临床微生物检验与临床专家讲座

临床微生物检验

与临床临床微生物检验与临床第1页机遇与挑战并存感染病因复杂免疫力低下人群急剧上升全民关注感染问题相关部门重视未知病原判定临床要求有效时间内有效汇报细菌检验人员技术面和设备不能满足临床要求信任危机临床微生物检验与临床第2页当代感染特点新感染性疾病:SARS、禽流感、猪流感已被征服疾病卷土重来：结核、性病、炭疽低免疫人群急剧上升：艾滋病、移植患者动物微生物向人类攻击细菌耐药、经验性用药失败、细菌培养阳性率低、细菌汇报最少3天，离8h出汇报相差很远临床微生物检验与临床第3页思索我们应怎样面对挑战？临床微生物检验与临床第4页微生物学发展中大事件迷茫时代很早以前中国人就知道了有些疾病能够传染，但认为是由不可见“神”或“鬼”引发古埃及、古印度也有一样传说到我国明代李时珍《本草纲目》中就有了将病人穿过衣服蒸过以后再穿就不会传染疾病记载

直到17世纪后期创造了显微镜后才真正观察到了微生物存在临床微生物检验与临床第5页

显微镜问世揭开了微生物检验序幕

1676年荷兰人虎克创制了一台能放大200-300倍显微镜，发觉了许多肉眼看不见微小生物，并正确地描述了微生物形态有球形、杆状、螺旋体等，为微生物存在提供了证据微生物学发展中大事件临床微生物检验与临床第6页

巴士德开创造了微生物生理课时期

直到19世纪60年代，法国科学家巴士德创造了加温处理物品巴氏消毒法，证实了有机物发酵和腐败是微生物作用结果，开始了微生物生理课时期，人们认识到不一样微生物间不但有形态学上差异，在生理学特征上亦有所不一样虎克发觉了微生物存在，但缺乏基本认识和技术，微生物研究仍长久停滞，经历了近200年漫长过程微生物学发展中大事件临床微生物检验与临床第7页

李斯特开创了预防院内感染新纪元

在巴斯德研究结果启迪下，英国外科医生李斯特（JosephLister）用石炭酸喷洒手术室和煮沸手术用具，创建了无菌外科手术，成为微生物学应用于医学实践一个巨大成就，开创了预防院内感染新纪元微生物学发展中大事件临床微生物检验与临床第8页

微生物学创建及发展

德国医生郭霍创用了固体培养基分离细菌和细菌染色法，使他和巴士德一道成为试验微生物学奠基人，并提出了著名郭霍法则今后，微生物学才真正创建并极大发展自郭霍法则提出后20年是细菌学发展黄金时代，相继分离出炭疽杆菌，结核杆菌，霍乱弧菌，白喉杆菌，伤寒杆菌，脑膜炎球菌，破伤风杆菌，鼠疫杆菌，痢疾杆菌等微生物学发展中大事件临床微生物检验与临床第9页

病毒发觉

1892年俄国科学家伊凡洛夫斯基发觉了一个可经过细菌滤器最微小生物-病毒

微生物学发展中大事件临床微生物检验与临床第10页

磺胺发觉

1907年Gelmo在研究偶氮染料时制成了氨苯磺胺（最初时作为一个红色染料），1935年杜玛克（domagk）将磺胺应用于医学，1936年用于临床，当初主要是治疗A组β-溶血性链球菌所致产褥热，使病死率显著下降，于1939年荣获诺贝尔医学奖微生物学发展中大事件临床微生物检验与临床第11页

青霉素发觉1929年Fleming发觉青霉素并随即由Florey和Chain用于临床（1939年分离提纯成功、1942年用于临床）并取得惊人效果，于1945年三人共同荣获诺贝尔医学奖微生物学发展中大事件临床微生物检验与临床第12页二战时一张张贴画，标志着抗生素时代到来微生物学发展中大事件临床微生物检验与临床第13页

抗生素发觉

1944年Waksman自灰链霉菌培养中分离出可拮抗结核杆菌链霉素，于1952年荣获诺贝尔医学奖1947年创造氯霉素1947年发觉多粘菌素1948年发觉金霉素1949年发觉新霉素

