酶工程酶分子修饰

关于酶工程酶分子修饰酶分子修饰什么是酶分子修饰酶分子修饰（enzymemolecularmodification）通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程酶分子工程（enzymemolecularengineering）指按照酶的各种特性的需要，依据结构－性能间的关系，在分子水平上实现酶的结构设计和操作分子生物学水平：用基因工程方法对DNA或RNA进行分子改造，以获得化学结构更合理的酶蛋白一级结构水平：对天然的酶分子进行改造，包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等?第2页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰对酶进行分子修饰的原因和依据在非生理条件下，酶的某些性质不满足工程应用生理最适温度、pH值≠体外最适温度、pH值酶分子对热、酸、碱、有机溶剂的耐受性较差酶在非生理条件下活力下降，抗原性显著理论依据和方法酶的结构特点与酶催化特性的关系：构效关系理性设计（rationaldesign）：找出关键结构，在掌握酶的构效关系的基础上，有目的地对其进行改造半理性设计（semi-rationaldesign）：以基因的随机重组为手段，参考酶的构效关系进行关键位点的改造第3页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰酶分子修饰的意义：我们究竟要做什么？应用角度——酶工程提高酶的催化效率，改变底物专一性增强酶的稳定性，降低/消除酶的抗原性研究角度——酶学研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探索酶的结构与催化特性之间的关系探测酶活性必需氨基酸的性质和数目探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动探索酶的作用机理和催化反应历程催化特性环境适应性第4页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰酶分子修饰的条件修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维持酶活性功能的必需基团pH值与离子强度决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应反应体系中酶与修饰剂的比例控制二者的比例，防止酶的过度修饰而导致的活性完全丧失第5页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰第6页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰化学修饰的方法学揭示了蛋白质必需基团的化学修饰和活性丧失的定量关系邹氏作图法袁勤生,《现代酶学》p139第7页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰化学修饰的方法学第8页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰酶分子修饰的种类金属离子置换修饰（重点）大分子结合修饰（重点）侧链基团修饰（重点）亲和修饰肽链有限水解修饰（重点）核苷酸链有限水解修饰氨基酸置换修饰核苷酸置换修饰酶分子的物理修饰酶的定向进化修饰第9页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰金属离子置换修饰Metalionsubstitutemodification把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明催化机制适用对象：金属酶（metalloenzyme）一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为辅因子金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构象起稳定作用金属酶纯化时仍保留着定量的功能金属离子第10页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰金属离子置换修饰常见的金属酶及其离子种类

-淀粉酶——Ca2+、Mg2+、Zn2+谷氨酸脱氢酶——Zn2+过氧化氢酶——Fe2+酰基氨基酸酶——Zn2+超氧化物歧化酶——Cu2+、Zn2+细胞色素P450单加氧酶——Fe2+固氮酶——Fe(II)、Mo(IV)谷胱甘肽过氧化物酶——Se(IV)主要的金属离子Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn等CytP450第11页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰金属离子置换修饰金属离子置换修饰的方法酶的提纯除去原有金属离子加入金属螯合剂，如EDTA等，让酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物透析、超滤或层析除去螯合物加入置换的离子加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合用透析或层析等方法除去未结合的离子第12页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰金属离子置换修饰金属离子置换修饰的作用阐明金属离子对酶催化作用的影响一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶/辅基可逆结合，从而起到催化作用提高酶的催化效率将Zn型

-淀粉酶置换成Ca型，活力可提高20%～30%增强酶的稳定性Fe-SOD置换成Mn-SOD后稳定性增强，对NaN3

敏感性降低改变酶的动力学特性酰化氨基酸水解酶活性部位的Zn被Co置换后，酶的底物专一性（Km

值）和最适pH都显著改变第13页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰Macromoleculescombinemodification采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生某些精细的改变，从而改变酶催化特性的方法常用的大分子糖、糖的衍生物聚乙二醇（PEG）含C=C双键单体聚合得到的聚合物多肽链，甚至蛋白质第14页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰大分子结合修饰的方法选择修饰剂选择溶解性好、生物相容性好、抗原性弱、无毒的大分子聚乙二醇（PEG）、寡聚糖、多糖及其衍生物等修饰剂的活化将修饰剂分子中的基团（—OH）转化为高反应性的基团修饰反应将活化过的修饰剂与纯化的酶液按照一定比例混合反应，控制温度、pH等条件分离层析分离，除去多余的修饰剂第15页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）PEG既可溶于水，又可溶于多种有机溶剂微毒或无毒免疫原性低生物相容性好，已通过FDA认证分子量范围很宽，从几百到数十万，选择余地大末端有两个能被活化的—OH基团为了获得单功能的PEG，将其中一个羟基转化为烷氧基，即单甲氧基聚乙二醇（MPEG）第16页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——MPEG三氯均三嗪活化法（重点掌握）第17页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——MPEG叠氮法：将—OH转化为—N3

