细胞凋亡的检测方法样本

细胞凋亡的检测方法

细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将两者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。

1、细胞凋亡的形态学检测：根据凋亡细胞固有的形态学特性，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。a、光学显微镜和倒置显微镜观测：未染色凋亡细胞体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落；染色凋亡细胞常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边沿化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。b、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜：一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况，常用的DNA特异性染料有：有HO33342（Hoechst33342）,HO33258(Hoechst33258),DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，重要结合在DNA的A-T碱基区。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度一般为2-5ug/ml。DAPI为半通透性，用常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水溶解为浓度1mg/ml，使用终浓度一般为0.5-1ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased）,部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边沿化；Ⅱb期细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。c、透射电子显微镜观测。结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。2、磷脂酰丝氨酸外翻分析：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidyllserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在凋亡初期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，运用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（propidineiodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI可以透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的及死细胞区分开来。方法：a、悬浮细胞的染色：Ⅰ、将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5×106）用PBS洗2次，加入200μlBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10μl及PI(50ug/ml)5μl,室温避光30min,加入400μlPBS，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1小时），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。Ⅱ、贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。Ⅲ、爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光显微镜进行观测。结果及注意事项：整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；操作时注意避光，反映完毕后尽快在一个小时内检测；3、线粒体膜势能（△ψmt）的检测：多种细胞凋亡诱导不同的细胞凋亡时，皆发生线粒体跨膜电位△ψmt的下降，并且发现△ψmt下降是细胞凋亡级联反映过程中最早发生的事件，在细胞核出现凋亡特性（染色质浓缩、DNA断裂）之前，还发现一量线粒体△ψmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123、3,3-Dihexyloxacarbocyanineodide[DiOC6(3)]echloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide[JC-1]、Tetramethylrhodaminemethylester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或减少。方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine123(1μM)终浓度为DiOC6(25μM),JC-1(1μM),TMRM(100μM),37℃4、DNA片断化检测：细胞凋亡时重要生物化学特性是其染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成50-300kbp长的DNA大片断或180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNAladder）。细胞经解决后，采用常规方法分离提纯DNA后，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中则可观测到典型的DNAladder。假如细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观测凋亡细胞中DNAladder的形成。a、大分子染色体DNA片段的测定：细胞凋亡的初期，染色体断裂成为50-300kbp长的DNA大片段，所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达成分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量大小来筛分DNA，DNA像通过弯管同样，以其一凋指向电声一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为“爬行”。因此，细胞凋亡初期产生的50-300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常彩脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才干继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。b、DNAladder测定：方法:收获细胞(1×107)沉淀→细胞裂解液→13000rpm,5min,收集上清→1%SDS和RnaseA(5mg/ml)56℃,2h→蛋白酶K(2.5mg/ml)37℃,2h→1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA,4C过夜→14000rpm,15min→最后将沉淀溶解在TEbuffer中,加DNAloadingBuffer→1.2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色并照相。C、凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析：方法：收集细胞→70%冷乙醇（inPBS）4℃固定过夜→PBS洗涤，1000rpm,10min→RnaseA(0.5ug/ml)37℃消化30min5、TUNEL法：细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成和衍生物标记到DNA的3’-末端，从而进行凋亡细胞的检测。这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminaldeoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少可以被染色。TUNEL法事实上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特性，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的形态测定，并可检测出很少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。6、Caspase-3活性的检测：Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的初期阶段，它被激活，活化形式的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物。在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，Caspase-3的活性明显下降。a、Westernblot分析测定：Caspase-3的大小亚基及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]等的裂解。b、荧光分光光度计分析：方法：收获细胞正常或凋亡细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→加Ac-DEVD-AMC(Caspase-3四肽荧光底物)→37℃反映1h→荧光分光光度计（polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。c、流式细胞术分析：方法：收获正常培养或凋亡细胞→PBS洗涤→加Ac-DEVD-AMC→37℃反映1h检测细胞凋亡的实验方法比较

◆TUNEL与ELISA检测凋亡的方法比较

TUNEL法

细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少可以被染色。TUNEL事实上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特性，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出很少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.

