YYT 0652-2016 植入物材料的磨损 聚合物和金属材料磨屑 分离和表征

代替YY/T0652—2008植入物材料的磨损聚合物和金属材料磨屑分离和表征国家食品药品监督管理总局发布IYY/T0652—2016/ISO17853:2011 Ⅲ 12术语和定义 13原理、试剂和仪器 1 4 86试验报告 ⅢYY/T0652—2016/ISO17853:2011本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替YY/T0652—2008《植入物材料的磨损聚合物和金属材料磨屑分离、表征和定量——增加了5.4陶瓷磨屑的处理步骤；——删除了原标准中3.9对照试验和3.10颗粒数计算。本标准使用翻译法等同采用ISO17853:2011《植入物材料的磨损聚合物和金属材料磨屑分离—将标准中的浓度单位M用mol/L代替，M不属于GB3101和GB3102各部分所给出的单位。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标准由全国外科植入物和矫形器械标准化技术委员会材料及骨科植入物分技术委员会YY/T0652—2016/ISO17853:2011须有一个从组织中提取磨屑的统一方法，以确保对磨屑影响的评价有一个统一标准。对植入物模拟器产生的磨屑表征还为正在研究中的植入物的磨损性能和使用性能提供了有价值的信息。本标准中，对组织中或模拟器润滑液中的磨屑进行分离和表征的第一种方法是用过滤或嵌入树脂的方法进行磨屑分离，然后使用扫描电子显微镜(SEM)或透射电子显微镜(TEM)对磨屑进行分析模拟器中植入物金属磨屑进行分离和表征的另一种方法近期得以发展，磨屑可被沉积在晶片上进行1YY/T0652—2016/ISO17853:2011植入物材料的磨损聚合物和金属材料磨屑分离和表征100%或用蒸馏水稀释至80%。2YY/T0652—2016/ISO17853:2011c=0.01mol/L。p=0.96g/cm³及p=0.90g/cm³。250mmol/L中含有25mmol/L乙二胺四乙酸溶液(EDTA),pH值为7.4。3.2.9蛋白酶K3.2.14TRIS-HCI缓冲液污染颗粒。3YY/T0652—2016/ISO17853:2011包括能量弥散X射线分析模块(EDXA)。包括能量弥散X射线分析模块(EDXA4YY/T0652—2016/ISO17853:2011搅拌温度控制。4组织样本中聚合物磨屑和金属磨屑的取样和分析方法将组织保存在-70℃(或更低温度)的冰箱中，或在室温下保存于固定剂中，例如福尔马林(3.2.4),福尔马林用蒸馏水(3.2.3)稀释至10%。需要时将组织解冻，在浸提萃取工作之前将试样用蒸馏水清洗干净。将清洗后组织里的多余水分用无尘布吸走。未固定的组织样本应在通用条件下进行处理。4.2聚合物磨屑的分离步骤假体周围组织中聚乙烯磨屑的分离有许多已知方法。这里提到的方法是以Campbell等[2],Tipper等3和Richards等[4的方法为基础制定的。消化前，用手术刀和刀片将组织切成小片以加速消化。将组织放在体积比为2:1的氯仿和甲醇混合液中24h,直至组织沉到容器底部，以去除切碎的组织中的油脂。取出并用磷酸钠缓冲液(3.2.8)冲将5mol/LNaOH溶液(3.2.12)加入到组织样本中(1g组织中加入10mL的5mol/LNaOH溶液),置于65℃的搅拌水浴锅(3.3.22)中消化至少24h。当无可见的固体组织碎片悬浮时可认为消化完成。可使用多种方法将聚合物磨屑从消化的组织中提纯。使用4.2.2.2或4.2.2.3中描述的方法。本方法可收集粒径为纳米级到几毫米的全部磨屑，能够将所有体积的磨屑分离出来。将消化后的组织冷却到4℃,加入同等体积冷冻的无水乙醇(3.2.1)。这时可能有盐分沉淀。如果出现这种情况，加入超纯水直至盐分溶解。将溶液放置在4℃环境中，并搅拌过夜。将溶液在4℃,20000g离心力作用下离心2h。