基团第18页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——MPEG琥珀酸酐法（溴代或碘代琥珀酸酐）第19页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——MPEG重氮法：将—OH转化为—N=N基团第20页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——右旋糖酐（dextran）右旋糖酐是由葡萄糖通过

-1,6-糖苷键形成的高分子多糖水溶性较好生物相容性好糖链上的2,3-双羟基经活化后可与酶分子中的氨基结合第21页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——右旋糖酐溴化氰（CNBr）法：糖酐活化第22页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——右旋糖酐溴化氰（CNBr）法：与酶偶联第23页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——右旋糖酐高碘酸（HIO4）氧化法第24页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——右旋糖酐高碘酸（HIO4）氧化法：增加连接臂第25页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——肝素（heparin）由D-

-葡萄糖醛酸（或L-

-艾杜糖醛酸）和N-乙酰氨基葡萄糖形成重复二糖单位组成的多糖在体内外都有抗凝血作用临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等第26页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——肝素碳二亚胺法（—COOH反应）第27页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰修饰剂——肝素三氯均三嗪法第28页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰大分子修饰的作用——提高酶的催化效率根本原因：改变了酶的空间构象，有可能促使酶活性中心与底物更容易结合酶的催化功能是由其空间结构决定的例1：1分子核糖核酸酶与6.5分子右旋糖酐共价结合，活力提高到原有的2.25倍例2：1分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐共价结合，酶的催化效率提高到原酶的5.1倍位阻效应第29页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰大分子修饰的作用——增强酶的稳定性水溶性大分子与酶结合，在酶分子外层形成保护层，可以保护酶的空间构象不溶性大分子与酶结合，形成固定化酶，也提高酶的稳定性稳定性的表征——半衰期酶的半衰期：酶活力降低到原来活力一半时所经过的时间大分子修饰酶半衰期相对稳定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)-SOD14h140Ficoll(高分子量)-SOD24h240PEG-SOD35h350第30页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰大分子结合修饰大分子修饰的作用——降低或消除抗原性酶非经口（如注射）进入人体后，会成为一种抗原，刺激体内产生抗体；当这种酶再次注射进体内时，抗体就会与作为抗原的酶特异地结合，使酶失去催化功能经过大分子修饰，酶蛋白的空间结构发生改变，致使酶蛋白与抗体之间不再发生特异性识别，从而降低了酶蛋白与体内抗体的结合几率例如：L-天冬酰胺酶[EC3.5.1.1]经PEG修饰后抗原性显著降低，已经在1994年被FDA批准用于治疗急性淋巴性白血病第31页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰Sideresiduesmodification采用一定的（化学）方法，使酶蛋白侧链基团发生改变，从而改变酶催化特性的修饰方法用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响荧光试剂修饰侧链，了解酶在水溶液中的构象各基团对酶结构和活性的影响，研究必需基团的组成对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力利用侧链修饰测定某种基团在酶分子中的数量改变酶的结构和催化性能第32页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰两类酶的修饰蛋白类酶侧链基团可组成各种次级键对蛋白质空间结构的形成和稳定起重要作用，而当这些功能基团发生改变，引起次级键改变，使空间结构发生某些变化，从而引起酶特性和功能的改变亲核性侧链基团：—OH、—COOH、—NH2、—SH、咪唑环 亲核性取代的氨基酸残基:Ser、Cys、Asp、Thr、Lys、His等亲电性侧链基团：芳香环、吲哚环 亲电性取代的氨基酸残基:Tyr、Trp核酸类酶磷酸基，核糖糖环上的—OH、碱基杂环及其—NH2、—OH等第33页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰几种重要的修饰反应酰基化—OH（Ser、Thr、Tyr）、—SH（Cys）、—NH2（Lys）烷基化多种基团均可发生，包括芳环和杂环氧化和还原酚基、—SH、杂环等芳香环取代涉及Phe、Tyr、Trp等几种芳香族氨基酸其他反应，如CNBr裂解反应第34页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰各类侧链基团的修饰氨基修饰（Lys）羧基修饰（Asp、Glu）巯基修饰（Cys）胍基修饰（Arg）羟基修饰（Ser、Thr、Tyr）咪唑基修饰（His）吲哚基修饰（Trp）甲硫基修饰（Met）分子内交联第35页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰1.氨基（—NH2）修饰的主要特点氨基在酶蛋白中主要是Lys的

