅、PCR扩增仪、垂直

板电泳系统、毛细管电泳仪、凝胶成像系统、胶片观察灯等。

2.4试剂

液氮、无水乙醇、三氯甲烷、甲醛、三羟甲基氨基甲烷、

DNA分子量标准、2XTaqPlusPCR预混试剂、40%丙烯酰胺/

甲叉双丙烯酰胺溶液、氯化钠、氢氧化钠、硝酸银、硼酸、过

硫酸镂、十六烷基三甲基澳化镂、乙二胺四乙酸二钠、四甲基

乙二胺、琼脂糖、去离子甲酰胺、DNA分析仪用丙烯酰胺胶液、

DNA分析仪用LIZ500分子量内标、DNA分析仪用电泳缓冲液、

DNA分析仪用光谱校准基质。

2.5SSR引物

引物序列见表1

表1引物编号及引物扩增信息

序引物退

条带大

号引物名称火温度引物序列(5,-3，)

小(bp)

(℃)

序引物退

条带大

号

引物名称火温度引物序列(5,-3,)

小(bp)

(℃)

正向：

CTTCCTTTCTCTCATCACTTCCA

1mangoESl1148-24855

反向：

CTTCAATAGTAGCCCCATCACTG

正向：

CAGTAACTACTACCACCGCAACC

2mangoES24157-27055

反向：

ATATTCTCGCTCTCGTTGTTTTG

正向：

TCCATTTTTGACAAATCTCCACT

3mangoES35156-24655

反向：

TAGCCTTGAATTCCTCAAACAAA

正向：

GGTTGTTATCGTCGTTATTGTGG

4mangoES39143-16355

反向：

CGGAAAATGTTCGACTTGTAACT

序引物退

条带大

号

引物名称火温度引物序列(5,-3,)

小(bp)

(℃)

正向：

GGGACATTGACTTAACAGCTTTC

5mangoES40144-24455

反向：

CTTCTGCCTGAATGTACTGGACT

正向：

CCTGTGCTTACCACCCATATTAG

6mangoES69150-21055

反向：

AAAGATTGCAAGTCTGAGCAAAA

正向：

TGATGAGAATGAACAAGCAGCTA

7mangoES71125-18055

反向：

TATCTGCAGTAACAGCACTCAGC

正向：

CGGGTAAACCCACTATGTATTCC

8mangoES126143-20055

反向：

TGGTGGTGGTAAAAAGAAGAAAA

序引物退

条带大

号

引物名称火温度引物序列(5,-3,)

小(bp)

(℃)

正向：

TCGAGAGCTACTCTTTATCGGAA

9mangoES170150-15855

反向：

AATTAAGCGTGCAAACCTGTAGA

正向：

TATCATCAGAACTACCGCCATTT

10mangoES172146-19655

反向：

CTCTTTTCTTCGCTGTGTTTTGT

正向：

ATTATCCCTATAATGCCCTAT

11EST14175-29050

反向：

CTCGGTTAACCTTTGACTAC

正向：

AGGACATCTGTGACCAAGAGC

12MCR55170-22058

反向：

TTCCCACCCACAACTCCAAC

序引物退

条带大

号

引物名称火温度引物序列(5,-3,)

小(bp)

(℃)

正向：

TGTCTTTCAGCTTCACCGCT

13MCR130250-26058

反向：

CGCAGTGGAGAGTTGTTGTG

正向：

CGGGACCATGTCACCAGAAA

14MCR220250-51060

反向：

GGCGAATGCGTAGTCAGAGA

正向：

ATGGAGACTAGAATGTACAGAG

15Lmmal205-25550

反向：

ATTAAATCTCGTCCACAAGT

正向：

AGATTTAAAGCTCAAGAAAAA

16Lmma4240-38047

反向：

AAAGACTAATGTGTTTCCTTC

表1引物编号及引物扩增信息(续)

序引物退

条带大

号引物名称火温度引物序列(5'-3')

小(bp)

(℃)