将上清液移入清洁的无菌5YY/T0652—2016/ISO17853:2011下两层液体，取一定量上一步获得的悬浮液加入各离心管中，在插入异丙酮层液间，将包含聚乙烯磨屑的微粒层移出至无菌管中，超声波10min以使积聚的磨屑分注1:第一次超速离心是为了把较轻的聚乙烯磨屑层从较重的组织碎片中分离出来。第二次超速离心是通过离心注2:这个方法可能无法收集到尺寸较大的聚乙烯颗粒产物，使得磨损物不能全部分离出来。时候开发出的分离关节模拟器润滑液中磨屑的步骤相似6(参见第5章),只在开始步骤及使用组织替注1:通过同样步骤分离和表征的组织及关节模拟器磨屑，其结果能够直接而精确地进行对比”,这对于关节模拟a)用手术刀和刀片将组织切成碎片以加速消化过程。将一些小碎片(大约2mm×2mm×注2:组织样本的重量取决于可观察到的病人的全部磨损部位以及用于磨屑分离的组织大小(例如，肉芽肿、囊性c)将组织碎片放入1mL的十二烷基硫酸钠(3.2.11)(2.5g溶解于100mL蒸馏水中)中煮沸d)室温下冷却10min。f)用经蒸馏水稀释至体积分数为80%的丙酮(3.2.2)清洗一次，在16000g离心力作用下离心g)用1mLpH值为7.4的含有25mmol/L乙二胺四乙酸的250mmol/L磷酸钠缓冲液清洗h)用配备微探针的超声波细胞粉碎机对1mLpH为7.4的含有25mmol/L乙二胺四乙酸的i)加入0.5mLpH为7.4的含有25mmol/L乙二胺四乙酸的250mmol/L磷酸钠缓冲液和木j)放入离心管，在16000g离心力作用下离心10m6YY/T0652—2016/ISO17853:2011q)用1mL,50mmol/LTRIS-HCl缓冲液(pH=7.6)清洗颗粒，然后在16000g离心力作用下r)重复q)步骤一次。s)将颗粒放入1mL50mmol/LTRIS-HCl缓冲液中，用配备有微探针的超声波细胞粉碎机处t)加入蛋白酶K(3.2.9)(2g/mLTRIS-HCl缓冲液)在55℃的搅拌水浴锅中培养24h。u)将离心管在16000g离心力作用下离心15min。x)煮沸10min。y)在室温下冷却10min。z)在16000g的离心力作用下离心15min。bb)用1mL,50mmol/LTRIS-HCl缓冲液(pH=7.6)清洗颗粒。在16000g的离心力作用下离cc)先用0.5mL包含3%十二烷基硫酸钠(3g/100mL)(3.2.11)的体积分数为80%的丙酮溶液注3:步骤g)到i)可以用50mmol/L的TRIS-HCl缓冲液进行操作。随后应验证所使用的木瓜蛋白酶的有效性。超速离心法分离磨屑时(见4.2.2.3),可过滤10μL～300μL的磨屑悬浮液或者更大体积的稀释悬注：当悬浮液几乎透明时可认为达到合适的稀释量，通常稀释的比例为1:10～1:100,目的是改变磨屑浓度，分散滤膜上的磨屑以利于SEM观察，确保观测到合适数量的磨屑(至少100个微粒)。7YY/T0652—2016/ISO17853:2011在乙醇中将磨屑以16000g离心力下离心20min(4.3中的分离方案)。移除上清液，然后加入免接触离心管底部的磨屑。将离心管放入真空中1h以去除剩余的丙酮。在离心管中加入1mL用金刚石刀具将含有磨屑的树脂切割成片(厚度为100nm～120nm),将切片铺展在200目的镀聚表征大于0.1μm的磨屑时，在有磨屑的滤膜上随机选取不重叠区域的100个磨屑，放大至少100000倍。注1:有必要区分纤维状和圆形的聚合物磨屑。注2:电脑或人工图形分析软件可用于确定磨屑的尺寸和形状。们的统计尺寸有可能超过实际尺寸。如4.4.2中所描述，传统的磨屑分析仪器是透射电子显微镜(TEM),但也可采用扫描电子显微镜(SEM)来分析。4.5.2.2TEM分析8YY/T0652—2016/ISO17853:2011手动图像分析典型的TEM显微照片(在低磨损的情况下至少150个磨屑，如果条件允许，最好有300个或者更多),根据形状和大小表征金属磨屑。表征每张显微照片的所有磨屑，以便更准确统计不同的磨屑尺寸。确定每个磨屑的最大长度和宽度。计算出长宽比r,得出磨屑的形状信息。磨屑可以注：可以调整TEM加速电压以得到最优磨屑图像。4.5.2.3SEM分析对于磨屑的SEM成像时，使用碳胶带将有磨屑的滤膜粘在SEM样品台上。