-NH2

和肽链末端氨基非质子化的

-NH2

亲核反应活性很高，易被选择性修饰一般情况下

-NH2

的pKa=10，其解离程度取决于微环境氨基的修饰反应主要有酯化、N-烷基化等第36页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——氨基酰化反应第37页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——氨基TNBS反应和Sanger反应第38页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——氨基N-烷基化第39页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰2.羧基（—COOH）修饰的主要特点羧基在酶蛋白中主要是Asp和Glu的侧链—COOH，以及肽链的末端羧基在水溶液中，—COOH通常解离成负离子，亲核性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯、成酰胺反应第40页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——羧基碳二亚胺反应（羧基修饰的标准方法）第41页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——羧基酯化反应第42页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰3.巯基（—SH）修饰的主要特点巯基在酶蛋白中的来源是Cys的

-SH巯基的亲核性强，往往是酶分子中反应活性最高的基团巯基容易被氧化成—S—S—，在维持蛋白亚基之间的相互作用和酶催化过程中起重要作用巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的修饰产物第43页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——巯基二硫键置换反应第44页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——巯基与含汞有机物的反应（—SH对Hg的亲和力很强）第45页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——巯基S-烷基化反应第46页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰4.胍基（—N=C(NH2)2）修饰的主要特点胍基存在于酶蛋白的Arg残基侧链上在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起重要作用胍基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般采用具有两个邻位羰基的化合物，在中性或弱碱性条件下反应，一般是可逆反应第47页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——胍基（与邻二酮的反应）第48页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰5.酚基和羟基（—OH）修饰的主要特点酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：Ser、Thr、Tyr羟基的专一性修饰较困难，通常修饰剂能同时修饰羟基、氨基和巯基Tyr的酚羟基相比于Ser和Thr的羟基要活泼一些，更容易发生修饰；酚基具有芳香性，能发生亲电取代反应第49页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——酚基和酚羟基酚基亲电取代反应第50页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——（酚）羟基O-酰基化反应第51页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰6.咪唑基修饰的主要特点咪唑基存在于酶蛋白的His残基侧链上His是多种酶的活性中心，是电荷中继网中的重要成员对His咪唑基的修饰，一般是通过N-烷基化或C-亲核取代来进行对咪唑进行修饰后，酶活性一般会受到显著影响第52页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——咪唑基N-取代反应焦碳酸二乙酯第53页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——咪唑基杂环上的亲电取代反应第54页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰7.吲哚基修饰的主要特点吲哚基存在于酶蛋白的Trp残基侧链上Trp残基疏水性较强，一般位于酶分子的内部，反应活性比氨基和巯基差，因此对其修饰较困难，很多能与吲哚基反应的试剂，一般优先与巯基或氨基反应有时候Tyr会对吲哚基的修饰产生干扰第55页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——吲哚基与Koshland试剂的反应第56页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰8.甲硫基修饰的主要特点酶蛋白中Met残基中的硫以硫醚的形式存在硫醚中的硫原子虽然具有亲核性，但反应活性较差，在温和的条件下一般不发生反应硫醚的主要反应主要是氧化反应，产物为砜和亚砜；另外，采用某些试剂也可以进行S-烷基化反应第57页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰修饰反应——甲硫基第58页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰9.分子内交联（掌握概念）采用双功能基团化合物（双功能试剂），在酶分子中对空间距离较近的两个氨基酸残基侧链基团之间进行共价交联第59页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰侧链基团修饰分子内交联试剂同型、异型可裂解、不可裂解第60页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰亲和修饰Affinitymodification，酶的专一性修饰试剂作用于特定部位的某一基团，而不与这一部位之外的同类基团反应用于酶化学修饰的试剂，即使对某一基团反应是专一的，也仍然有多个同类残基与之反应，因此对某个特定残基的选择性修饰比较困难，为了解决此问题，开发了亲和标记试剂这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂，一般具有与底物相似的结构，对酶活性部位具有高度的亲和性，可专一性标记于酶的活性中心上，使酶不可逆失活，因此也称专一性不可逆抑制剂第61页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰亲和修饰第62页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰亲和修饰亲和标记试剂的特点在使酶不可逆失活以前，要与酶形成可逆复合物亲和试剂的修饰程度是有限的竞争性类似物的存在会降低修饰反应速率亲和试剂体积不能太大，否则造成较大的空间位阻修饰产物应当稳定，应便于表征和定量第63页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰亲和修饰KS