1950年发觉土霉素。。。微生物学发展中大事件临床微生物检验与临床第14页1943年青霉素大规模使用，1945年院内感染20%金黄色葡球菌对其产生抗性1947年链霉菌素上市，同年该药耐药菌出现1952年四环菌素上市，1956年其耐药菌出现1959年甲氧西林上市，1961年其耐药菌出现

细菌耐药性第一次提到了主要日程抗生素使用与细菌耐药改变临床微生物检验与临床第15页1964年头孢噻吩上市，1966年其耐药菌出现1967年庆大霉素上市，1970年其耐药菌出现1981年头孢噻肟上市，1983年其耐药菌出现1996年，发觉万古霉素耐药菌年利奈唑胺上市，年其耐药菌出现抗生素使用与细菌耐药改变临床微生物检验与临床第16页逐步上升到用20万、100万、400万、以及更高单位才能控制，甚至对青霉素产生耐药性伴随抗生素尤其是二代与三代头孢菌素广泛使用，造成了多重耐药菌不停增多并快速扩散，它对许多抗生素产生耐药性1943年用2万单位青霉素就能够控制感染

细菌耐药性问题再次被提到了主要日程抗生素使用与细菌耐药改变临床微生物检验与临床第17页这些耐药菌、尤其是多重耐药及泛耐药菌，已经成为当前临床医生难以对付“超级细菌”抗生素使用与细菌耐药改变临床微生物检验与临床第18页早在抗生素应用以前有些细菌就含有抗药基因早在人工合成抗生素使用之前，细菌就与自然界中一些天然抗菌成份以及其它微生物产生抗菌物质广泛接触而取得了耐药基因.（如放线菌代谢产物、天然植物、中草药等）抗生素使用与细菌耐药改变临床微生物检验与临床第19页细菌耐药属于一个自然现象，是微生物进化结果细菌抗药性也是进化选择结果，抗生素滥用加剧了细菌耐药性产生细菌在生长繁殖过程中会产生耐药性基因突变，在使用抗生素选择压力下，耐药性细菌被筛选出来并优势繁殖抗生素使用与细菌耐药改变临床微生物检验与临床第20页细菌耐药已成为21世纪全球关注热点对人类生命健康所组成威胁绝不亚于艾滋病，癌症和心血管疾病预防滥用抗生素而造成耐药菌出现及快速传输、不停研究开发新抗菌药品是战胜细菌耐药主要路径抗生素使用与细菌耐药改变临床微生物检验与临床第21页临床微生物检验与临床第22页临床微生物检验与临床第23页临床微生物检验与临床第24页临床微生物检验与临床第25页抗菌药品临床应用管理方法第三章抗菌药品临床应用管理第十六条

……三级医院抗菌药品品种不得超出50种；二级医院不得超出35种，同一通用名称药品品种，注射剂型和口服剂型各不得超出2种，处方组成类同复方制剂1-2种。含有相同或相同药学特征药品不得重复采购。第二十八条……医疗机构住院患者抗菌药品使用率不得超出50%……门诊抗菌药品处方百分比不得超出15%。临床微生物检验与临床第26页抗菌药品临床应用管理方法第三章抗菌药品临床应用管理第二十九条二级以上医院应该开展细菌耐药监测工作，定时公布细菌耐药信息，建立细菌耐药预警机制，针对不一样细菌耐药水平，采取不一样应对办法。对接收抗菌药品治疗患者中，微生物检验样本送检率不得低于30%。（一）对主要目标细菌耐药率超出30%抗菌药品，应及时将预警信息通报本机构医务人员。（二）对主要目标细菌耐药率超出40%抗菌药品，应慎重经验用药。（三）对主要目标细菌耐药率超出50%抗菌药品，应参考药敏试验结果选取。（四）对主要目标细菌耐药率超出75%抗菌药品，应暂停该类抗菌药品临床应用，依据追踪细菌耐药监测结果，再决定是否恢复其临床应用。临床微生物检验与临床第27页入选前抗生素使用情况对致病菌分离率影响P<0.05临床微生物检验与临床第28页标本采集部位非无菌部位无菌部位眼血液耳骨髓呼吸道脑脊液肠胃道胸水泌尿道腹水皮肤关节液毛发临床微生物检验与临床第29页痰（Sputum）痰液通常作为下呼吸道细菌感染标本。痰液是一个由支气管分泌物和炎性渗出物组成混合物，经过口腔咳出。不论是采集适当标本，还是解释培养出结果都存在难点。因为繁忙和技术不够熟练或未接收培训人员可能会错误采集和送检唾液到试验室。通常需要重复送检痰培养，来确认真正致病株。临床微生物检验与临床第30页标本质量带血痰唾液or诱导痰(?)脓痰粘液样痰临床微生物检验与临床第31页结果分析发觉问题，怎么办？临床微生物检验与临床第32页阳性率低？采样部位；采样操作；运输方式及时间；培养环境；临床微生物检验与临床第33页在新形势下