对滤膜进行喷金或者镀其他导电材料，例如铂或钯，让微粒具有导电性。镀层的厚度应为3nm～5nm。用放大倍数为60000～150000的高分辨率SEM在滤膜上随机选择区域获取磨屑图像，加速电压为3keV。同TEM分析一样，手动图像分析具有代表性的SEM显微照片(至少150个磨屑),根据其形状和尺寸来表征磨屑。确定每个磨屑的最大长度和宽度。计算出长宽比r,得出磨屑的形状信息。磨屑可积也可以测量出来。可定制软件来对磨屑数据进行自动化处理。4.6磨屑的鉴定可用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)定性验证取出的磨屑，例如聚乙烯。使用FTIR之前应做好准如果在检测的FTIR光谱中主峰与超高分子量聚乙烯的参考光谱相似，如医用级超高分子量聚乙通过参考已发布的UHMWPE磨屑的图片(例如，参见ASTMF1877-05[9),磨屑的形貌也可作为鉴别UHMWPE磨屑的附加参考。注：可将不同样本得到的磨屑汇集起来，以便FTIR分析时有足够的样本量。金属磨屑的成分应使用X射线能量弥散分析模块(EDXA)来确定。衍射图案也可用来确定成分。5关节模拟器润滑液中聚合物和金属磨屑的取样和分析方法在不同的关节模拟器和不同的试验中，作为试验介质的小牛血清用量也不同。把全部体积的小牛血清用作磨屑分析是不切实际的，所以应从已经混合均匀的试验流体中采集具有代表性的等分量的血9YY/T0652—2016/ISO17853:20115.2聚合物材料的取样和分析步骤例如UHMWPE和聚醚醚酮(PEEK)由于没有组织样本，模拟器润滑液中的磨屑分离步骤同4.2中描述的不同。国际上的实验室已经建立了两个公开的方法。选择何种方法取决于需要分离的磨屑材料。下述方法由Scott等发布[10],最初只用于UHMWPE材料。后来发现其他材料(如PEEK和陶瓷)也能使用酸消化法，但是除了UHMWPE,其他材料的盐酸耐酸性应深入研究。a)将10mL血清样本加入到40mL的盐酸中(体积分数为37%)。b)在50℃下用搅拌棒搅拌约1h。c)将100mL甲醇加入到0.5mL的消化溶液中。5.2.3NaOH消化血清a)在60℃的搅拌水浴锅中用NaOH消化润滑液样本，至少24h或者直至完全溶解。将样本冷却到4℃至少2h,确保样本完全冷却。b)在每个样本中加入等体积的氯仿和甲醇混合液(2:1),在室温中培养24h。c)在室温下用500g离心力离心消化样本10min,将上清液移入清洁的离心管。d)重复步骤b)和c)三到四次，直到上层液体澄清。f)加入超纯水直到溶液变透明，在4g)4℃,20000g离心力下将样本离心2h。的滤膜来收集。另外，重载试验条件下的模拟器润滑液宜采用一系列孔径逐渐变小的滤膜过滤，例如磨屑的SEM图像应记录下来。根据磨屑的尺寸调整放大倍数，通常在500～150000倍之间。根据4.5.1描述的方法，至少分析100个磨屑。如4.6.1中所述，应使用FTIR对磨屑进行鉴定。由于金属在强酸和强碱中的可溶性，应使用酶消化法。5.3.2中描述的方法是由Catelas等发布的[6]。本方法与他们最初开发的步骤相比做了少量调整[1],这样就可以适应大量的含有YY/T0652—2016/ISO17853:2011这个步骤与分离和表征生物组织中磨屑的步骤相似5(参见第4章),只在开始步骤及使用组织替代血清润滑液导致的所用酶的浓度有些许不同。注1:通过同样步骤分离和表征的组织及关节模拟器磨屑，其结果能够直接而精确地进行对比7,这对于关节模拟器的验证是很重要的。注2:5.3.2中描述的步骤最初被用于95%小牛血清润滑液中磨屑的分离。因此它可以用于高蛋白质含量液体中磨屑的分离。注3:因为其对于各类有机成分存在多个消化步骤，该方法可以适用于人体体液(比如关节液)中磨屑的分离和a)将15mL血清样本加入25mL玻璃管中，在16000g的离心力作用下，离心10min。(用玻璃管是为了防止样本磨屑粘附在管壁上)。注1:所需血清的体积取决于关节模拟器试验过程中假体的磨损量。