质粒的提取和纯化

关于质粒的提取和纯化内容一.质粒的概念和提取原理二.碱裂解法的实验操作和原理三.煮沸法快速提取质粒的实验操作和原理四.实验室使用的方法五.质粒纯化后的检测第2页,共16页，星期六，2024年，5月一.质粒的概念和提取原理质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活.第3页,共16页，星期六，2024年，5月一.质粒的概念和提取原理质粒在细胞内的复制一般有两种类型:

紧密控制型(Stringentcontrol)

松驰控制型(Relaxedcontrol)第4页,共16页，星期六，2024年，5月一.质粒的概念和提取原理在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。第5页,共16页，星期六，2024年，5月实验中使用的三个溶液1,溶液Ⅰ：

葡萄糖—使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部.

Tris.Cl(pH8.0)—提供反应的最佳环境.EDTA(pH8.0)—Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,抑制DNase(脱氧核糖核酸酶)的活性和抑制微生物生长.

第6页,共16页，星期六，2024年，5月实验中使用的三个溶液2,溶液Ⅱ：NaOH(临用前用10mol/LNaOH

母液稀释)1％SDS

注:要新从浓NaOH稀释制备NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性.NaOH细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化,瞬间就溶解.当然SDS也是碱性的,但是很弱,只能抽提得到少量质粒.第7页,共16页，星期六，2024年，5月实验中使用的三个溶液3,溶液Ⅲ：KAc冰醋酸ddH2O注:冰醋酸的作用是为了中和过量的NaOH.KAc是提供K+和SDS反应,取代Na离子,形成十二烷基硫酸钾(PDS),而PDS是难溶于水的.SDS易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,同时长长的基因组DNA也一起被共沉淀了.但是SDS并不与DNA分子结合.第8页,共16页，星期六，2024年，5月二，碱裂解法的操作步骤1,取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液,高速离心,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。

2,加入溶液I,充分悬浮菌体细胞。

3,加入新配制的溶液II,盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴5分钟。

4,加用冰预冷的溶液III,摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。

5,4℃下离心15分钟。

第9页,共16页，星期六，2024年，5月二，碱裂解法的操作步骤6,取上清液,加入RNA酶A,37℃水浴20分钟。

7,加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下高速离心10分钟。

8,取上层水相,加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下高速离心10分钟。

9,取上层水相,加入2倍体积的无水乙醇,室温放置几分钟,离心。

10,4℃下高速离心15分钟,沉淀用数ml70%冰冷乙醇洗涤,4℃下高速离心5分钟。

11,吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。

12,得到的质粒样品一般用TE缓冲液或者ddH2O进行溶解.第10页,共16页，星期六，2024年，5月注意的事项一,在加溶液Ⅱ后:①.时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；②.必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。二,加入的酚必须要用氯仿和乙醇洗涤干净,否则对后面的实验有影响.三,沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。四,提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提.

第11页,共16页，星期六，2024年，5月三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤（1）将2ml含相应抗生素的LB培养基加入到容量为15ml的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在37℃剧烈震荡（250rpm）培养过夜。

（2）将1.5ml培养物转入离心管中，在4℃条件下离心30秒。

（3）弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于200mlSTET缓冲液（8%蔗糖，0.5%Triton,50mmol/LEDTA,,10mmol/LTris）

，用涡旋混合器充分混匀。

（4）加入4ml新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下5min。

（5）用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45秒，取出后立刻离心10min。

第12页,共16页，星期六，2024年，5月三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤（6）用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8ml5%CTAB(十六烷基三甲基溴化氨)，用混合器混匀后，高速离心5min，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体。

（7）加入1.2M氯化钠300ml，充分溶解沉淀物，再加入750ml的冷乙醇，充分混匀后，离心15min，弃上清液。

（8）取1ml70%冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心5min。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min。

（9）沉淀物溶于50mlTE缓冲液中，混合器混匀。

（10）即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用.第13页,共16页，星期六，2024年，5月四，实验室使用的操作步骤1,取1.5ml含细菌的培养液,离心,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。2,加入溶液I,充分悬浮菌体细胞。

3,加入新配制的溶液II,盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴5分钟。4,加用冰预冷的溶液III,摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。5,4℃下离心15分钟。第14页,共16页，星期六，2024年，5月四，实验室使用的操作步骤6,取上清液加新的离心管中.7,加入纯化树脂,混匀,放置10min.8,将溶液转移到离心纯化柱中,高速离心.9,倒掉下管中的溶液,再加80%异丙醇,洗涤两次,每次离心30s,再干甩一次