如何在CAR-T临床制备与应用中优化疗效

目前，CAR-T疗法已经在血液恶性肿瘤方面取得了成果，但在实体瘤上还面临着相当大的挑战。这种对实体瘤疗效不佳的原因可能包括已知的肿瘤特异性抗原数量有限、T细胞在到达肿瘤部位之前的持久性和适应性有限、实体瘤渗透性差和免疫抑制肿瘤微环境（TME）而影响CAR-T疗效的参数也有很多，包括靶点、CAR结构、剂量等。CAR-T和其他过继性疗法（ACT）的早期研究和临床试验主要集中在细胞剂量上，而没有描述T细胞的特定表型。不过，T细胞疗法通常由众多在参数上不同的异质细胞组成，如记忆分化特征、活化和耗竭状态、细胞因子释放特征等。这些变量中的任何一个都会影响T细胞的功能，包括靶向和迁移到肿瘤的能力、细胞因子释放、细胞溶解活性等。一、CAR-T疗法优化方向1.1记忆T细胞潜能CAR-T治疗效果的一个关键参数是转移性T细胞的记忆潜能。在抗原刺激后，初始T细胞（NaiveTcell，TN）迅速分裂（一周内高达50000倍）为记忆T细胞和效应T（Teff）细胞，以清除被感染的细胞。其中，记忆T细胞包括几种亚型：干细胞记忆T（TSCM）细胞、中央记忆T（TCM）细胞和效应记忆T（TEM）细胞，依次分化程度越高，增殖潜力降▲不同表型细胞特性（图片来源：参考资料1）临床前研究表明，经过基因工程改造能够特异性靶向肿瘤的T细胞群中，含有较高比例的TN和TCM会增强抗肿瘤功效。在CAR-T细胞疗法中也观察到了相似的趋势，较高比例的TN、TSCM、TCM细胞在动物模型、患者来源的样本和临床试验中均能够有效提高抗肿瘤疗效，这可能与这些细胞较Teff而言具有更高的增殖潜力有关，这样能够保持更好的持久性和达到峰值反应时更高的细胞数。此外，这些细胞群能够释放更高水平的抗肿瘤细胞因子，具有较高的活化标记（如CD28）表达和较低的耗竭标记（如TIGIT、LAG3、PD-1）的表达。一般来说，T细胞的分化在很大程度上是线性和单向的，将T细胞阻滞在早期分化阶段可能是诱导更有效和持久的抗肿瘤反应的方法。根据细胞表面标记物以及培养基存在的细胞因子分析可以用于选择出某种类型的记忆细胞，其中后者可以通过采用在培养基中加入磷酸肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂来实现，这也是临床上最先进的方法之一。BMS研发代号为bb21217的BCMACAR-T疗法采用的就是这个策略，相较于其Abecma产品而言，bb21217富集了更多记忆型CAR-T细胞，有望使得患者达到更好的预期。不过，考虑到在没有PI3K抑制剂的情况下，BCMACAR-T疗法在MM中的总体有效率很高，且Abecma已顺利获批，要将bb21217进行临床转化以及证明其临床改善具有挑战性，故而BMS和2seventyBio宣布不再做进一步开发。1.2CD4:CD8比率最终T细胞产物的CD4:CD8比率被认为是治疗效果的关键。CD4+T细胞对于激活和维持细胞毒性T细胞、诱导记忆反应有重要作用；CD8+T细胞的增殖能力较CD4+T强。CD4:CD8比例平衡的CAR-T疗法共定位能力增强，总体抗肿瘤反应增强。这种协同作用可能是由肿瘤部位的CD4+T细胞分泌的Th1细胞因子引发的。有临床研究发现，平衡的CD4:CD8比例既能够增加完全缓解率，同时使用的细胞剂量减少5-100倍。Breyanzi就是以固定的CD4:CD8比率制造的，通过交叉试验比较，该产品的应答率与其他抗CD19CAR-T细胞产品相当，但细胞因子释放综合征（CRS）水平较低。1.3优化患者预处理方式T细胞输注之前用淋巴细胞靶向剂如环磷酰胺（Cy）、氟达拉滨（Flu）、抗CD52抗体或苯达莫司汀进行预处理是ACT增殖和植入的必要条件。目前的预处理标准是Flu和Cy组合，大约从ACT输注前5天开始。但这些药物的给药差异或替代药物的使用是否会改善CAR-T的活性和毒性仍在研究当中，在一项回顾性分析中，接受tisagenleucel治疗的患者以使用Flu和Cy作为对照组，发现使用苯达莫司汀具有相同效果，但毒性有所改善。此外，预处理还具有其他有益作用，包括对肿瘤微环境（TME）的直接影响，有可能通过重塑TME与ACT的协同作用，以获得更好的T细胞浸润和更强的抗肿瘤反应。在研发CAR-T疗法的同时，通过优化预处理方案或许能够取得更加理想的效果。1.4优化激活信号1/2/3目前的ACT的制造依赖于来自患者的分离的T细胞的离体激活和扩增，T细胞激活需要三个信号：T细胞受体结合（信号1）、与共刺激分子结合（信号2）、引导和扩增T细胞分化和扩增的细胞因子（信号3）。这三种信号都在控制T细胞的表型和功能方面发挥着至关重要的作用。