一个15mL血清样本中含有的磨损量约为0.4mm³~0.8mm³,形成磨屑球。如果磨损量较小，可以将经过木瓜蛋白酶消化步骤的多个15mL样本进行b)谨慎移除多余血清，留下约1.5mL。将含有磨屑颗粒的1.5mL血清转移至2mL微量离心c)在16000g的离心力作用下离心10min。用微量移液管谨慎移除上清液。避免触碰位于管底的磨屑。d)将磨屑悬浮于十二烷基硫酸钠溶液中(浓度2.5g/100mL蒸馏水)。e)将离心管煮沸10min。f)在室温下冷却10min。g)在16000g的离心力作用下离心10min。h)在不触碰管底颗粒的情况下用微量移液管谨慎移除上清液。i)用1mL体积分数为80%的丙酮溶液清洗磨屑，然后在16000g的离心力作用下离心10min。在不触碰管底磨屑的情况下用微量移液管谨慎移除上清液。j)用1mL含有25mmol/L乙二胺四乙酸溶液(pH=7.4)的250mmol/L磷酸钠缓冲液清洗颗粒，然后在16000g的离心力作用下离心10min。在不触碰管底颗粒的情况下用微量移液管k)重复步骤j)2次。1)将磨屑悬浮于1mL含有25mmol/L乙二胺四乙酸溶液(pH=7.4)的250mmol/L磷酸钠缓冲液中，使用配备微探针的超声波细胞破碎仪超声处理10s～15s,或置于超声水浴中处理以避免探针可能带来的钛污染。m)添加0.5mL含有25mmol/L乙二胺四乙酸溶液(pH=7.4)的250mmol/L磷酸钠缓冲液和木瓜蛋白酶(4.8U每1.5mL磷酸钠)。在65℃水浴中培养24h。n)在16000g的离心力作用下离心10min。o)在不触碰管底磨屑的情况下用微量移液管谨慎移除上清液。1mL蒸馏水将它们合并到一个离心管中。最后在16000g离心力作用下离心10min,并且在不触碰管底颗粒的情况下用微量移液管谨慎的移除上清液。p)将磨屑颗粒重新悬浮于十二烷基硫酸钠溶液中(浓度2.5g/100mL蒸馏水)。q)将离心管煮沸10min。YY/T0652—2016/ISO17853:2011r)在室温下冷却10min。t)在不触碰管底磨屑的情况下用微量移液管谨慎移除上清液。u)用1mL,50mmol/L的TRIS-HCl缓冲液(pH=7.6)清洗磨屑。在16000g的离心力作用下离心10min。在不触碰管底磨屑的情况下用微量移液管谨慎移除上清液。v)重复步骤u)。w)将微球溶解于1mL的50mmol/LTRIS-HCl缓冲液中，使用配备微探针的超声波细胞破碎仪超声处理5s或置于超声处理水浴中30min。使用超声波细胞粉碎机十分高效，但使用时应配备一个清洁的未破坏/未腐蚀的探针可能带来的钛污染。初始体积进行调整),并在55℃搅拌水浴中培养24h。y)在16000g的离心力作用下离心15min。z)在不触碰管底磨屑的情况下用微量移液管谨慎移除上清液。bb)将离心管煮沸10min。cc)在室温下冷却10min。dd)在16000g的离心力作用下离心15min。ee)在不触碰管底磨屑的情况下用微量移液管谨慎移除上清液。ff)用1mL,50mmol/L的TRIS-HCl缓冲液进行清洗，在16000g的离心力作用下离心15min,在不触碰管底磨屑的情况下用微量移液管谨慎移除上清液。gg)先用0.5mL包含3%十二烷基硫酸钠的体积分数为80%的丙酮溶液(3g/100mL,溶于80%丙酮)进行清洗，然后在16000g的离心力作用下离心15min,在不触碰管底磨屑的情况下用微量移液管谨慎移除上清液。下用微量移液管谨慎移除上清液。ii)添加无水乙醇，然后置于4℃下保存直到提取磨屑(见5.3.3)。这个方案能够有效地从95%的血清中提取磨屑。若血清百分比含量较低，其中的一些步骤可精确的比较结果。将分散于乙醇中的磨屑进行离心分离，离心力16000g,时间20min,然后按照4.4.2中的步骤将磨屑嵌入环氧树脂中并进行切片处理。5.3.4.2TEM分析如4.5.2.2所述，金属磨屑的成像采用TEM,加速电压约为80kV,放大倍数至少为21000倍(放大YY/T0652—2016/ISO17853:2011倍数应在报告中标明)。5.3.4.3SEM分析对于磨屑的SEM成像，用碳胶带将附着有磨屑的滤膜粘到SEM的铝制样品台(3.3.1)上。