临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》第十三章 免疫组织化学技术讲义

第十三章免疫组织化学技术

第一节概述

第二节免疫荧光组织化学技术

第三节酶免疫组织化学技术

第四节亲和组织化学染色

第五节免疫标记电镜技术

第六节免疫组织化学技术的应用

第一节概述

免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞幽通过抗原抗体反

应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性和分子生物学技术的敏感性等巧妙地结合在一起，为疾病

的诊断、鉴别诊断和发病机制的研究提供了强有力的手段。

免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组

织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术。

免疫组织化学的基本过程包括：

①抗原的提取与纯化；

②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；

③将标志物与抗体结合形成标记抗体；

④标本的处理与制备；

⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；

⑥观察结果

一、标本的处理

（-）标本的主要来源

1.活体组织；

2.各种体液、穿刺液；

3.培养细胞。

（二）标本的固定与保存

1.标本固定的目的；

2.固定剂的选择；

3.制片方法的评价；

冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。

二、抗原的保存与修复

1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。

2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗

原性为目的。

3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋

白，暴露被掩盖的抗原决定簇。

4.高压锅法利用加热暴露抗原,经济简单，适用于大批切片的加热处理。

5.煮沸法也是利用热效应恢复抗原性。

实际操作中，不同的方法可能适用于不同类别抗原的修复，需通过预实验探索适用的抗原修复方法及

实验条件，如温度、酶浓度等。

三、抗体的处理与保存

（一）抗体的选择

选择抗体时应注意选择具有高度特异性和稳定的优质抗体，根据需要决定采用单克隆或多克隆抗体。

多克隆抗体广泛用于石蜡包埋的组织切片，假阴性几率低，但特异性不如单克隆抗体，有时会造成抗体的

交叉反应。单克隆抗体特异性强，但敏感性不够高。

（二）抗体的稀释

抗原抗体反应要求有正确的比例，过量或不足均不能达到预期结果。实际操作中需进行预实验，摸索

抗体的最佳稀释度，以便达到最小背景染色下的最强特异性染色。

（三）抗体的保存

抗体是一种具有生物活性的蛋白质，在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体蛋白

质变性，否则会降低抗体效价，甚至失效。

四、免疫组化的结果判断

（-）对照的设立

设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，主要针对第一抗体进行，常用的对照有阳性对照

和阴性对照。

（二）阳性结果

阳性细胞的显色分布有三种类型：①细胞质；②细胞核；③细胞膜表面。

（三）阴性结果及抗原不表达

阴性结果不能简单地认为具有否定意义，因为阳性表达有强弱、多少之分，哪怕只有少数细胞阳性（只

要是在抗原所在部位）也应视为阳性表达。

（四）特异性和非特异性显色的鉴别

1.特异性反应常分布于特定抗原部位，如细胞质、细胞核和细胞表面，具有结构性。非特异性反应

无一定的分布规律，常为切片边缘、刀痕或皱褶部位，坏死或挤压的细胞区域，常成片均匀着色。

2.非特异性反应由于细胞内抗原含量不同，特异性反应的显色强度不一。如果细胞之间显色强度相

同或者细胞和周围结缔组织无明显区别的着色，常提示为非特异性反应。

3.其他在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色，有时可见非特异性显色和特异性显

色同时存在，过强的非特异性显色背景可影响结果判断。

（五）免疫组化结果与HE切片结果

五、质量控制

试剂和操作步骤的质量控制是取得满意的免疫组化染色结果的必要条件。

第二节免疫荧光组织化学技术

免疫荧光组织化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本

中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，可以分辨出抗原（或抗

体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量，以达到对抗原（或抗体）物质定位、定性

和定量测定的目的。

一、组织处理

（-）标本的类型

1.涂片和印片血液、细菌培养物、脑脊液、体腔渗出液和细胞悬液等均可简单地涂抹在玻片上，干

燥固定后就可用于荧光抗体染色。脑脊液、脏器（肝、脾、淋巴结等）、细菌菌落或尸体病变组织可把新

鲜切面压印于玻片上做成印片，经固定后再染色。

2.组织切片这是组织学和细胞学最常用的显微镜标本片。主要有以下两种：①冷冻切片：为了使抗

原最大量地保存，首选的制片方法是冷冻切片，其优点是操作简单，组织的抗原性保存好，自发荧光较少，