ELISA法测细胞凋亡

细胞凋亡时，Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断，产生单或寡合苷酸小体，各核小体的DNA与核组蛋白H2A,H2B,H3,H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。重要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。

◆几种检测凋亡的方法

一、形态学观测方法

1、HE染色、光镜观测：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。

2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观测：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

3、台盼蓝染色：假如细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。假如细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

4、透射电镜观测：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

二、DNA凝胶电泳

（一）、检测原理

细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增长，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特性的杂乱片断，运用此特性可以拟定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

（二）结果判断

正常活细胞DNA电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。

三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定

凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其随着的DNA片断组成，可由ELISA法检测。

（一）检测环节

1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中具有核小体；

2、在微定量板上吸附组蛋白体’

3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘

4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’

4、加酶的底物，测光吸取制。

（二）用途

该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。

四、流式细胞仪定量分析

（一）检测原理

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增长，但是其限度介于正常细胞与坏死细胞之间。运用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，运用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。

（二）应用价值

流式细胞仪检测具有以下特点：

1)、检测的细胞数量螅虼似浞从橙禾逑赴牡蛲鲎刺冉献既?BR>2)、可以做许多相关性分析

3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可拟定凋亡的细胞所处的细胞周期

■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增长，但其限度介于正常细胞和坏死细胞之间，运用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，运用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

运用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞重要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞重要摄取碘化丙啶（PI)而呈强的红色荧光。

■DNA片断原位标记法

凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反映与凋亡细胞裂解后3•的羟基（－OH）端结合，经显色反映后检测DNA裂解点的技术。

DNA片段原位标记法有二种：

1、原位缺口转移（insitunick-translation,ISNT)技术，它是运用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3•－OH端

2、原位缺口末端标记技术（insituendlabellingtechnique,ISEL)，即TUNEL法，它是运用TdT将标记的DUPT接到3•-OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，特别对初期凋亡的检测，TUNEL更为合适。

■检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法

1、原理：在细胞凋亡初期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故运用对PS有高度亲和力的AnnexinV，将AnnexinV标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

2、结果判断：正常活细胞AnnexinV、PI均低染；凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染；坏死细胞AnnexinV/PI均高染。

3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此AnnexinV联合PI染色法检测初期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定导致的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，AnnexinV联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为抱负的检测细胞凋亡的方法。

◆几点参考

1.大部分凋亡细胞也许并不见得有非常典型的凋亡表型，如电镜的染色体边集、凋亡小体等，DNA电泳也不见得都有DNAladder，但对某些指标来说还算稳定，如PI染色及TUNEL法，所以假如某个方法效果不好，可以换用其他方法检测

2.坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程，楼上所说的线粒体肿大也是以前的一个传统结识，但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的，因此也有了程序化坏死一说，在很大限度上，由于凋亡是时间依赖性的过程，细胞发生凋亡也并非同步化的，凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的，并且我认为假如不是对于凋亡或是坏死自身通路进行研究的话，强行区分是没故意义的

◆细胞凋亡检测技术与方法

细胞凋亡（Apoptosis），又称细胞程序性死亡(PCD:ProgrammedCellDeath)，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个积极的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间，但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制和组分的广泛而进一步地研究，成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。从近年的SCI排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的连续升温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已有商品化的产品出现，大大加速了研究的进程。具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法（概括如图1）：

1．初期检测:

1)PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测:

PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生,也许作为免疫系统的辨认标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简朴的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡初期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都合用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。

美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的AnnexinV产品，简便快速，10分钟就可完毕检测。其中带荧光标记的AnnexinV-EGFP(EnhancedGreenFluorescentProtein)及AnnexinV-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白AnnexinV-EGFP，EGFP与PS的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的AnnexinV，可通过常用的酶联显色反映来检测。此外，MACS公司将磁珠包被AnnexinV，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

2）细胞内氧化还原状态改变的检测：

这反映了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTMGlutathioneDetectionKit通过荧光染料monochlorobimane(MC体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡初期细胞内氧化还原状态的变化。

正常状态下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反映在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这也许导致了凋亡初期细胞线粒体膜电位的减少，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反映。

由于GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。

3）细胞色素C的定位检测

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1）后启动caspase级联反映：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochromecoxidasesubunitⅣ：COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保存在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。

ApoAlertTMCellFractionationKit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。

4)线粒体膜电位变化的检测：

在凋亡研究的初期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的进一步，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlertMitochondrialMembraneSensorKit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他因素导致的线粒体膜电位的变化。