如如4.6.2所述，通常用X射线能谱(EDXA)进行金属颗粒的组分分析。衍射图谱也经常被用于磨金属磨屑的成分可采用X射线能量弥散分析仪(EDXA)进行测定，如4.6.2所述。衍射图样也可用于确定磨屑。本标准重点在于关节模拟器的试验液和组织中聚合物磨屑和金属磨屑的分离和表征。然而其中的6试验报告拟器使用的试验液体等详细信息);c)取出假体的外观(可提供关于磨屑产生原因和假体失效根源等方面的信息，如股骨颈与髋白杯h)用SEM或者TEM进行颗粒计数或尺寸、形貌分析时所选用的放大倍数；i)观测磨屑形貌所用的TEM的加速电压；[1]BILLI,F.,BENYA,P.,EBRAMZADEH,E.andMCKELLOP,H.A.Anaccurateandex-tremelysensitivemethodtoisolateanddisplaynanoparticulatemetallicweardebrisformorpHometricanalysis.Transactions54thAnnualMeetingOrthopaedicResearchSociety,2008,1929.[2]CAMPBELL,P.A.,MA,S.,YEOM,B.,MCKELLOP,H.A.,SCHMALZRIED,T.P.andAMSTUTZ,H.C.Isolationofpredominantlysubmicron-sizedUHMWPEwearparticlesformperipros-theictissues.JournalofBiomedicalMaterialsResearch,29(1),pp.127-131,1995.[3]TIPPER,J.L.,INGHAM,E.,HAILEY,J.L.,BESONG,A.A.,WROBLEWSKI,B.M.,STONE,M.andFISHER,J.quantitativeanalysisofpolyethyleneweardebris,wearrateandheaddam-ageinretrievedCharnleyhipprostheses,JournalofMaterialScience:MaterialsinMedicine,11,pp.117-[4]RICHARDS,L.,BROWN,C.,STONE,M.H.,FISHER,J.,INGHAM,E.andTIPPER,J.L.Identificationofnanometersizedultrahighmolecularweightpolyethylenewearparticlesinsamplesretrivedinvivo,JournalofBoneandJointSurgery,90B,pp.1106-1113,2008.[5]CATELAS,I.,CAMPEBELL,P.A.,BOBYN,J.D.,MEDLEY,J.B.andHuk,O.L.Wearparticlesfrommetal-on-metaltotalhipreplacements:Effectsofimplantdesignandimplantationtime.TheproceedingsoftheInstitutionofMechanicalEngineers,PartH,JournalofEngineeringinMedi-cine,SpecialIssue:Developmentofmonolithicandsurfacereplacementmetal-on-metalhipreplace-ments,220,pp.195-208,2006.[6]CATELAS,I.,BOBYN,J.D.,MEDLEY,J.B.,KRYGIER,J.,ZUKOR,D.J.andHUK,O.L.Size,shapeandcompositonofwearparticlesfrommetal-metalhipsimulatortesting:Effectsofallyandnumberofloadingcycles,JournalofBiomed