特异荧光强，同时适用于不稳定的抗原，缺点是组织结构欠清晰；②石蜡切片：是研究形态学的主要制片

方法，它不但是观察组织结构的理想方法，而且可进行回顾性研究。其优点是组织细胞的精细结构显现清

楚，但对抗原的保存量不如冷冻切片，并有组织自发荧光和非特异性荧光，需加酶消化处理。

3.细胞培养标本比如用Hep-2细胞或HeLa细胞培养，待细胞在玻片上形成单层，固定后用作抗核抗

体等检测的抗原片。还可使细胞单层生长在玻片上，再用病毒或患者标本感染，然后固定，用荧光抗体染

色法检测病毒。

4.活细胞染色检查淋巴细胞表面抗原以及免疫球蛋白受体、癌细胞表面抗原、血清中抗癌细胞抗体

等，均可用活细胞荧光抗体染色法。当同时观察细胞表面两种抗原的分布和相互关系时，可用双标记法进

行染色。

（二）标本的保存

标本在固定干燥后，最好立即进行荧光抗体染色及镜检。如必须保存时，则应保持干燥，置以下保

存。一般细菌涂片或器官组织切片经固定后可保存1个月以上。但病毒和某些组织抗原标本抗原性丧失很

快，数天后就失去其抗原性，需在一20C以下保存。

第三节酶免疫组织化学技术

酶免疫组化技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反

应，催化底物产生显色反应，通过显微镜识别标本中抗原（抗体）的分布位置和性质，也可通过图像分析

技术达到定量的目的。

一、组织处理

（一）标本的类型

1.涂片和印片

2.组织切片

3.细胞培养标本

与荧光免疫技术相比，酶免疫组织化学技术具有染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观

察组织细胞的细微结构等优点，尤其是非标记抗体酶免疫组化法的敏感性更优于荧光免疫技术。

酶免疫组化技术可分为酶标记抗体免疫组化技术和非标记抗体酶免疫组化技术两种类型。

二、酶标记抗体免疫组化染色

借助交联剂共价键将酶直接连接在抗体上，酶标抗体与靶抗原反应后，通过酶对底物的特异性催化作

用，生成不溶性有色产物，沉淀在靶抗原位置，达到对抗原定性、定量、定位检测的目的.

（-）直接法

将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-醐复合物,

最后用酶底物显色。直接法的优点在于操作简便及特异性强，缺点是敏感性低，制备的抗体种类有限。

（二）间接法

将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物,

再用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用

底物显色剂显色。间接法的优点是检测敏感性高，制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体。

三、非标记抗体免疫酶组化染色

（一）酶桥法

抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连

接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色。

（二）PAP法

PAP法是在酶桥法基础上的改良。PAP法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物

（PAP复合物）•该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。通过桥

抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异

性第一抗体与第三抗体的动物种属相同。

（三）双桥PAP法

在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗

原分子上，以增强敏感性。这种放大方式重复使用桥抗体，使桥抗体与PAP复合物中抗酶抗体的未充分饱

和Fc段结合，或桥抗体与特异性第一抗体尚未饱和的Fc段结合。如此对抗原有明显放大作用，对于组织

细胞微量抗原的检测有实用价值。

（四）碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（APAAP法）

辣根过氧化物酶（HRP）是免疫组化的首选用酶，但有些组织细胞含内源性过氧化物酶限制了HRP的广

泛应用，尽管用甲醇过氧化氢进行处理可以抑制内源性过氧化物酶活性，但同时也会影响抗原的显示。APAAP

法就是用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶（AP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，即简称APAAP。

四、酶免疫组化染色中常用的酶及显色底物

醵免疫组化技术中最常用的酶是辣根过氧化物酶，常用的供氢体有二氨基联苯胺（DAB）,反应产物呈

棕色；氨基乙基卡巴理（AEC）,反应产物呈橘红色；4-氯-1-蔡酚，反应产物为灰蓝色。

碱性磷酸酶为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色。

其他标记酶还有葡萄糖氧化酶（GO）,B-半乳糖酶等，前者底物为葡萄糖，配以NBT和PMS,呈蓝色

沉淀。

第四节亲和组织化学染色

亲和组织化学是利用两种物质之间的高度亲和力而建立的方法。

一、生物素-亲和素法

（-）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术

按一定比例将亲和素与酶标生物素结合，形成可溶性亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）。当其