2．晚期检测：

细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200bp的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：

1）TUNEL（Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnick-end-labeling）

通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP（多为dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡解决的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记环节少，操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。

2)LM-PCRLadder(连接介导的PCR检测)

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳也许观测不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert®LM-PCRLadderAssayKit通过LM-PCR（ligation-mediatedPCR）,连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR检测是半定量的，因此相同凋亡限度的不同样品可进行比较。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特性，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它因素的干扰。

3)TelemeraseDetection(端粒酶检测)

这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区反复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这也许作为有丝分裂的一种时钟，表白细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-ezeTelemeraseDetectionKit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒反复序列配对的引物。假如待测样本中具有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒反复序列，通

过PCR反映，产物电泳检测就可观测到相差六个碱基的DNALadder现象（参见图4）。此外，Intergen公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒.

同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反映细胞凋亡的发生。

3．mRNA水平的检测

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxicTcells）等靶细胞。Bcl-2和bcl-X(长的)作为抗凋亡（bcl-2和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。一般多采用Northern杂交和RT-PCR走胶对它们进行检测。随着近年来荧光定量PCR技术的发展，用定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。Intergen公司的Amplifluor™ApoptosisGeneSystems就根据这一新技术原理，通过检测fas,bax-alpha和bcl-X(长的)基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

以上介绍了针对凋亡不同阶段特性的检测方法，随着凋亡机制研究的进一步，近年来还发展了许多针对特定的凋亡途径的检测，如抗体法，酶活性测定等等，CellSignelingtechnology公司，DAKO公司，Santa-Cruz公司，Calbiochem&Oncogene公司都紧跟科研潮流，开发了大量的抗体及活性测定产品。

随着对细胞凋亡的研究和结识的不断进一步，对涉及肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本的细胞凋亡的检测已成为一种迫切需要。目前，多种方法已得到较广泛的应用。然而如何选择适当的方法并对检测的结果作出对的的判断及愉如其分的解释仍是值得探讨的问题。本文简要评述几种常用的细胞凋亡检测方法。

◆

一、细胞凋亡的形态学观测

细胞凋亡（apoptosis）的命名重要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特性。目前对细胞凋亡的结识正不断得到深化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是拟定细胞凋亡的最可靠的方法。

光学显微镜观测

凋亡细胞的重要特性为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周边细胞分离，不引起炎症反映。本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺少较为特性的指标，具有较强的主观性，反复性差。本方法可用于调亡现象的初步观测，作为分析指标之一。

检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观测凋亡细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。

视频时差显微技术（videotime-lapsemicroscopy）

本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观测细胞凋亡的变化过程，特别是观测细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观测，本方法可养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织。

检测方法：收集2×105细胞/ml培胞，置于多孔培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像装置的相差显微镜下观测凋亡细胞的动态改变，每隔分钟30秒作序列摄影，连续24小时。如同进进行荧光染色，可参荧光晃微镜下观测和摄影。

电子显微镜观测

关于凋亡细胞的超微结构特性，涉及透射电镜和扫描电镜下的改变，在许我文献中已有详尽描述。凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳的体现。为凋亡细胞鉴定提供了最可靠的依据。本方法的缺陷是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展。由于样品范围局限，在凋亡细胞数较少时需进行大量的观测才干观测到典型的凋亡改变。还应指出的是，在观测体外培养的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡小体很少见到，出现较多的是凋亡初期胞体收缩、染色质边聚和后期凋亡小体（或整个凋亡细胞）被吞噬和降解的现象。一些不典型的改变容易被忽略，在观测时要特别予以注意。

检测方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观测。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观测。

流式细胞技术

流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特性及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。散射光涉及前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性（granu-larity）有关。细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生改变。初期凋亡细胞重要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎裂。晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱。由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才干准确地辨认凋亡细胞。

细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptoticpeak）,代表凋亡细胞。根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。

检测方法：获取密度1×106细胞/ml左右的细胞悬液，精洗，固定，荧光染料染色，上流式细胞仪分析。◆TUNEL与ELISA检测凋亡的方法比较

TUNEL法

细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少可以被染色。TUNEL事实上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特性，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出很少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.