重新审阅血培养临床微生物检验与临床第34页明确血培养临床意义血培养对以下疾病很主要—菌血症—感染性心内膜炎

—临床不明原因感染

—假体植入后感染（人工关节、人工瓣膜）

—静脉导管相关性菌血症

—肺炎血培养是最好工具帮助他们用药、降低死亡

临床微生物检验与临床第35页指示预后健康人能在几分钟内将血中菌消失病人则不能将病原菌控制在原发部位医生未能将病原菌，如：—去除失败

—引流不成功死亡率与病原菌、药敏谱、基础病相关，亦即提供了预后信息临床微生物检验与临床第36页败血症由感染引发全身感染发病率上升、在致死主导原因中居第十位非冠脉意外ICU中最多见致死原因器官功效障碍常见诱因临床微生物检验与临床第37页不一样部位感染败血症发生率临床微生物检验与临床第38页感染情况发病数：美国和欧洲80万/年败血症休克：40万/年死亡人数：20万/年北京协和医院：病死率38.4%,院内感染病死44.6%临床微生物检验与临床第39页当前血培养存在问题采样时污染严重培养一次阴性作为诊疗依据血液与培养基百分比不正确采样时间不正确少做厌氧培养不能及时汇报国际上依然公认血培养是诊疗血流感染金标准！临床微生物检验与临床第40页采血指针发烧（>38。C）或低温（<36。C）寒战白细胞增多皮肤黏膜出血昏迷多器官衰竭，血压降低，CRP升高及呼吸快特殊患者出现粒细胞降低，血小板降低等临床微生物检验与临床第41页皮肤消毒程序

70%酒精

1%~2%碘酊30秒或者10%碘伏消毒60秒70%酒精脱碘临床微生物检验与临床第42页皮肤和环境细菌在严格消毒条件下，仍有3%~5%污染菌”：皮肤菌表皮葡萄球菌座疮丙酸杆菌梭杆菌属类白喉群环境菌：革兰阳性杆菌、不动杆菌临床微生物检验与临床第43页皮肤和环境细菌何种情况下考虑可能是菌血症致病菌？对两次不一样部位血培养生长同一个微生物其它无菌部位标本培养中生长同一个微生物微生物快速生长<=48小时试验室工作人员和医生之间进行交流沟通，结合临床讨论这些菌意义临床微生物检验与临床第44页静脉穿刺和培养接种程序

在穿刺或穿刺期间，不可接触穿刺点

用注射器无菌穿刺取血后，勿换针头，直接注入血培养瓶血标本接种培养瓶后，轻轻混匀以预防血液凝固，马上送检临床微生物检验与临床第45页血培养次数病特点

阳性率1套1+2套1+2+3套普通菌血症65%80%96%感染性心内膜炎80%年汇报：163位病人，血培养仪临床微生物检验与临床第46页血培养次数怀疑菌血症成人患者：采集2~3套血培养标本（不一样部位）婴幼儿患者：采集两次血培养标本（不一样部位）除特殊情况外，在采集血培养后2~3天内，无需重复采集血培养可疑连续性菌血症：如心内膜炎、导管相关血流感染，间隔（1~24h）几次取血检测、捕捉、指导治疗临床微生物检验与临床第47页试验室类型: 美国私立大医院微生物试验室