正向：

AGAATAAGCTGATACTCACAC

17Lmma5280-39047

反向：

TAACAAATATCTAATTGACAGG

正向：ATATCTCAGGCTTCGAATGA

18Lmma6105-20550反向：

TATTAATTTTCACAGACTATGTTCA

正向：

ATTTAACTCTTCAACTTTCAAC

19Lmma7210-25050

反向：

AGATTTAGTTTTGATTATGGAG

正向：CATGGAGTTGTGATACCTAC

20Lmma8260-36050反向：

CAGAGTTAGCCATATAGAGTG

21Lmma9205-23047正向：

序引物退

条带大

号引物名称火温度引物序列(5'-3')

小(bp)

(℃)

TTGCAACTGATAACAAATATAG

反向：

TTCACATGACAGATATACACTT

正向：

TTCTTTAGACTAAGAGCACATT

22LmmalO155-21050

反向：

AGTTACAGATCTTCTCCAATT

正向：

ATTATTTACCCTACAGAGTGC

23Lmmall240-41049

反向：

GTATTATCGGTAATGTCTTCAT

正向：

AAAGAATAGCATTTAATTAAGGA

24Lmmal2210-25047

反向：

GTAAGTATCGCTGTTTGTTATT

25Lmmal3180-23047正向：

序引物退

条带大

号引物名称火温度引物序列(5'-3')

小(bp)

(℃)

CACAGCTCAATAAACTCTATG

反向：

CATTATCCCTAATCTAATCATC

正向：AACTACTGTGGCTGACATAT

26Lmmal5220-27050反向：

CTGATTAACATAATGACCATCT

正向：

ATAGATTCATATCTTCTTGCAT

27Lmmal6220-25050

反向：

TATAAATTATCATCTTCACTGC

正向：

28AY942818125-15055CCACGAATATCAACTGCTGCC

反向：TCTGACACTGCTCTTCCACC

正向：AAACGAGGAAACAGAGCAC

29AY94281990-14053

反向CAAGTACCTGCTGCAACTAG

30AY942820170-23053正向：AGGTCTTTTATCTTCGGCCC

序引物退

条带大

号引物名称火温度引物序列(5'-3')

小(bp)

(℃)

反向：AAACGAAAAAGCAGCCCA

正向：TGTAGTCTCTGTTTGCTTC

31AY942821280-41049

反向：TTCTGTGTCGTCAAACTC

正向：

32AY94282323055AGAATAAAGGGGACACCAGAC

反向：CCATCATCGCCCACTCAG

正向：TTGATGCAACTTTCTGCC

33AY942824220-32050反向：

ATGTGATTGTTAGAATGAACTT

正向：

CGAGGAAGAGGAAGATTATGAC

34AY942825240-39053

反向：

CGAATACCATCCAGCAAAATAC

正向：TGTGAAATGGAAGGTTGAG

35AY94282624050

反向：ACAGCAATCGTTGCATTC

36AY942827180-24049正向：

序引物退

条带大

号引物名称火温度引物序列(5'-3')

小(bp)

(℃)