ELISA法测细胞凋亡

细胞凋亡时，Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断，产生单或寡合苷酸小体，各核小体的DNA与核组蛋白H2A,H2B,H3,H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。重要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。

◆几种检测凋亡的方法

一、形态学观测方法

1、HE染色、光镜观测：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。

2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观测：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

3、台盼蓝染色：假如细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。假如细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

4、透射电镜观测：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

二、DNA凝胶电泳

（一）、检测原理

细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增长，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特性的杂乱片断，运用此特性可以拟定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

（二）结果判断

正常活细胞DNA电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。

三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定

凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其随着的DNA片断组成，可由ELISA法检测。

（一）检测环节

1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中具有核小体；

2、在微定量板上吸附组蛋白体’

3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘

4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’

4、加酶的底物，测光吸取制。

（二）用途

该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。

四、流式细胞仪定量分析

（一）检测原理

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增长，但是其限度介于正常细胞与坏死细胞之间。运用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，运用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。

（二）应用价值

流式细胞仪检测具有以下特点：

1)、检测的细胞数量螅虼似浞从橙禾逑赴牡蛲鲎刺冉献既?BR>2)、可以做许多相关性分析

3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可拟定凋亡的细胞所处的细胞周期

■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增长，但其限度介于正常细胞和坏死细胞之间，运用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，运用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

运用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞重要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞重要摄取碘化丙啶（PI)而呈强的红色荧光。

■DNA片断原位标记法

凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反映与凋亡细胞裂解后3•的羟基（－OH）端结合，经显色反映后检测DNA裂解点的技术。

DNA片段原位标记法有二种：

1、原位缺口转移（insitunick-translation,ISNT)技术，它是运用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3•－OH端

2、原位缺口末端标记技术（insituendlabellingtechnique,ISEL)，即TUNEL法，它是运用TdT将标记的DUPT接到3•-OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，特别对初期凋亡的检测，TUNEL更为合适。

■检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法

1、原理：在细胞凋亡初期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故运用对PS有高度亲和力的AnnexinV，将AnnexinV标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

2、结果判断：正常活细胞AnnexinV、PI均低染；凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染；坏死细胞AnnexinV/PI均高染。

3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此AnnexinV联合PI染色法检测初期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定导致的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，AnnexinV联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为抱负的检测细胞凋亡的方法。

◆几点参考

1.大部分凋亡细胞也许并不见得有非常典型的凋亡表型，如电镜的染色体边集、凋亡小体等，DNA电泳也不见得都有DNAladder，但对某些指标来说还算稳定，如PI染色及TUNEL法，所以假如某个方法效果不好，可以换用其他方法检测

2.坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程，楼上所说的线粒体肿大也是以前的一个传统结识，但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的，因此也有了程序化坏死一说，在很大限度上，由于凋亡是时间依赖性的过程，细胞发生凋亡也并非同步化的，凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的，并且我认为假如不是对于凋亡或是坏死自身通路进行研究的话，强行区分是没故意义的

◆细胞凋亡检测技术与方法

细胞凋亡（Apoptosis），又称细胞程序性死亡(PCD:ProgrammedCellDeath)，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个积极的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间，但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制和组分的广泛而进一步地研究，成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。从近年的SCI排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的连续升温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已有商品化的产品出现，大大加速了研究的进程。具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法（概括如图1）：

1．初期检测:

1)PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测:

PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生,也许作为免疫系统的辨认标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简朴的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡初期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都合用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。

美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的AnnexinV产品，简便快速，10分钟就可完毕检测。其中带荧光标记的AnnexinV-EGFP(EnhancedGreenFluorescentProtein)及AnnexinV-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白AnnexinV-EGFP，EGFP与PS的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的AnnexinV，可通过常用的酶联显色反映来检测。此外，MACS公司将磁珠包被AnnexinV，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

2）细胞内氧化还原状态改变的检测：

这反映了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTMGlutathioneDetectionKit通过荧光染料monochlorobimane(MC体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡初期细胞内氧化还原状态的变化。

正常状态下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反映在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这也许导致了凋亡初期细胞线粒体膜电位的减少，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反映。

由于GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。

3）细胞色素C的定位检测

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1）后启动caspase级联反映：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochromecoxidasesubunitⅣ：COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保存在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。

ApoAlertTMCellFractionationKit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。

4)线粒体膜电位变化的检测：

在凋亡研究的初期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的进一步，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlertMitochondrialMembraneSensorKit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他因素导致的线粒体膜电位的变化。

