GB/T 41712-2022 脱氧核糖核酸酶I 酶活及杂质检测方法（正式版）

ICS07.080脱氧核糖核酸酶I酶活及杂质检测方法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I Ⅲ 1 1 1 1 2 2 5ⅢGB/T41712—2022本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG11)提出并归口。本文件起草单位：福建南生科技有限公司、夏禾(深圳)生物技术有限公司、深圳市中鼎检测技术有限公司、苏州坤琪生物科技有限公司、蚌埠产品质量监督检验研究院、南京诺唯赞生物科技股份有限公生物医药有限公司、北京中天标科标准化技术研究院有限公司、复旦大学、厦门致善生物科技股份有限究院计量与分析科学研究所、厦门艾德生物医药科技股份有限公司。GB/T41712—2022脱氧核糖核酸酶I(DNaseI,EC3.1.21.1)是最有代表性的核酸内切酶，降解单链和双链DNA,产生具有5'-磷酸末端的分解物，在一般条件下其分解产物含有单核苷酸或8个～12个碱基的寡核苷酸，平均大小约4个核苷酸。制定脱氧核糖核酸酶I国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于脱氧核糖核酸酶I的生产和使用具有重要意义。1脱氧核糖核酸酶I酶活及杂质检测方法GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法3术语和定义水解单链和双链DNA,产生具有5'-磷酸末端的单核苷酸或寡核苷酸(8个～12个碱基)的核酸内2GB/T41712—20224.30.1mol/L硫酸镁溶液4.40.85%氯化钠溶液4.5小牛胸腺DNA溶液精密称取33mg小牛胸腺DNA,用冷水定容至100mL,置4℃过夜溶解。4.60.1%酵母RNA溶液精密称取0.1g酵母RNA,用0.1mol/L醋酸钠缓冲液溶解并定容至100mL。取固体或液体待测供试品适量，用冷的0.85%氯化钠溶液溶解并稀释。5仪器设备6试验步骤按表1配制底物溶液并进行标定：用0.85%氯化钠溶液作空白对照清零，取底物溶液2.5mL,加入0.5mL0.85%氯化钠溶液，混匀后在紫外分光光度计中测定波长260nm处的吸光度值A26o应为0.60±0.05,否则应调整小牛胸腺DNA的加样量。试剂体积/mL1mol/L醋酸钠缓冲液0.1mol/L硫酸镁溶液小牛胸腺DNA溶液纯化水总体积按表2配制酶促反应液，混匀后立即置紫外分光光度计中测波长260nm处的吸光度值A2b,每分钟读数一次，共计3次，取相邻两个读数差值△A₂6o/min的最大值。△A26o/min的最大值应在0.067~3GB/T41712—20220.083之间，否则需调整供试品的稀释度。表2酶促反应配制表试剂供试品/mL对照品/mL底物溶液供试品0.85%氯化钠溶液总体积6.1.3.1单位体积中酶活性按式(1)计算。式中：……unit/mL);Upv——unit/mL);A。——△A260/min的最大值；0.5——酶促反应液中供试品的加样量，单位为毫升(mL);0.001——260nm处每毫升每分钟变化0.001吸光度值。6.1.3.2单位固体质量中酶活性按式(2)计算。式中：Ups——酶活性每单位质量，单位为酶活性单位每毫克(kunitzunit/mg);Upy——酶活性每单位体积，单位为酶活性单位每毫升(kunitzunit/mL);Ca——供试品的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)。6.2.1溶液配制6.2.1.1溶液1:13.61g三水合乙酸钠、800mL纯化水，用2mol/L乙酸调pH5.0,定容至1L。6.2.1.2溶液2:0.1g酵母RNA、100mL溶液1,溶解30min。6.2.2供试品溶液6.2.2.1溶液E:取固体/液体待测供试品适量，用冰预冷的纯化水溶解并稀释。6.2.2.2溶液E。:将溶液E:稀释2倍。用纯化水作空白对照，按表3配制水解速率测试反应液，混匀后立即在25℃条件下在线检测，每分4GB/T41712—2022表3水解速率测试(E₀)反应液配制表试剂测试1/mL测试2/mL测试3/mL空白/mL溶液2—纯化水溶液E。总体积用纯化水作空白对照，按表4配制总水解度测试反应液，混匀后立即在25℃条件下在线检测，每分钟读数一次，共计20min,E:值为△A3o/min≤0.002时的读数。表4总水解度测试(Ef)反应液配制表试剂测试/mL空白/mL溶液2溶液E纯化水总体积6.2.3.3In(E。—E)与时间的直线斜率按式(3)计算。式中：E。——水解速率测试值；△t——反应时间10min。6.2.3.4RNase活性按式(4)计算。……(3)……(4)式中：URs———RNase活性每单位质量，单位为酶活性单位每毫克(kunitzunit/mg);3——反应液的总体积，单位为毫升(mL);Ca——供试品的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)。6.2.4RNase杂质含量按式(5)计算。GB/T41712—2022式中：URs——供试品中