酶工程 抗体酶、核酶和极端酶

关于酶工程抗体酶、核酶和极端酶第一节抗体酶（Abzyme)一、抗体酶的理论基础抗体蛋白的特性：抗体（antibody）：抗原（antigen）：半抗原（hapten）：第2页,共61页，星期六，2024年，5月第3页,共61页，星期六，2024年，5月IgG的三级结构第4页,共61页，星期六，2024年，5月IgG与抗原形成

的交联晶格第5页,共61页，星期六，2024年，5月抗体与酶的异同：相同点：都是蛋白质，都有特异性。不同点：1）抗体无催化活力，酶有催化活力。2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。第6页,共61页，星期六，2024年，5月3）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。第7页,共61页，星期六，2024年，5月2.酶与底物形成过渡态理论

酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。第8页,共61页，星期六，2024年，5月二、抗体酶的定义抗体酶又称催化抗体（catalyticantibody），是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。第9页,共61页，星期六，2024年，5月

三、抗体酶的制备

1.诱导法用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。第10页,共61页，星期六，2024年，5月第11页,共61页，星期六，2024年，5月2.拷贝法用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶.第12页,共61页，星期六，2024年，5月第13页,共61页，星期六，2024年，5月3引入法将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术第14页,共61页，星期六，2024年，5月引入法举例第15页,共61页，星期六，2024年，5月四、抗体酶的应用

1.戒毒:

用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。第16页,共61页，星期六，2024年，5月2.

肿瘤治疗

抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。第17页,共61页，星期六，2024年，5月抗体酶的催化反应1．酰基转移反应第18页,共61页，星期六，2024年，5月2．重排反应第19页,共61页，星期六，2024年，5月3．氧化还原反应第20页,共61页，星期六，2024年，5月5．磷酸酯水解反应第21页,共61页，星期六，2024年，5月6．磷酸酯闭环反应第22页,共61页，星期六，2024年，5月7.光诱导反应a.光聚合反应（二聚作用）第23页,共61页，星期六，2024年，5月b.光裂解反应第24页,共61页，星期六，2024年，5月研究展望1．研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系的一般规律。2．获得一类新型的蛋白酶。3．催化天然酶不能催化的反应。第25页,共61页，星期六，2024年，5月第二节核酶（Ribozyme)一、核酶的概念二、核酶的种类三、核酶的应用四、核酶面临的问题五、影响核酶活性的因素第26页,共61页，星期六，2024年，5月ribozyme的发现80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的ThomasCech和美国耶鲁大学的SidneryAltman各自独立地发现RNA具有生物催化功能.从而改变了生物催比剂的传统概念。为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。第27页,共61页，星期六，2024年，5月

具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶

enzyme

极端酶extremozyme

抗体酶abzyme

生物工程酶其它：模拟酶核酸类:克隆酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme第28页,共61页，星期六，2024年，5月I型内含子剪接型核酶

II型内含子锤头核酶剪切型核酶发夹核酶自体催化丁型肝炎病毒（HDV)核酶

RNaseP异体催化

二、核酶的分类第29页,共61页，星期六，2024年，5月

自然界存在催化分子内反应（incis）的ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化分子间反应(intrans)的ribozyme。第30页,共61页，星期六，2024年，5月自我剪接ribozyme分类自我剪接ribozyme可分为两类：Ⅰ型IVS：均与四膜虫大核rRNA前体的IVS结构相似、催化自我剪接需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。Ⅱ型IVS：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的IVS相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+第31页,共61页，星期六，2024年，5月2．自我剪切ribozyme的分类自我剪切ribozyme,自我剪切的RNA结构有锤头结构和发夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。自我剪接ribozyme：包含剪切与连接两个步骤。第32页,共61页，星期六，2024年，5月几种能进行自我剪切的RNA结构第33页,共61页，星期六，2024年，5月催化分子间反应的ribozyme的分类如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多种分子间反应。第34页,共61页，星期六，2024年，5月第35页,共61页，星期六，2024年，5月1.剪接型核酶

剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（Intron)。第36页,共61页，星期六，2024年，5月1）I类内含子的自我剪接(Self-splicing)I型IVS是与四膜虫26srRNA前体的IVS结构相似的间隔序列，具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA及G-IVS，G-IVS经两次环化生成L-19IVS。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。剪接机制L-19IVS在体外的多种酶活性第37页,共61页，星期六，2024年，5月p3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HO

Ⅰ类内含子的剪接机制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外显子

内含子或居间序列（Interveningsequence,IVS)5‘第38页,共61页，星期六，2024年，5月

第39页,共61页，星期六，2024年，5月UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU

AAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜虫rRNA前体自我剪接反应第40页,共61页，星期六，2024年，5月第41页,共61页，星期六，2024年，5月1、转核苷酸作用

2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用

CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用

CpCpCpCpCpCpCpCpCpC+Pi5、限制性内切酶作用

CpUpCpUpN+GCpUpCpU+GpN第42页,共61页，星期六，2024年，5月2）Ⅱ类内含子的自我剪接Ⅱ型IVS是与细胞核mRNA前体的IVS结构相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应，生成成熟的RNA及套环状的IVS。催化的剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子(Mg2+)。剪接机制第43页,共61页，星期六，2024年，5月p2‘HO-Ap

p-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ类内含子的剪接机制Mg2+套环的形成5‘3‘外显子连接第44页,共61页，星期六，2024年，5月2.剪切型核酶

这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。

1）自体催化剪切型

剪切机制

第45页,共61页，星期六，2024年，5月转酯化过程：由靠近切割位点3‘端的2’OH或氧原子对切割位点的磷原子实施亲核攻击，产生5‘-OH和2’，3‘-环磷酸二酯。

剪切机制核酶自身剪切反应第46页,共61页，星期六，2024年，5月锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图三个双螺旋区。13个核苷酸残基保守序列。剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生。第47页,共61页，星期六，2024年，5月发夹（hairpin）结构1989年汉普（Hample）研究烟草环斑病毒（sTRSV）的负链RNA的自我剪切反应，提出发夹结构（hairpinstructure）模型。发夹核酶结构模型第48页,共61页，星期六，2024年，5月四个螺旋区、三个连接区和两个环。剪切反应发生在底物识别序列GUC的5‘端。5‘3‘

发夹二级结构模型剪切位点第49页,共61页，星期六，2024年，5月2)异体催化剪切型

核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH和5’-磷酸末端。

RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。第50页,共61页，星期六，2024年，5月三、核酶的应用1.基础理论：生命起源的探索2.医药：

1）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)、抗肿瘤。

2）免疫原性低，很少引起免疫反应。3.植物抗病毒第51页,共61页，星期六，2024年，5月

四、核酶面临的问题1、核酶催化效率低。2、核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶

RNase破坏。第52页,共61页，星期六，2024年，5月五、影响核酶活性的因素1、pH值对活性的影响：pH7.0-7.5时核酶活性最高。2、二价金属阳离子对活性的影响:Mg2+Mn2+

3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应4、变性剂对活性的影响:5、温度对活性的影响:

第53页,共61页，星期六，2024年，5月Ribozyme研究进展与展望对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得分子更小的、高效的ribozyme第54页,共61页，星期六，2024年，5月研究热点：从催化分子内反应的自我剪切ribozyme设计出催化分子间反应的ribozyme.