GB/T 41627-2022 动物源空肠弯曲菌检测方法（正式版）

ICSCCSGB/T41627—2022动物源空肠弯曲菌检测方法DetectionmethodofCampylobacterjejunifromanimalsamples国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T41627—2022本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。1动物源空肠弯曲菌检测方法本文件描述了动物源空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)多重PCR的检测方法。本文件适用于畜禽养殖和屠宰过程中动物源空肠弯曲菌的检测。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.9—2014食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。CFU:菌落形成单位(Colony-formingunit)DMSO:二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)mCCDA:弯曲菌选择性琼脂(Modifiedcharcoalcefoperazonedeoxycholateagar)MHA:MuellerHinton琼脂(MuellerHintonagar)PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphatePCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)5设备和材料5.1冰箱：冷藏温度为2℃~8℃。5.2恒温培养箱：37℃±1℃、42℃±1℃。5.3高压灭菌锅：灭菌温度为121℃,工作压力为0.1MPa。5.4恒温振荡培养箱：180r/min、42℃±1℃。5.5微需氧培养装置：5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气。5.6无菌棉签。2GB/T41627—20225.11无菌剪刀。5.12无菌镊子。5.13无菌平皿。5.24PCR管。6培养基与试剂6.1mCCDA:见附录A中A.1。6.12介于100bp～2000bp的DNA分子量标准。3GB/T41627—2022空肠弯曲菌检验程序见图1。样品采集家禽养殖场家畜养殖场屠宰场或粪便拭了饲料禽蛋养殖环境或粪便拭了饲料鲜奶养殖环境肠内容物肉样品堵宰场环境增菌微需氧微需氧24h~48h增菌微需氧微需氧增菌微需氧微需氧选择性培养基分离37℃±1℃或弯曲菌的多重PCR鉴定空肠弯曲菌用无菌棉签采集家禽泄殖腔内或家畜直肠内粪便约0.1g,放入Cary-Blair运输培养基中保存。用无菌棉签采集家禽或家畜的新鲜粪便约0.1g,放入Cary-Blair运输培养基中保存。用无菌棉签擦拭禽蛋表面，放入无菌采样袋中封口保存。4GB/T41627—20229.1.4鲜奶样品用无菌采样袋或无菌采样管采集鲜奶样品约50mL,封口保存。用无菌镊子夹取养殖场贮藏的饲料或垫料10g,分别放入无菌采样袋中封口保存。用无菌镊子夹取养殖环境中的饲料和垫料10g,分别放入无菌采样袋中封口保存。取养殖场家禽或家畜的饮用水1L～4L和养殖环境中的污水20mL～50mL,放入无菌采样瓶中保存。用无菌棉签擦拭样品的表面(面积至少100cm²),放入无菌采样袋中封口保存。用无菌采样袋采集大块肉样品约100g,封口保存。样品运输过程中，应避光保存，保存温度为0℃~20℃,样品应在24h内进行处理。如果采样与样品处理的间隔时间较长，样品应在4℃±2℃中低温保存，并在72h内进行处理。9.3样品处理及增菌即取悬浊液100μL,涂布于mCCDA平板上，置于恒温培养箱中，42℃±1℃微需氧条件下培养24h~48h。取25mL蛋黄液或蛋浆样品加入125mLBolton肉汤中均质混合(1:6稀释),取25mL混合液加入100mLBolton肉汤中并混匀(1:30稀释),同时将1:6和1:30稀释的混合液分别置于恒温振荡5GB/T41627—2022培养箱中，42℃±1℃微需氧条件下培养24h～48h,进行增菌。将50mL鲜乳样品在4℃下10000r/min离心30min后弃去上清液，用10mLBolton肉汤重悬沉淀(尽量避免带入油层),将悬浊液转移至90mLBolton肉汤中，置于恒温振荡培养箱中，42℃±1℃微需氧条件下培养24h～480.1%蛋白胨水转移至250mL离心管中，在4℃下5000r/min离心15min后弃去上清液，用10mL0.1%蛋白胨水重悬沉淀，吸取3mL悬浊液，加入100mLBolton肉汤中，置于恒温振荡培养箱中，42℃±1℃微需氧条件下培养24h～48h,进行增菌。10mL均质液加入90mLBolton肉汤中，置于恒温振荡培养箱中，42℃±1℃微需氧条件下培养用PBS将24h增菌液和48h增菌液分别进行1:50的稀释，将100μL增菌液及对应的1:50稀释液分别划线接种于弯曲菌选择性mCCDA平板上，置于恒温培养箱中，42℃±1℃微需氧条件下培养24h～48h。观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态，弯曲菌在mCCDA平板上的疑似菌落通常板上，在37℃±1℃或42℃±1℃微需氧条件下培养24h～48h。