优化ACT的策略包括调控这三个关键信号、调节下游信号通路等。可溶性激动性抗体和人工抗原呈递细胞（APC）常用于提供信号1和2。有研究表明，CD3/CD28抗体能够诱导更高的T细胞受体表达和增强肿瘤杀伤作用；构建人工APC的材料会影响T细胞受体，其大小和形状会影响CAR-T细胞的生产。此外，还有多种药物被探索作为刺激分子，如4-1BB刺激能够延长CD27和CD28表达，能够优先扩增抗原反应性记忆细胞，诱导更多细胞溶解，延长T细胞持久性，与CD3/CD28共刺激联合时，可以保留TCM▲信号1和2（图片来源：参考资料1）除了在培养基中添加可溶性激动性抗体外和使用人工APC外，已经开发出了寡核苷酸适配体，并被证明可以有效激活T细胞，这些适配体提供了一种潜在的更便宜、更容易制备的抗体替代方案，并被开发用于靶向其他共刺激信号通路。T细胞的扩增和分化可以通过多种细胞因子介导，其中细胞因子受体γ链(γc）家族是研究最广泛的细胞因子之一，包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-21等，具有调节先天性和适应性免疫系统，共同促进各种免疫细胞群发展的作用。而非γc细胞因子也已被发现会影响CAR-T功效。优化体外T细胞制造的细胞因子数量、组合能够或许是提高CAR-T有效性的一个方1.5调节下游信号通路通过控制T细胞激活信号下游的信号通路可以直接调节T细胞表型，这一策略主要针对PI3K–AKT–mTOR、Notch、WNT–β-catenin、MAPK/ERK等主要通路和T细胞代谢。阻断PI3Ks、AKT1/2和mTOR，调节mTORC1的PIM激酶都已被证明能够产生具有TSCM和TCM细胞特性的肿瘤反应性T细胞，增强抗肿瘤毒性。针对信号通路的调节，可以在培养基中添加对应物质以重编程T细胞代谢，如加入L-精氨酸增强T细胞存活和抗肿瘤活性，添加醋酸盐可以增强乙酰化作用，在T细胞处于激活状态时增强效应器功能。不过在调节下游信号通路的途径中可能会涉及到影响多种细胞功能，且在不同的时间与细胞中发挥不同的作用，故而直接操作这些途径来调节T细胞表型时还需慎二、临床供应的三大考量与CAR-T细胞制造过程相关的技术，特别是与激活和扩增相关的技术，仍处于早期开发阶段。通过自动化技术扩大CAR-T的生产是一个迫切的需求，自动化平台保证了更好的细胞活力、更高的转导效率和更低的细胞亚群变异，减少对技术人员和科学家的依赖，能够促进商业化和患者的可及性，同时将生产时间减少30%-40%。此外，开发端到端的生产系统可以促进建立分散式CAR-T制造。目前的CAR-T疗法使用集中生产模式，一个符合生产规范（GMP）要求的生产基地为多个临床中心提供服务。尽管这种集中式系统可能会简化多个患者并行产品的生产，但它也大大增加了物流和配送方面的挑战。模块化、小型化和步骤集成，包括但不限于病毒生产、离体T细胞转导、活化和扩增以及质量控制，将使在治疗中心制造CAR-T的自动化、端到端解决方案成为可能。这种分散化模式可以提高CAR-T的总生产能力，减少CAR-T制备时间扩大CAR-T生产的一个挑战是在患者材料收集、制造、治疗中心的过渡，可能会涉及试验不同产品标识符、患者信息在制造过程中丢失等问题，这需要建立一个“数字供应链”，减少交付周期并确保CAR-T产品可以精确交付。2.2副作用CAR-T在回输给患者后，可能会诱导明显的副作用，包括细胞因子释放综合征和免疫效应toxilizumab（IL-6R拮抗剂）和类固醇，像利用anakinra等药物治疗还在探索中。科学家正在建立模型和预测算法，以确定可预测治疗后细胞因子释放综合征和ICANS严重程度的2.3可及性CAR-T制备复杂，需要专门的设施和专业知识，这使得其难以在发展中国家/地区实施，并限制了其在低收入人群中的可用性。不同社会经济地位的患者在使用CAR-T治疗方面存在巨大差异。在美国，只有7.3%的接受CAR-T疗法的患者来自低收入社区，而非洲、南美洲、印度等几乎没有CAR-T试验。数字医疗可以允许这些患者在线接受后续护理，并能够与距离患者家更近的中心进行协调以减轻距离CAR-T定点治疗区域较远的低收入家庭的负此外，病毒载体、患者细胞以及制备好的CAR-T产品均需要冷链运输，而中低收入国家缺乏可靠的低温链，其建设需要大量的资金、设备以及专业技术人员支持，目前仍难以实现，但一些潜在的替代方面正在被开发，其中一个解决方案是使用干冰，不过其无法真正提供与冷链完全相同的性能，不是长远之计；另一个方案是开发生物保存和冷冻制剂，这有可能减轻在次优条件下运输或储存的风险，减少反复冻融对细胞产生的影响。三、总结尽管CAR-T疗法已经获批上市取得重大突破，但其仍然有众多需要优化和改进的地方，