型（竞争性标记试剂）根据底物的结构设计的，具有与底物结构相似的结合基团，同时还具有能与酶活性部位氨基酸侧链反应的活性基团特点底物、竞争性抑制剂及其他结构类似物对修饰具有保护作用修饰反应是定量定点进行的Kcat

型（自杀性标记试剂）根据酶催化过程设计，专一性很高具有酶的底物性质，还有一个潜在的反应基团在酶催化下活化，与酶活性部位氨基酸侧链发生反应，不可逆地结合第64页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰肽链有限水解修饰Peptidechainlimithydrolysismodification在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生精细改变，从而改变酶催化特性的修饰方法肽链是蛋白类酶的主链，是酶分子结构的基础活性中心的肽段是酶催化作用必不可少的活性中心之外的肽段维持酶的空间构象肽链被水解后可能出现的情况酶活性中心破坏，酶失去催化功能——探测酶活性中心位置酶活性中心构象完整，酶活力保持不变或损失不多，但抗原性发生变化——提高酶的药用价值活性中心形成，与底物结合能力提高并形成准确的催化部位——酶催化功能增强或酶活力提高第65页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰肽链有限水解修饰酶蛋白主链修饰——酶切/酶原激活法胃蛋白酶原（pepsinogen）的自激活意义：保护作用，避免了过量的胃蛋白酶对胃壁自身进行消化第66页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰肽链有限水解修饰酶蛋白主链修饰——酶切/酶原激活法胰蛋白酶原（trypsinogen）的水解激活

利用胰蛋白酶或肠激酶从trypsinogen的N-端切除一段六肽序列：N-Val—(Asp)4—Lys第67页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰肽链有限水解修饰酶蛋白主链修饰——酶切/酶原激活法胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活第68页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰肽链有限水解修饰酶蛋白主链修饰——酶切/酶原激活法Klenow片段：基因工程的工具酶E.coliDNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C-末端605个氨基酸残基片段。保留了DNA聚合酶I的5’3’聚合酶和3’

5’外切酶活性，但缺少完整酶的5’3’外切酶活性。第69页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰核苷酸链剪切修饰Nucleotidechaincleavagemodification仅见于R酶的分子修饰，指在核苷酸链的限定位点进行剪切，使R酶的结构发生改变，从而改变其催化特性的方法L-19IVS的形成四膜虫（Tetrahymena）26SrRNA前体自我剪接形成成熟的26SrRNA，同时生成414nt的线性间隔序列LIVSLIVS经一系列剪接、环化、开环过程最终得到多功能R酶L-19IVS第70页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰氨基酸置换修饰Amino-acidsubstitutemodification将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改变酶催化特性的修饰方法肽链上某个氨基酸的改变会引起酶化学结构和空间构象的改变氨基酸置换修饰的作用提高酶的催化效率（例：酪氨酸-RNA合成酶Thr51

Pro51，对ATP亲和力提高近100倍，催化效率提高25倍）增强酶的稳定性（例：T4溶菌酶Ile3

Cys3，与Cys97

形成二硫键，热稳定性提高）改变酶的专一性（例：农杆菌

-葡萄糖苷酶Glu358Ala358，失去水解活性，却能催化糖苷合成）第71页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰氨基酸置换修饰置换修饰方法——化学修饰对某些侧链结构相近的氨基酸残基进行基团修饰，从而变成另一种氨基酸残基难度较大，很难精确操作第72页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰氨基酸置换修饰置换修饰方法——定点突变在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变蛋白质工程常用的技术手段1983年，美国生物学家Ulmer首先提出了“蛋白质工程”的概念蛋白质工程通过改造蛋白质相对应基因中的碱基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到宿主细胞中，通过基因表达而获得具有新特性的蛋白质的技术过程蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有诸多同基因工程技术相似的地方，因此蛋白质工程也被称为第二代基因工程第73页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰氨基酸置换修饰定点突变主要步骤1)新的分子结构设计根据已知蛋白酶的化学结构、空间结构及其特性，确定新蛋白质或酶的氨基酸排列顺序

