遗传工程课件

遗传工程一遗传工程的概念1广义：包括基因工程，细胞工程，染色体工程，细胞器工程等。2狭义：基因工程：按照人们预先设计的方案，借助于实验室技术，将一种生物的基因或基因组转移到另一种生物细胞中去，并使后者定向地获得新的遗传性状，从而使生物基因组得到改造的技术。

基因工程的基本步骤（主要）（1）

准备材料：目的基因，载体和工具酶等。（2）

目的基因与载体结合形成重组DNA分子。（3）

重组DNA分子引入受体细胞，并克隆。（4）

筛选目的基因在受体细胞能够正确表达的无性繁殖系。二基因工程的操作（一）目的基因的分离1鸟枪法（SHOTGUN）鸟枪射击法将含有目的基因的基因组DNA，用适当的限制性内切酶切割成片段，再与载体进行体外重组，（质粒，或酵母人工染色体）形成重组DNA分子，转化到大肠杆菌，形成基因文库，然后用探针钓取目的基因。目前也有的用mRNA分离法，转座子示踪法及T-DNA插入突变法和图谱克隆法。2化学合成法根据DNA碱基互补原则（根据）按照目的基因的核苷酸顺序，利用连接酶，将单核苷酸或寡核苷酸片段一个个地连接起来，配成双链。（二）载体与工具酶1载体A.要求能独立自我复制，拷贝数较多。B.有多种限制酶的酶切位点，每种E最好只有一个切点，（酶切后）插入外源DNA后不影响其自我复制能力及选择标记基因。C.具有作为重组DNA分子的选择的遗传标记。质粒是一种细菌染色体以外的遗传单元，如F因子，R因子，colE1因子等噬菌体也是一种好的载体，如入噬菌体（50kb）病毒

SV40寄生在灵长类的细胞中的一种病毒，具有自我复制及整合能力的DNA分子，一直被认为是动物基因工程的理想载体。工具酶限制性内切酶根据限制性内切酶的切割特点进行分类，可分为两类:割部位无特异性的酶，能切断DNA分子中双链，需要ATP，Mg++，S-腺苷甲硫氨酸等辅助因子。例如，EcoB和EcoK，由于切割部位不固定.切割部位具有特异性的酶，能切断双链，能识别特定的碱基序列，切割部位具有特异性，需要Mg++作辅助因子，是遗传工程中采用最多的一种酶。EcoRI，嗜血杆菌的HindⅢ这一类切内酶多数具有粘性未端.

（三）重组DNA分子的构建若目的基因和载体基因采用同一种能产生粘性未端的切内酶切割，二者具有互补的粘性末端，采用DNA连接酶（T4DNA连接酶）连接起来。平齐未端的连接，采用末端核苷酸转移酶，在末端添加单核苷酸，在一个DNA片段上添加多聚T，另一个片段上添加多聚A，从而使二者粘性末端互补，再通过连接E连接起来。（四）外源DNA引入受体细胞进行克隆

及筛选DNA理化转移方法（无载体基因工程）主要方法有：

A.PEG（聚乙二醇）法，使DNA沉淀，剌激细胞内摄，原生质体无损伤，通过重组整合实现转化。B.电融合法，电脉中使原生质膜产生瞬时孔洞，使DNA进入细胞。C.微注射法，在显微镜下，用玻璃毛细管直接将DNA注射到受体核内。D.基因枪法，是将DNA附着在钨弹或金弹粒子（1-3μm）表面，借助爆炸力或电子冲击波打入细胞。E.碳化硅纤维介导DNA法。F.花粉管通道法，指植物授粉2-24小时，外源DNA能沿尚未关闭的花粉管通道进入细胞。载体法

重组DNA引入受体细胞，因所用载体不同而采用不同的方法。以质粒为载体——转化，而以噬菌体为载体——转染，但二者无本质的区别，都是把外源DNA导入受体细胞。成功的关键有三个条件A外源DNA必须是双链。B合适的受体细胞。C感受态的受体细胞。同时要求外源DNA要有一定的浓度。CaCl2和热击处理（42-45℃）。

重组体的选择主要是通过选择标记基因进行筛选，如大多数载体都带有抗药性的选择重组体。而目的基因是否存在，还要通过探针进行原位分子杂交来加以选择。（五）基因的表达

选用适宜的启动子如植物基因工程中应用较好启动子主要有CaMV35S（花椰菜花叶病毒）玉米Adh-1，果蝇copia等。目的基因整合位置和方向也与表达有关。三植物细胞工程