医院病床数: 800beds

微生物标本量: 600个标本/天

血培养标本量: 150瓶/天

血培养标准采样: 3套瓶/24小时(1个需氧瓶+1个厌氧瓶=1套)

阳性结果: 10-30株需氧或兼性厌氧菌/天,2株厌氧菌/月

BacT/ALERT3D240 7台临床微生物检验与临床第48页

试验室类型: 美国大型独立试验室

标本起源: 14家中型医院和一些小诊所

微生物标本量: 8000个标本/天

血培养标本量: 1400瓶/天

阳性结果: 75-100个阳性结果/天

BacT/ALERT3D240 30台(5列,每列6台)临床微生物检验与临床第49页中国某三甲医院

微生物送检标本分布（3200床位）

（40,000标本/年）临床微生物检验与临床第50页香港大学玛丽医院微生物科工作人员医师4人技术员30余人文秘和工人约30人天天接收标本约800份血培养200~300份痰培养100份

………..工作制度（24小时值班制度）白天每隔半小时查对、接种新到标本夜间则延长至1小时临床微生物检验与临床第51页国内外血培养频率1000张床位医院名称天天血液培养瓶北京协和医院60-100美国马里兰州某医院200-350临床微生物检验与临床第52页菌血症病原菌种类组成需氧瓶厌氧瓶需氧菌兼性厌氧菌厌氧菌病原菌培养更完整临床微生物检验与临床第53页厌氧血培养瓶作用不但培养厌氧菌可帮助提升兼性厌氧菌阳性率临床微生物检验与临床第54页血液在需氧瓶和厌氧瓶中分配提议常规情况下，一份血培养应包含：1个需氧瓶和1个厌氧瓶（1次穿刺）当采血量不能满足推荐采血量时，应首先满足需氧瓶需要。注意：对于仅用需氧瓶试验室来讲，每次采血必须注入2个需氧瓶中以确保足够量采血量。临床微生物检验与临床第55页采血时机细菌通常在寒战和发烧前1小时入血，此时为采血培养标本进行病原培养最正确时机在考虑使用抗菌药品之前。马上采集血培养标本提议同时或间隔短时间内采集2套以上血培养标本临床微生物检验与临床第56页血培养采集部位从静脉取血不宜从静脉导管或静脉留置口取血如必须从留置导管内采血，应同时从外周静脉采集另一个血培养标本，以帮助阳性结果判读临床微生物检验与临床第57页尽快送检做血培养患者多数病情危急，采血后应马上送检，如不能马上送检，需室温保留或置35。C孵箱中，切勿冷藏临床微生物检验与临床第58页全自动血培养系统连续振荡孵育和检测同时进行，每10分钟检测一次，可及时发觉阳性结果并汇报无须盲传，降低了血培养污染机会2天内可汇报90%以上阳性结果培养基添加各种促细菌生长因子，适合各种细菌生长可进行需氧菌、厌氧菌培养，也可进行结核菌培养临床微生物检验与临床第59页血培养结果汇报临床微生物检验与临床第60页紧急处理和优先标准提议在有条件医院，经过医院信息系统，让临床医生随时掌握血培养检测进展情况，包含血培养已开单，但未收到血培养已收到24小时无细菌生长48小时无细菌生长检测中，尚无结果有菌生长，分离培养和药敏进行中阳性培养结果（细菌判定和药敏试验最终止果）临床微生物检验与临床第61页加强与临床科室联络要主动配合、加强交流、促进了解、相互协作、必要时参加相关科室感染病例会诊，讨论相关诊治方面问题，提出有效方案，尤其对检出细菌种类和耐药情况作出说明，提出预防耐药性和医院感染警报和办法。临床微生物检验与临床第62页Case1男，98岁，入院诊疗：AECOPD肺炎？发烧：39.4度，X光检验：右肺肺炎WBC:17.8X109/L,中性粒细胞88%临床微生物检验与临床第63页Case1经验用药及培养结果亚胺培南、替考拉宁、氟康唑，用药24h后，症状无改变。痰培养：铜绿假单胞菌（++）、鲍曼不动杆菌（+）肺泡灌洗液培养：铜绿假单胞菌入院3h做血培养：6h系统提醒阳性，涂片结果：革兰阴性杆菌临床微生物检验与临床第64页Case1经验用药及培养结果入院24h血培养初步药敏汇报：亚胺培南R头孢他啶R

