核医学检验技术：第二章 标记免疫反应分析

第二章标记免疫反应分析定义标记免疫反应分析是指在体外条件下，将已知抗体（抗原）标记上示踪物质（标记物），以免疫结合反应为基础，通过检测标记物来反映有无抗原抗体反应，从而间接测定生物样品中生物活性物质含量的一类分析方法特点

该分析法将抗原抗体反应的高特异性和标记物检测的高灵敏性有机结合，实现了对机体内超微量生物活性物质的检测分类

按反应机制的不同，主要分为竞争法免疫反应和非竞争法免疫反应第一节竞争法免疫反应一、基本原理一定量的标记抗原与非标记抗原

与有限量的特异抗体发生可逆性的竞争性结合反应。反应平衡后分离出抗原抗体复合物，通过测量标记复合物量来计算出非标记抗原量。如：放射免疫分析法1、反应体系中Ab是限量的，且一般为多克隆抗体2、Ag*、Ag免疫化学性质相同，对特异性Ab具有相

同的结合及竞争力3、Ag*及Ab的量保持恒定，且Ag*+Ag大于Ab的有效

结合位点4、Ag*Ab复合物的形成受Ag量的制约，随着Ag浓度

的增加，Ag*Ab复合物形成减少二、技术条件三、技术特点1、待测抗原一般为小分子抗原或半抗原2、标记物所标记的物质通常为抗原3、反应体系中，标记抗原和未标记抗原之和始终大

于加入的抗体量4、通过竞争反应模式，求得待测抗原的含量5、待测Ag量与Ag*Ab量成反比函数关系6、加样误差对结果影响大7、待测抗原在低浓度时结果稳定性和灵敏度相对较

好，而高浓度时则相反第二节非竞争法免疫反应在反应系统中加入过量的标记抗体(*Ab)，使未标记抗原（标准抗原或待测抗原,Ag）与其进行全量反应，形成抗原-抗体复合物。反应平衡后分离出Ag-*Ab复合物并检测活性，通过与标准曲线计算出非标记抗原的量如：双抗体夹心法一、基本原理Ag+*AbAg*Ab+*Ab1、反应体系中特异性Ab*始终是过量的，

能结合全部待测抗原（特殊情况除外）2、所用抗体一般为单克隆抗体二、技术条件三、技术特点1、待测抗原一般为大分子抗原2、标记物所标记的物质通常为抗体3、反应体系中所加标记抗体的量始终大于抗原含量。4、待测Ag量与AgAb*量成正比例函数关系5、加样误差对结果影响仅来自标本加样6、待测抗原在低浓度时结果稳定性和灵敏度相对较