将空肠弯曲菌标准株NCTC11351接种于MHA血平板上，在37℃±1℃或42℃±1℃微需氧条件下培养24h～48h,作为阳性对照。关于弯曲菌属的生化鉴定，按GB4789.9—2014中5.4.1的实验方法进行操作。6GB/T41627—2022关于空肠弯曲菌的生化鉴定，按GB4789.9—2014中5.4.2的实验方法进行操作。9.6弯曲菌的多重PCR鉴定9.6.1多重PCR模板的制备弯曲菌疑似单菌落4～5个，放置于干式恒温金属浴中100℃处理10min,冷却后，以12000r/min离心2min,上清液作为多重PCR反应的细菌DNA模板。同时，制备空肠弯曲菌标准株NCTC11351的9.6.2多重PCR反应程序参考A.5制备25μL多重PCR反应体系。在基因扩增仪设置多重PCR反应程序：95℃预变性10min;95℃变性30s,59℃退火90s,72℃延伸1min,35个循环；72℃延伸10min。反应结束后置于4℃保存。取9μL多重PCR产物和1μL的10×DNA凝胶加样缓冲液均匀混合，并与5pL介于100bp~2000bp的DNA分子量标准分别加入1.2%的琼脂糖凝胶点样孔中，进行电泳。电泳缓冲液为0.5×TBE,电压110V,电泳时间20min～30min。电泳结束后用凝胶成像仪进行成像分析，通过介于100bp～2000bp的DNA分子量标准的已知条带长度判断菌落的PCR条带长度。9.6.4.1多重PCR反应程序有效性判定空肠弯曲菌阳性对照同时出现857bp弯曲菌属特异性扩增条带及539bp空肠弯曲菌的特异性扩照同时正确时，判定多重PCR反应程序有效。凝胶成像仪中阳性对照和阴性对照扩增结果见A.9.3。同时出现857bp和539bp扩增条带的样品判定为空肠弯曲菌核酸阳性。未同时出现857bp和539bp扩增条带的样品判定为空肠弯曲菌核酸阴性。7培养基与试剂A.1.1基础培养基A.1.1.1成分营养肉汤25.0g活性炭4.0g水解酪蛋白3.0g硫酸亚铁0.25g丙酮酸钠0.25g琼脂12.0gA.1.2抗生素溶液配方抗生素质量质量浓度两性霉素B20mLDMSO利福平0.25g10mLDMSO25.0mg/mL甲氧苄氨嘧啶0.25g50mL乙醇5.0mg/mL放线菌酮2.5g50mL乙醇50.0mg/mL头孢哌酮3.2g50mL超纯水多黏菌素B0.1675g50mL超纯水3.4mg/mLA.1.3完全培养基A.1.3.1成分基础培养基抗生素溶液：8GB/T41627—2022两性霉素B400μL利福平200μL放线菌酮lmL头孢哌酮lmL多黏菌素BlmL当基础培养基温度约为55℃时，在无菌条件下加入抗生素溶液，混匀，校正pH至7.4±0.2。将15mL完全培养基倾倒于无菌平皿中，静置至培养基凝固。制备的平板在室温放置不应超过4h,或在4℃冷藏不应超过7d。使用前应干燥平板。A.2MHA血平板A.2.1基础培养基A.2.1.1成分牛肉膏粉2.0gA.2.2无菌脱脂纤维绵羊血璃珠。A.2.3完全培养基A.2.3.1成分无菌绵羊血50mL当基础培养基的温度约为55℃时，在无菌条件下加入绵羊血，混匀，校正pH至7.4±0.2。将15mL完全培养基倾倒于无菌平皿中，静置至培养基凝固。制备的平板为干燥时在室温放置不宜超过94h,或在4℃冷藏不宜超过7d。使用前应干燥平板。A.3Bolton肉汤A.3.1基础培养基A.3.1.1成分碳酸钠0.6gA.3.1.2制法将A.3.1.1中各成分溶于蒸馏水中，121℃,灭菌15min,备用。溶剂溶剂50mL乙醇g50mL超纯水质量两性霉素B万古霉素A.3.3完全培养基A.3.3.1成分两性霉素B甲氧苄氨嘧啶万古霉素3.4mg/mLGB/T41627—2022头孢哌酮多黏菌素BlmLA.3.3.2制法温放置不宜超过4h,或在4℃冷藏不宜超过7d。琼脂5.0g硫乙醇酸钠1.5g磷酸氢二钠1.1g氯化钠5.0g氯化钙9.0mg蒸馏水1000mLA.4.2Cary-Blair培养基制法除氯化钙外，将其他成分均按上述成分配制，加热溶解。冷却至55℃,校正pH到8.4±0.2,加入不宜超过4h,或在4℃冷藏不宜超过7d。A.5.1弯曲菌的多重PCR引物序列及扩增片段长度弯曲菌多重PCR反应体系的引物序列及扩增片段长度见表A.1。表A.1鉴定弯曲菌的PCR引物序列及扩增片段长度基因引物序列扩增片段长度16S¹:5'-ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC-3′16S₂:5'-GGACGGTAACTAGTTTAmapAmapA₁:5'-CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG-3′mapA₂:5'-GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA-3ceuE₁:5'-AATTGAAAAATTGCTCCAACTATG-3ceuE₂:5'-TGATTTTATTATTTGTAGCAGCG-3A.5.2多重PCR反应体系10×扩增缓冲液mapA₁(2.5nmol/L)lμLMg²+(25mmol/L)2μLTaqDNA聚合酶2.5U模板DNA2μL加ddH₂O至25μLA.6.1成分氯化钠8.8g氯化钾0.2g十二水合磷酸氢二钠2.9g磷酸二氢钾0.2gA.6.2制法将A.6.1中成分溶于800mL蒸馏水中，充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4,最后定容到1L,121℃灭菌15min。A.7.1成分蛋白胨1.0g