，乃至欲置换的核苷酸及其位置2)突变基因的核苷酸序列确定逆推法第74页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰氨基酸置换修饰定点突变主要步骤3)突变基因的获得用DNA合成仪合成有数个核苷酸被置换了的寡核苷酸链，再以此寡核苷酸链为引物，通过PCR扩增获得所需的大量突变基因，即寡核苷酸诱导的定位突变4)新酶的获得——重组表达将定位突变获得的突变基因进行体外重组，插入适当的基因载体中，通过基因操作技术转入特定的宿主细胞中，培养并表达所需的修饰酶第75页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰氨基酸置换修饰实验操作大致步骤1)先测定酶的一级结构2)用NMR、X射线衍射法等方法分析测定其三维结构3)根据结构信息选择突变部位，即选定哪一个氨基酸残基要被取代4)选择4～6个氨基酸残基的寡肽序列，其间含待取代的氨基酸残基5)用化学法合成由12～18个碱基组成并为所选寡肽的氨基酸序列编码的核苷酸序列，作为定位诱变的引物6)构建单股质粒，含有为所需蛋白质编码的基因，作为定点突变的模板第76页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰氨基酸置换修饰实验操作大致步骤7)将引物与单链模板DNA配对，用PCR法将引物延长，形成互补链，得到共价闭合的双链DNA，也叫异质双链质粒8)将异质双链质粒引入宿主细胞（如E.coli），转化为两个同质双链质粒，一个含天然蛋白质编码的基因，另一个含编码突变体的基因9)将这两个基因分离并克隆，最后产物是细胞转化突变型，能合成突变体蛋白质，与母体蛋白质仅有1个氨基酸的差别，这个氨基酸就是事先选定的突变部位第77页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰核苷酸置换修饰Nucleotidesubstitutemodification将R酶分子核苷酸链上的某个（或数个）核苷酸置换成其他的核苷酸，一般采用定点突变技术自我剪切酶的保守序列和剪切位点序列与酶的催化作用关系密切对自我剪切酶的结构与功能研究可了解酶催化中心必需基团，据此进行分子改造，从催化分子内反应的R酶设计出催化分子间反应的R酶第78页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰核苷酸置换修饰核苷酸置换对催化特性的影响例：L-19IVS活性中心碱基变化L-19IVS22～27位核苷酸序列底物催化产物III5’―GGAGGG―3’GGCCUCUAAAAA(1)GGGCCUCU+GAAAAAGGCCUGUAAAAA(2)G/GGCCGCUAAAAA(3)G/5’―GCAGGG―3’(1)G/(2)GGGCCUGU+GAAAAA(3)G/5’―GGCGGG―3’(1)G/(2)G/(3)GGGCCGCU+GAAAAA第79页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰核苷酸置换修饰Nucleotidesubstitutemodification例：锤头型核酶（hammerheadribozyme）1989年，Koizumi证明只要保留11个核苷酸保守序列即可催化自我剪切反应。第80页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰核苷酸置换修饰锤头型核酶的置换修饰除了11个保守核苷酸以外的其他核苷酸都可以置换修饰第81页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰核苷酸置换修饰发夹型核酶（hairpinribozyme）的置换修饰1989年，Hamp提出烟草环斑病毒（sTRSV）负链RNA自我剪切反应是基于发夹结构（一种回文结构），只要形成此结构就会在底物识别序列处自动催化剪切反应第82页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰酶分子的物理修饰Physicalmodification通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法研究极端条件下酶结构和活性的变化“极端微生物”物理修饰的特点——非共价不改变酶的组成单位及其基团酶分子中的共价键不发生改变——酶的一级结构不变副键发生某些改变和重排——酶的高级结构发生变化第83页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰酶分子的物理修饰物理修饰的效果改变底物特异性例：羧肽酶

经高压处理，其水解能力降低，而有利于催化肽的合成反应（逆反应）改变酶催化的最适温度例：纤维素酶经高压处理，最适温度下降，但在30～40oC条件下，活力提高了10%提高酶的稳定性例：用盐酸胍破坏胰蛋白酶的空间构象，伸展肽链，再透析除去盐酸胍，在不同温度下重新构建/恢复酶的构象，50oC下重新构建的酶稳定性比天然酶提高5倍第84页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰酶的定向进化修饰Enzymedirectedevolution模拟自然进化（随机突变和自然选择）的过程，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体定向进化的三个过程随机突变：产生基因多态性构建突变基因文库：将突变基因与适当的载体重组定向选择：高通量筛选方法随机突变的方法易错PCR（error-pronePCR）DNA改组（DNAshuffling）第85页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰酶的定向进化修饰易错PCR（error-pronePCR）通常PCR使用的TaqDNA聚合酶失去了3’