差，高浓度时则相反7、测定结果的灵敏度、稳定性和检测线性范围明显

优于竞争法第三节标记免疫分析技术

一、标记免疫分析的技术优势1、特异性强：具有良好的特异结合试剂，能识别化学结构上非

常相似的物质，甚至能识别立体异构体，能准确测定生物活性

物质的亚单位浓度。2、灵敏度高：可检测水平为10-9~10-15g。一般化学分析法检测

极限为10-3~10-6g。3、稳定性好，精密度高：结果可重复性好。4、准确度高：与真实值的差异小。5、应用广泛：目前至少有300多种生物活性物质的检测可应用

标记免疫分析法。如：激素、蛋白质、抗体、免疫球蛋白、维

生素及药物等。

二、标记免疫分析的不足

1、被检测物(抗原)超微量

稳定性（包括校准品、标记物的稳定性）理化性质（肽类、氨基酸类、蛋白质、糖蛋白类、

类固醇类、核酸类）抗原性表位数量异质性（个体差异）标准品（统一性）受制因素：

标记技术

免疫技术抗体选择的差异

分离技术来源位点种属单克隆、多克隆特异性效价亲和力2、抗体3、标记物吖啶酯发光（分子量：590）异鲁米诺发光

（分子量：177）电化学发光三联吡啶钌（分子量：748）酶促化学发光碱性磷酸酶分子量（56KD）125I(原子量：125）

磁微粒法

直接法(双抗体夹心法采用)间接法(竞争法、夹心法采用)生物素/链亲和素-微粒:FITC/antiFITC-微粒：4、分离技术自身抗体氧化剂还原剂光线磁场金属离子防腐剂杂质血小板药物5、干扰因素1、充分血凝2、充分离心常见干扰因素A、针对待测抗原的自身抗体自身抗体干扰通常会导致错误的测试结果抗甲状腺的自身抗体（即TSHAb或T4Ab）通过胎盘都有可能干扰新生儿激素检测用竞争法检测FT3、FT4时，T4Ab、T3Ab可引起假阳性结果甲状腺激素自身抗体的患病率在一般人群中接近2％自身免疫性甲状腺疾病或其他自身免疫疾病的患者中可能高达30％造成错误的高值结果B、嗜异性抗体（HA）人抗小鼠抗体(HAMA)，流行率为30-40％类风湿因子(RF)最近接受疫苗注射、输血或单克隆抗体治疗以及接触动物的患者干扰主要影响使用鼠源单克隆抗体的非竞争性免疫测定法（夹心法）造成错误的高值结果C、链霉亲和素或生物素治疗或摄入大剂量生物素或链霉亲和素甲状腺试剂组分含链霉亲和素、生物素的容易受到干扰FT3\FT4假性升高，TSH假性降低*AgAg+Ab1*AgAb1AgAb1+Ab2*AgAb2AgAb21、PEG分离法：结果降低2、二抗分离法：结果升高3、固相一抗分离法：结果升高分析：

自身抗体对结果的影响（竞争法）“干扰因素存在”判别思维要点判断及证实“存在”很重要沟通：临床、检验、患者当患者的临床表现与检测结果之间不一致时，应首先怀疑自身抗体所造成的干扰存在基础性疾病、妊娠、治疗过程竞争法受影响程度明显大于夹心法实验验证方法：（1）标本连续稀释，观察检测浓度有无线性改变（2）标本中加入标准品进行回收试验6、生产厂商因素很大程度上，厂家仪器、试剂质量决定了临床检验质量7、激素测定影响因素总结昼夜节律性：F、ALD、瘦素、GH、肾素、IGF-1患者状态：情绪、应激、运动、体位脉冲式分泌：大多数激素肝肾功能不全：性激素性别、年龄自主神经系统：肾上腺髓质激素、胃肠激素、胰高素标本的保存与处理：分子量（催产素、血管紧张素）抽血时间与方式：固定时间，留置针自生抗体干扰：TGAb、INS-Ab、T4-Ab第四节标记免疫分析技术性能评价一、分析性能评价指标1、精密度（precision）2、准确度（accuracy）3、灵敏度（Sensitivity）即能从生物样品中检出某物质的最小浓度。4、稳定性（Constancy）是体外诊断试剂随着时间推移保持其特性一致

性的能力。5、特异性（Specificit）常用交叉反应率（%）来表示。6、临床可报告范围临床可报告范围（clinicalreportablerange，CRR）是指对于超

过分析测量范围（analyticalmeasurementrange，AMR）的分

析物，允许应用样本稀释、浓缩和预处理分析方法测定样本中分析

物的真实准确的浓度。二、临床诊断性能评价指标（临床有效性）1、临床有效性是指一个测定项目完成临床目的的程度。2、方法：

检测方法建立进行临床观察确定待测物质参考值范围

评价ROC曲线统计假阳性率和假阴性率

3、ROC曲线以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（1－特异度）为横坐标，将相对应的各个临界值连接起来的曲线图。

通过分别计算各个试验的ROC曲线下的面积（areaunderthecurve，AUC）进行比较，AUC最大的试验，则其诊断效率最佳。在AUC＞0.5时，越接近1，说明诊断效果越好。AUC在0.5~0.7时有较低的准确性；AUC在0.7~0.9时有一定的准确性；AUC在0.9以上时有较高的准确性；AUC=0.5时，说明该诊断试验完全无用。第五节临床应用一、本章小结二、案例分析某省室间质控结果汇总，根据标记兔疫反应定量分析技术的优势和不足，从中如何进行评价？项目名称所在组（化学发光）10年数据均值CV18年数据均值CVCA199A公司24342.1114.2841178.3311.87B公司699.0235.362283.7510.56C公司2095.0255.395158.695.66D公司5779.339.213152.378.88AFPA公司