GTTTTCATTCTCAAAATGTGTG

反向：

CTTTCATGTTCATAGATGCAA

正向：CTCGCATTTCTCGCAGTC

37AY942828130-29053

反向：TCCCTCCATTTAACCCTCC

正向：GAACGAGAAATCGGGAAC

38AY942829370-50050

反向：GCAGCCATTGAATACAGAG

(一)XX益谱检测技术有限公司

表2聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的6个品种芒果与19对引物

序芒果品引物名

序号引物名称

号种名称称

桂热芒

AY94281

107-311AY942828

8

号

桂热芒AY94282

212Lmmal

290号3

AY94281

3金煌芒13Lmmal5

9

AY94282

4圣心14Lmmal3

0

AY94282

5台农15Lmma9

1

AY94282

6桂七16Lmmal1

7

AY94282

717Lmmal2

9

AY94282

818Lmma4

4

AY94282

919Lmma5

5

AY94282

10

6

表3聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的20个品种与19对引物

芒果品种名

序号引物名称

称

桂热芒07-2

1mangoES39

口

桂热芒07-3

2mangoES40

号

桂热芒08-10

3mangoES126

号

桂热芒10-1

4mangoES170

号

桂热芒16-1

5mangoES69

号

6桂热芒285号Lmma7

7桂热芒290号LmmalO

8二转MCR55

9PULMERmangoES24

10安宁红芒mangoES35

ALdrr

12桂热芒10号mangoES172

13圣心MCR130

14桂热芒82号Lmma6

15桂热芒60号Lmma8

16桂热芒4号EST14

17泰国芒14号MCR220

桂热芒08-6

18Lmmal6

号

19台农mangoESll

20桂七

（二）XX作物遗传改良生物技术重点开放实验室和南宁国拓

生物科技有限公司

表4聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的6个品种与38对引物

序芒果品引物名

序号引物名称

号种名称称

桂热芒

AY94281mangoESl

107-320

81

号

桂热芒AY94282mangoES2

221

290号34

AY94281mangoES3

3金煌芒22

95

AY94282mangoES3

4圣心23

09

AY94282mangoES4

5台农24

10

AY9428225mangoES6

6桂七

79

AY94282mangoES7

726

91

AY94282mangoESl

827

426

AY94282mangoESl

928

570

AY94282mangoESl

1029

672

11AY9428230EST14

8

12Lmmal31MCR220

13Lmmal532MCR55

14Lmmal333MCR130

15Lmma934Lmma6

16Lmmal135Lmma7

17Lmmal236Lmma8

18Lmma437Lmmal0

19Lmma538Lmmal6

一、毛细管电泳

XX益谱检测技术有限公司、XX作物遗传改良生物技术重

点开放实验室、南宁国拓生物科技有限公司均选择6个芒果品

种，6对引物，每个品种分别做6对引物的毛细管电泳，品种

名称及引物名称如下表6：

表5毛细管电泳验证所用的6个芒果品种与6对引物

序芒果品种名称引物名称

号

1桂热芒07-3号mangoES39

2桂热芒290号mangoES126

3金煌芒mangoES172

4圣心Lmmal6

5台农AY942819

6桂七AY942820

2.6.1样品采集

用不锈钢剪刀采集种植的已知品种的芒果嫩叶放入塑料

样品袋中，做好标识，放入0-8℃保温箱中，带回实验室，于

-18℃冰箱中保存备用。

2.6.2DNA的提取

取2.6.1中适量芒果叶片用自来水冲洗干净，再用去离子

水冲洗两遍，自然晾干后用不锈钢剪刀剪碎放入研钵中，加入

液氮研磨成粉末状，分取lOOmg放入1.5mL离心管中，加入

750HLeTAB提取溶液，涡旋振荡混匀后于65°。水浴

45nlin~60nlin,期间每隔15min颠倒离心管混匀；加入500ML

的三氯甲烷，颠倒混匀，12000rpm离心3min,转移上清液

约0.5mL至新离心管中，加入等体积即0.5mL预冷至约4℃的

无水乙醇，颠倒混匀，T8C冰箱下静置lh,12000rpm离心

3min,去上清，室温下干燥沉淀。加入50叱无菌纯水于-18℃

中保存备用。

注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达至UPCR扩增质

量要求的DNA提取方法也适用于本规程。