与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC中未饱和的亲和

素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。

ABC法的优点：敏感性高。生物素与亲和素的结合十分牢固，并且1个分子亲和素有4个生物素结合

位点，可以分别和生物素化的抗体和酶结合，1个过氧化物酶或免疫球蛋白分子又可结合多个生物素分子，

从而形成网络状复合物。此外，ABC法尚具有亲和力强、特异性高、第一抗体和第二抗体工作浓度低、操作

时间短、可以多重标记等特点。

（二）桥联亲和素-生物素技术（BRAB技术）

是以游离的亲和素作为桥联剂，利用亲和素的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物

与标记生物素（如酶标生物素）联结起来，达到检测反应分子的目的。

（三）标记亲和素-生物素技术（LAB技术）

LAB法是以标记亲和素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。该法具有相当高的灵敏度，

由于省略了加标记生物素步骤，操作较BRAB法简便。间接LAB法采用的是生物素化的第二抗体，可以进

一步提高检测灵敏度。

二、葡萄球菌A蛋白法

葡萄球菌A蛋白技术是根据SPA能与多种动物IgG的Fc段结合的原理，用SPA标志物（酶、荧光素、

放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的免疫检测实验。SPA常用HRP标记，可应用于间接法。SPA法的

染色程序基本同酶标抗体法，仅第二抗体改用SPA-HRPo

三、凝集素法

凝集素可采用直接法和间接法进行细胞化学染色。①直接法：将标志物直接结合在凝集素上，使其与

组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合；②间接法：先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗

凝集素抗体（即用凝集素免疫动物制备抗凝集素抗体）与结合在细胞上的凝集素反应。

四、链霉亲和素-生物素法

链霉亲和素（SA）是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含糖基，有4个生物素结合位点，并且具

有高度的亲和力，其功能类似亲和素。利用生物素结合的第二抗体与酶标记的链霉亲和素蛋白就构成了酶

标链霉亲和素-生物素方法（LSAB）o

1.敏感性高

2.低背景着色

3.第一抗体工作浓度低

4.操作简便

第五节免疫标记电镜技术

一、免疫标记电镜技术的原理

免疫电子显微镜（IEM）技术是利用高电子密度的颗粒性标志物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或

用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密度产物者如辣根过氧化物酶标记抗体，在电子显微镜下对抗

原抗体反应中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。

IEM较之免疫组织化学在光镜下的定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、

组织发生等方面有其独特的优点。

二、免疫标记电镜技术标本制备的要求

在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。

1.包埋前染色优点是切片染色前不经过锹酸固定、脱水及树脂包埋等过程，抗原未被破坏，易于获得

良好的免疫反应；可在免疫反应阳性部位定位做超薄切片，提高电镜下的检出率。特别适用于含抗原量较

少的组织。

2.包埋后染色优点是超微结构保存较好，方法简便，阳性结构有高度的可重复性，还能在同一张切片

上进行多重免疫染色。但抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱，甚至丧失或者抗原性质发生改变。

3.超薄切片免疫染色是将组织置于2.3mol/L蔗糖液中，以液氮速冻，在冷冻超薄切片机上切片，切

片厚度可略厚于常规树脂切片。冷冻超薄切片由于不需经固定、脱水、包埋等步骤，直接进行免疫染色，

所以抗原性保存较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点.

三、常用的免疫标记电镜技术

（一）免疫胶体金染色法

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型的免疫标记技术。

不同的胶体金水溶胶因粒子大小不同，颜色亦不同。颗粒在5〜20nm之间，吸收波长为520nm时，呈

葡萄酒红色；颗粒在20〜40nm之间，吸收波长为530nm时，呈深红色：颗粒为60nm,吸收波长为600nm时，

呈蓝紫色；若离心去掉较大的金颗粒后，溶胶呈红色。

胶体金在电镜的应用中，既可用于透射电镜（TEM）,又可用于扫描电镜（SEM）,其最大的优点就是

可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。

1.在TEM中，根据染色步骤，可将胶体金标记方法分为直接法和间接法；根据标记与包埋前后的关系,

可分为包埋前标记法和包埋后标记法。

2.在SEM中，由于胶体金颗粒有很强的发射二次电子的能力，用作标志物尤为合适。到目前为止，胶

体金SEM标记技术，主要应用于细胞表面成分的标记，它是研究细胞表面成分的理想方法。

在电镜水平，胶体金技术还可与其他技术结合，更充分地展示了它广泛的应用范围。如胶体金技术与

冷冻蚀刻技术结合，可对细胞膜不同膜蛋白颗粒或细胞膜表面的其他成分进行精细定位；与荧光技术结合,

可将荧光素和胶体金同时结合于某种生物大分子，制成探针，同时进行荧光显微镜和电镜定位，使定位方

便、准确，提高了工作效率：与分子杂交技术相结合，产生了电镜原位杂交技术，在超微结构水平上精确

定位基因位点，为深入研究生物体功能提供了有利的工具。

（-）免疫胶体铁细胞