5’方向的校正活性，因此核苷酸错误掺入的几率约为5×10-5如果配合适当的条件，调整正常PCR体系中dNTPs的浓度和比例，提高Mg2+

浓度，引入Mn2+

，可以高频率随机引入错配的突变位点，构建突变文库，再筛选突变体连续多次反复地随机诱变，通过每一步的积累产生有益突变第86页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰酶的定向进化修饰DNA改组（DNAshuffling）从正突变的基因库（可以通过易错PCR构建）中分离出DNA片段，用脱氧核糖核酸酶DNaseI随机切割，得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环，随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直至获得全长的基因将亲本基因群中的优势突变尽可能地组合在一起，最终使酶分子的某一性质得到进一步进化第87页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰酶的定向进化修饰突变文库的定向筛选根据进化的目标设定选择环境条件例：为提高酶的热稳定性，可以在较高的温度下培养重组细胞，并在每一次“突变－筛选”的循环中逐步提高培养温度高通量筛选96孔板（384孔板）筛选标记筛选（荧光标记、放射性标记）噬菌体表面展示技术酵母细胞表面展示技术……第88页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰酶的定向进化修饰例：对硝基苄酯酶的定向进化修饰第89页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰酶的定向进化修饰例：酯酶的定向进化修饰将10

g用PCR扩增过的亲本DNA片段用DNaseI切割，在PwoDNA聚合酶催化下进行第一次PCR扩增，35轮循环后补加PwoDNA聚合酶，再进行35轮循环，得到的扩增产物进行第二次PCR常规扩增将扩增产物和pNB106R质粒用BamHI和XbaI酶切，体外连接后转化到E.coli.TG1宿主细胞中，获得重组子在一定浓度DMF溶液中对底物LCN-pNB的催化活力进行筛选，得到一株高活性进化酶；在DMF水溶液中催化水解含p-硝基苄酯结构的化合物活力可提高30倍第90页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰修饰酶的特性总结修饰酶的酶学性质变化最适pH值热稳定性体内抗原性半衰期酶动力学性质对组织的分布能力变化第91页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰修饰酶的特性总结热稳定性修饰剂与酶形成多点交联，一般能增强酶的热稳定性，可能的原因是多点交联产生固定酶分子构象的效应PEG修饰酶在热稳定性上没有明显提高，可能由于PEG和酶是单点交联酶分子内基团间相互作用在受热情况下发生了变化，向热力学上熵增加的方向变化，即从紧密有序趋于随机松散通过修饰后，使酶天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，减小热振动，从而增强酶的热稳定性第92页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰修饰酶的特性总结最适pH值一般情况下，修饰酶的最适pH范围扩大猪肝尿酸酶的最适pH为10.5，在pH7.4的生理环境中酶活仅剩5~10%，用白蛋白修饰后，最适pH范围扩大，在pH7.4时仍保留60%酶活吲哚-3-链烷羟化酶修饰后，最适pH从3.5增加到5.5，在pH7左右时，修饰酶活力比天然酶增加3倍，在生理环境下抗肿瘤效果比天然酶大得多可能的原因修饰酶的微环境更稳定修饰酶被“固定”在一个更活泼的状态第93页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰修饰酶的特性总结半衰期酶经修饰增强了抗蛋白水解、抗抑制剂和抗失活因子的能力及对热稳定性提高，半衰期一般都比天然酶延长体内抗原性有些修饰剂在消除酶抗原性上并无作用，如PVP（聚乙烯吡咯烷酮）修饰酶；糖类物质也不容易消除酶的抗原性现在比较公认的是PEG和人血清蛋白在消除酶抗原性上效果明显，原因可能是修饰剂破坏（共价结合）或“遮盖”了抗原决定簇，使之抗原性减弱或消除第94页,共103页，星期六，2024年，5月酶分子修饰修饰酶的特性总结酶动力学性质绝大多数酶经修饰后最大反应速度Vmax

没有变化有些酶在修饰后，米氏常数Km

通常会增大，这可能是交联于酶上的分子或基团产生了空间障碍，影响了底物对酶的接近和结合修饰酶抵抗各种失活因子的能力增强和体内半衰期的延长，能够弥补Km