2.6.3PCR扩增

2.6.3.1PCR反应体系

PCR反应体系见表7。

表6PCR反应体系

二十京II奴欣曲彳木大口

j1/是19由7kQ二ill

QTanTacP111a1V19Kill

1A1Jmn1/TIP1n1已1Azlllmcl/T1Alli

1flUmcl/]FV7Iri1已1A41Imcl/11HlJl

/illBMA精木后QAnrr/III9nuT

日侏和2AAlli

2.6.3.2PCR反应程序

94℃预变性5min；94℃变性30s,退火30s（退火温度见

表1推荐引物表），72℃延伸30s,35个循环；最后72℃下延

伸7min。

2.6.4PCR产物检测

2.6.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

2.6.4.1.1聚丙烯酰胺凝胶制备

在一对玻璃板间插入1.0mm宽的间隔片，在封口处注入1%

琼脂糖溶液，让其凝固密封。在50mL量杯中依次加入7.5mL5

XTBE缓冲液,7.5mL40%Acryl/BisSolution（29:1）,搅拌

并用纯净水定容至30mL；加入200NL10%过硫酸镂和12HL四甲

基乙二胺溶液，混匀后倒入凝胶板之间，随即插好样品梳，使

其在50n）irT60min内聚合凝固，凝胶高度应不小于10cm。

2.6.4.1.2电泳

将玻璃板固定于垂直电泳槽上，在电泳槽中加入电泳缓冲

液，小心拔下样品梳。用加样器吸取1叱不同引物（表1）PCR

产物，加入样品孔中，同时在同一块胶中加入1ALDNAmarker。

电泳选用的电压梯度为l~5V/cm,2XTaqPlus预混试剂的蓝

色指示带从上到下分别到达胶板1/2、2/3处（大约lh）后结束

电泳。

2.6.4.1.3银染显色

将附着凝胶的玻璃板用去离子水冲洗30s〜60s后,将凝胶

放入方形不锈钢盘中，加入染色液覆盖凝胶，轻摇5min^l0min

进行染色；倒掉染色液，用去离子水快速漂洗，放入显色液中,

轻摇至显色出清晰带纹；取出凝胶用去离子水冲洗两遍，沥干

后进行拍照。

2.6.4.2毛细管电泳检测

2.6.4.2.1PCR产物样品准备

分别取等体积的稀释后不同引物（表5）PCR扩增产物溶液

混合，从混合液中吸取1应按序号加入到DNA分析仪专用96孔板

孔中，板中各孔分别再加入0.1MLDNALIZ500分子量内标和

8.9叱去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min,取出，

迅速置于碎冰块上，冷却10-15min。将整个96孔板置于离心机

中，离心10s后放置到DNA分析仪上待检。

2.6.4.2.2电泳检测

按照仪器操作规程，编辑样品表及运行程序，执行运行

程序，仪器自动给出检测结果，保存并记录数据。

2.7数据记录与统计

样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段长度的形式表

示。对于毛细管电泳检测方法，通过使用对照品种，消除同型

号不同批次间或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差，

使用片段分析软件读取待检样品在该位点的等位变异。对于非

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法，将每个扩增位点的等位变

异与相应的对照品种的等位变异片段大小进行比较，确定待检

样品在该位点的等位变异。

纯点结合的等位变异大小数据记为X/X,其中X为该位点等

位变异的大小；杂合位点的等位变异大小数据记录为X/Y,其

中X、Y分别为该位点上的2个等位变异的大小，小片段数据在

前、大片段数据在后。缺失位点在等位变异大小数据记录为

0/0o

示例L样品在某个位点上仅出现1个等位变异，大小为

160bp,则该位点的等位变异数据记录为160/160。

示例2：样品在某个位点上仅出现2个等位变异，大小为

160bp>165bp,则该位点的等位变异数据记录为160/165。

2.8判定方法

当待检样品和对照品种间差异位点数22,则判定为“不

同品种”；当待检样品和对照品种间差异位点数二1,判定为

“近似品种”；当样品间差异位点数加，判定为“极近似

品种或相同品种”。

2.9结果与记录

2.9.1用琼脂糖凝胶检测毛细管电泳和非变性聚丙烯酰胺凝

胶电泳，结果见附件原始记录图谱。

2.9.1.1xx益谱检测技术有限公司结果原始记录图谱（见附

件1）

2.9.1.2xx作物遗传改良生物技术重点开放实验室结果原始

记录图谱（见附件2）

2.9.1.3南宁国拓生物科技有限公司结果原始记录图谱（见附

件3）

四、制定标准的原则和依据，与现行法律、法规的关系，与

有关国家标准、行业标准的协调情况。

本标准的编制依据现行的法律、法规和国家强制性标准,

与这些文件中的规定不存在矛盾，协调一致。

五、重大意见分歧的处理结果和依据

无

六、提出标准强制实施或推荐实施的建议和理由

本项标准的制订，已经实验室的验证，可作为推荐性地方

标准，用于芒果种质资源真伪的检测。

附件1:

