Box-Behnken模型优化榕树须多酚提取工艺及抗氧化活性

摘要为综合开发榕树须的利用价值，本实验以榕树须为原材料，通过单因素试验进一步设计Box-Behnken模型，优选出提取榕树须多酚的最佳工艺，并以铁离子还原/抗氧化能力（Ferricionreducingantioxidantpower，FRAP）法和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical，DPPH）自由基法评价了抗氧化活性。根据Box-Behnken模型实验数据的结果显示，当实际操作乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度分别调整为70%、50:1mL/g、40min、60℃时，3次平行验证试验得到多酚提取率平均值为4.39%（RSD为1.33%），与Box-Behnken模型的预测值相近。此条件下提取液总抗氧化能力为0.218mmol/L（FeSO4当量值），而0.3mg/mL提取物的DPPH自由基清除率可达到89.4%，这表明榕树须提取液中可展现出好的抗氧化活性，可为榕树须药用价值的进一步开发提供参考。引言榕树须是桑科（Moraceae）榕属（Ficus）植物小叶榕（Ficusmicrocarpa）的气生根，主要分布在广西、江西、贵州、浙江、福建等地。榕树叶的药用价值在止咳类中成药等方面的研究已受到广泛关注，但榕树须常被用来做造景素材，其多种药效作用却鲜有人知，可主治百日咳、麻疹不透、风湿骨痛、痧气腹痛、胃痛、湿疹、跌打损伤等，具有散热祛湿、活血止痛、化痰止咳等效用。榕树须化学成分主要有萜类、黄酮类、多酚类等。陈敬民等发现榕树须水或醇提物的石油醚洗脱部位均具有一定的抗血栓作用。作为榕树须中有效成分之一的多酚类化合物的工艺提取仅做了简单的研究。植物多酚又称为植物单宁或植物鞣质，被广泛地认为是植物体内一种具有多元酚羟基结构的次级代谢产物，主要经过丙二酸和莽草酸的途径合成。由于多酚具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性，已被广泛用于预防口腔感染、降血糖、降血压、神经保护和预防心血管疾病等产品中。研究表明植物多酚还可以改善胃肠功能、做生物保鲜剂及污染物控制等。另外，一些研究者还利用多酚或富含多酚的植物提取物参与制取具有多功能特性的多酚-金属纳米材料。由于超声提取方法具有快速、简便、仪器成本低、提取效率高、有效成分活性不被破坏等技术优势。因此，本实验采用超声辅助提取榕树须中多酚，经单因素和响应面设计试验筛选提取榕树须中多酚的最佳工艺，探索提高其多酚类化合物效率的条件，同时用FRAP法和DPPH法对榕树须中多酚的抗氧化活性进行研究，为进一步探讨榕树须中的药效物质关系提供科学依据。

正文部分1

实验部分1.1

主要仪器与试剂1.2

实验方法1.2.1

榕树须多酚提取工艺流程1.2.2

榕树须多酚的测定1.2.2.1

标准曲线制作精密称定0.2500g没食子酸对照品，加蒸馏水溶解，转移到500mL量瓶，定容到刻度，得0.5mg/mL没食子酸对照溶液。1.2.2.2

多酚含量的测定1.2.3

单因素试验设计1.2.3.1

乙醇浓度时试验条件考察称取0.5g榕树须粉末5份于具塞比色管中，固定液料比30:1（mL/g）、超声时间30min、超声温度30℃，分别测定30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇浓度时榕树须中多酚的提取率。1.2.3.2

液料比时试验条件考察称取0.5g榕树须粉末5份于具塞比色管中，固定乙醇浓度60%、超声时间30min、超声温度30℃，分别在20:1、30:1、40:1、50:1、60:1和70:1（mL/g）的液料比下测定榕树须中多酚的提取率。1.2.3.3

超声时间时试验条件考察称取0.5g榕树须粉末5份于具塞比色管中，固定乙醇浓度60%、液料比60:1（mL/g）和超声温度30℃，分别测定在15、30、45、60、75、90min的超声时间时榕树须中多酚的提取率。1.2.3.4

超声温度时试验条件考察称取0.5g榕树须粉末5份于具塞比色管中，固定乙醇浓度60%、液料比60:1mL/g和超声提取温度时间30min，分别测定在20、30、40、50、60、70℃的超声温度时榕树须中多酚的提取率。1.2.4

响应面试验设计根据单因素试验结果，以榕树须多酚提取率影响较大的水平作为参考。分别在单因素实验结果的基础上进行Box-Behnken试验设计，见表1。1.2.5

总抗氧化测定由10mmol/LTPTZ盐酸溶液、20mmol/LFeCl3溶液和pH3.6的300mmol/LNaAc-HAc缓冲溶液按照1:1:10的体积比配制，即得FRAP工作液，置于37oC水浴中备用。1.2.6

DPPH法抗氧化性测定2

结果与讨论2.1

单因素实验2.1.1

乙醇浓度对榕树须中多酚提取率的影响2.1.2

液料比对榕树须中多酚提取率的影响根据图2所示，液料比在20:1～60:1mL/g之间，榕树须多酚提取率呈上升趋势；液料比继续增大，榕树须多酚提取率随之下降。2.1.3

超声提取时间对榕树须中多酚提取率的影响2.1.4

超声提取温度对榕树须中多酚提取率的影响2.2

响应面实验结果分析2.2.1

响应面实验设计及结果2.2.2

Box-Behnken试验回归模型的建立及方差分析2.2.3

响应面试验中交互项作用分析响应面试验中两因素交互项3D图曲面的变化和等高线的变化见图5，3D曲面图坡度变化越陡峭，等高线越密集且呈椭圆形或马鞍形时，表示两因素之间交互作用越显著[29]。2.2.4

工艺优化条件验证2.3

总抗氧化性测定结果2.4

DPPH法抗氧化性测定结果3结论结论为了挖掘榕树须的实际应用价值，本研究先经过单因素试验优化的结果，确定Box-Behnken模型的因素与水平组合，后据响应面试验优化的结果，得到榕树须多酚最佳提取条件：乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度分别为70%、50:1（mL/g）、40min、62.25℃。在上述的工艺条件下，榕树须多酚提取率