环丙沙星R派拉西林/三唑巴坦R

头孢哌酮/舒巴坦I临床微生物检验与临床第65页Case1入院24h后改变治疗头孢派酮/舒巴坦代替亚胺培南入院后48h正式判定和药敏汇报铜绿假单胞亚胺培南R美罗培南R头孢他啶R派拉西林/三唑巴坦R

环丙沙星R头孢哌酮/舒巴坦I

氨曲南S教授提醒系统:可能是产金属酶细菌，对碳青霉烯类天然耐药，氨曲南可逃离金属酶水解临床微生物检验与临床第66页Case148h改变治疗48h改变治疗：氨曲南+妥布霉素56h症状显著改进48h、54h血培养：无菌生长，7天后痊愈出院临床微生物检验与临床第67页Case1启示经验性抗菌治疗带来不良后果细菌耐药机制检测，有利于合理使用抗生素快速准确判定有利于医院感染控制临床微生物检验与临床第68页阳性率影响原因临床微生物检验与临床第69页原理上，

常规致病菌只要有1个活菌落入培养瓶内，都应该能够在几天内被增殖到106～7（仪器汇报阳性）细菌以简单二分裂方式无性繁殖，其突出特点为繁殖速度极快。细菌分裂倍增必须时间，称为代时，细菌代时决定于细菌种类又受环境条件影响，细菌代时普通为20～30分钟，个别菌较慢，如结核杆菌代时为18～20小时，梅素螺旋体为33个小时。大肠杆菌代时为20分钟，以此计算，在最正确条件下8小时后，1个细胞可繁殖到200万上（2*106），10小时后可超出10亿，24小时后，细菌繁殖数量可庞大到难以计数据和程度。但实际上，因为细菌繁殖中营养物质消耗，毒性产物积聚及环境pH改变，细菌绝不可能一直保持原速度无限增殖，经过一定时间后，细菌活跃增殖速度逐步减慢，死亡细菌逐增、活菌率逐减。临床微生物检验与临床第70页有临床意义分离株

BourbeauPPetal.RoutineincubationofBacT/ALERTFAandFNbloodculturebottlesformorethan3daysmaynotbenecessary.

JClinMicrobiol.;43:2506-2509结果表明培养前三天，有临床意义分离株97%被检出，培养前两天检出率为94%。97％临床微生物检验与临床第71页Update……Low-levelbacteremia(=<10CFU/ml)maybemorecommoninpediatricpatients

thanhasbeenpreviouslythoughtandhasbeenreportedinupto38%ofculture-positivechildren,aspreviouslyreviewed(20).

如前所述，低浓度菌血症（=<10CFU/ml）占培养阳性儿童患者百分比已经到达38％，并可能比以往构想愈加多见……临床微生物检验与临床第72页应重新审阅厌氧瓶作用增加采血量增加兼性厌氧菌分离机会增加厌氧菌分离机会提升阳性率！临床微生物检验与临床第73页AnaerobicBloodCultures

UsefulintheICU?Despitetheseobservations,thereisunwillingnessinthemedicalcommunitytoalterthecurrentpracticeofobtaininganaerobicbloodcultures.Themostcompellingreasonforthisreluctanceisthatmostclinicallysignificantaerobicbacterialpathogensarefacultativeanaerobes.Continuingthepracticeofobtainingbothaerobicandanaerobicbloodcultures,therefore,ineffectdoublesthevolumeofbloodculturedandmay,thereby,increasetheisolationofthesefacultativeorganisms.

Moreover,therearesomepathogenicorganismsthatareclassifiedasfacultativeanaerobesthatgrowmorequicklyinanaerobicconditions.Thus,bloodculturesfortheseorganismsmaybepositiveearlieroronlypositiveintheanaerobicbloodculturebottle.RylandP.Byrd,Jr,MD,FCCPThomasM.Roy,MD,FCCPEastTennes