XX益谱检测技术有限公司结果原始记录及图谱

1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

图1.不同芒果品种SSR扩增产物电泳结果

备注：芒果品种顺序依次为：桂热芒07-3号、桂热芒290号、金煌芒、圣心、台农、桂七

引物名称：1-6:AY942818,7-12:AY942823,13-18:AY942819,19-24:AY942820,25-30：

AY942821,31-36:AY942827,37-42:AY942829。

11*■1wBVWIB1Bwl■1aWBVA14I

M123456789101112131415161718M1920xx222324252627282930313233343536373839404142

-500

-400

-350

-300

-2SO

-200

-150

-100

-50

图2.不同芒果品种SSR扩增产物电泳结果

备注：芒果品种顺序依次为：桂热芒07-3号、桂热芒290号、金煌芒、圣心、台农、桂七

引物名称：1-6:AY942824,7-12:AY942826,13-18:AY942825,19-24：AY942828,25-30：

Lmmal,31-36：Lmmal5,37-42：Lmmal30

23456789101112131415161718192021222324252627282930

图3.不同芒果品种SSR扩增产物电泳结果

备注：芒果品种顺序依次为：桂热芒07-3号、桂热芒290号、金煌芒、圣心、台农、桂七

引物名称：l-6:Lmma9,7-12：Lmmal2,13-18：Lmmal1,19-24：Lmma4,25-30：Lmma5o

M1234567891011121314151617181920

图4.不同芒果品种SSR扩增产物电泳结果

备注：芒果品种编号1-20顺序依次为：桂热芒07-2号、桂热芒07-3号、桂才芒08-10号、

桂热芒10T号、桂热芒16-1号、桂热芒285号、桂热芒290号、三年芒、PUNIER、安宁红

芒、金煌芒、桂热整10号、圣心、桂热芒82号、桂热芒60号、桂热奢答国芒14号、

桂热芒08-6号、台农、桂七

引物名称：mangoES39

图5.不同芒果品种SSR扩增产物电泳结果

备注：芒果品种编号卜20顺序依次为：桂热芒07-2号、桂热芒07-3号、桂热芒08To号、

桂热芒10T号、桂热芒16-1号、桂热芒285号、桂热芒290号、三年芒、PULMER、安宁红

芒、金煌芒、桂热芒10号、圣心、桂热芒82号、桂热芒60号、桂热芒4号、泰国芒14号、

桂热芒08-6号、台农、桂七

引物名称：mangoES40

HE〃即

M123456789101112131415^1617181920

图6.不同芒果品种SSR扩增产物电泳结果

备注：芒果品种编号L20顺序依次为：桂热芒07-2号、桂热芒07-3号、桂热芒08To号、

桂热芒10T号、桂热芒16-1号、桂热芒285号、桂热芒290号、三年芒、PULMER、安宁红

芒、金煌芒、桂热芒10号、圣心、桂热芒82号、桂热芒60号、桂热芒4号、泰国芒14号、

桂热芒08-6号、台农、桂七

引物名称：mangoES126

M1234567891011121314151617181920

H35O

图7.不同芒果品种SSR扩增产物电泳结果

备注：芒果品种编号1-20顺序依次为：桂热芒07-2号、桂热芒07-3号、桂热芒08To号、

桂热芒10T号、桂热芒16-1号、桂热芒285号、桂热芒290号、三年芒、PULMER、安宁红

芒、金煌芒、桂热芒10号、圣心、桂热芒82号、桂热芒60号、桂热芒4号、泰国芒14号、

桂热芒08-6号、台农、桂七

引物名称:mangoES170

WI1尸"川引碎

M1234567891011121314151617181920

备注：芒果品种编号1-20顺序依次为：桂热芒07-2号、桂热芒07-3号、桂热芒08-10号、

桂热芒10T号、桂热芒16T号、桂热芒285号、桂热芒290号、三年芒、PULMER、安宁红

芒、金煌芒、桂热芒10号、圣心、桂热芒82号、桂热芒60号、桂热芒4号、泰国芒14号、

桂热芒08-6号、台农、桂七

引物名称：mangoES69

图9.不同芒果品种SSR扩增产物电泳结果

备注：芒果品种编号L20顺序依次为：桂热芒07-2号、桂热芒07-3号、桂热芒08To号、

桂热芒10T号、桂热芒16-1号、桂热芒285号、桂热芒290号、三年芒、PULMER、安宁红

芒、金煌芒、桂热芒10号、圣心、桂热芒82号、桂热芒60号、桂热芒4号、泰国芒14号、

桂热芒08-6号、台农、桂七

引物名称：Lmma7

图10.不同芒果品种SSR扩增产物电泳结果

备注：芒果品种编号1