2．晚期检测：

细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200bp的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：

1）TUNEL（Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnick-end-labeling）

通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP（多为dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡解决的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记环节少，操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。

2)LM-PCRLadder(连接介导的PCR检测)

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳也许观测不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert®LM-PCRLadderAssayKit通过LM-PCR（ligation-mediatedPCR）,连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR检测是半定量的，因此相同凋亡限度的不同样品可进行比较。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特性，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它因素的干扰。

3)TelemeraseDetection(端粒酶检测)

这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区反复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这也许作为有丝分裂的一种时钟，表白细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-ezeTelemeraseDetectionKit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒反复序列配对的引物。假如待测样本中具有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒反复序列，通

过PCR反映，产物电泳检测就可观测到相差六个碱基的DNALadder现象（参见图4）。此外，Intergen公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒.

同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反映细胞凋亡的发生。

3．mRNA水平的检测

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxicTcells）等靶细胞。Bcl-2和bcl-X(长的)作为抗凋亡（bcl-2和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。一般多采用Northern杂交和RT-PCR走胶对它们进行检测。随着近年来荧光定量PCR技术的发展，用定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。Intergen公司的Amplifluor™ApoptosisGeneSystems就根据这一新技术原理，通过检测fas,bax-alpha和bcl-X(长的)基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

以上介绍了针对凋亡不同阶段特性的检测方法，随着凋亡机制研究的进一步，近年来还发展了许多针对特定的凋亡途径的检测，如抗体法，酶活性测定等等，CellSignelingtechnology公司，DAKO公司，Santa-Cruz公司，Calbiochem&Oncogene公司都紧跟科研潮流，开发了大量的抗体及活性测定产品。

随着对细胞凋亡的研究和结识的不断进一步，对涉及肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本的细胞凋亡的检测已成为一种迫切需要。目前，多种方法已得到较广泛的应用。然而如何选择适当的方法并对检测的结果作出对的的判断及愉如其分的解释仍是值得探讨的问题。本文简要评述几种常用的细胞凋亡检测方法。

◆

一、细胞凋亡的形态学观测

细胞凋亡（apoptosis）的命名重要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特性。目前对细胞凋亡的结识正不断得到深化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是拟定细胞凋亡的最可靠的方法。

光学显微镜观测

凋亡细胞的重要特性为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周边细胞分离，不引起炎症反映。本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺少较为特性的指标，具有较强的主观性，反复性差。本方法可用于调亡现象的初步观测，作为分析指标之一。

检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观测凋亡细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。

视频时差显微技术（videotime-lapsemicroscopy）

本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观测细胞凋亡的变化过程，特别是观测细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观测，本方法可养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织。

检测方法：收集2×105细胞/ml培胞，置于多孔培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像装置的相差显微镜下观测凋亡细胞的动态改变，每隔分钟30秒作序列摄影，连续24小时。如同进进行荧光染色，可参荧光晃微镜下观测和摄影。

电子显微镜观测

关于凋亡细胞的超微结构特性，涉及透射电镜和扫描电镜下的改变，在许我文献中已有详尽描述。凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳的体现。为凋亡细胞鉴定提供了最可靠的依据。本方法的缺陷是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展。由于样品范围局限，在凋亡细胞数较少时需进行大量的观测才干观测到典型的凋亡改变。还应指出的是，在观测体外培养的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡小体很少见到，出现较多的是凋亡初期胞体收缩、染色质边聚和后期凋亡小体（或整个凋亡细胞）被吞噬和降解的现象。一些不典型的改变容易被忽略，在观测时要特别予以注意。

检测方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观测。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观测。

流式细胞技术

流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特性及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。散射光涉及前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性（granu-larity）有关。细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生改变。初期凋亡细胞重要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎裂。晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱。由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才干准确地辨认凋亡细胞。

细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptoticpeak）,代表凋亡细胞。根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。

检测方法：获取密度1×106细胞/ml左右的细胞悬液，精洗，固定，荧光染料染色，上流式细胞仪分析。

二、细胞凋亡的细胞化学测定

细胞凋亡的细胞化学测定涉及细胞表面（细胞膜）的结构和通透性改变的测定和细胞核DNA改变的测定。根据应用的范围，又可分为细胞群休和单个细胞测定两种，以下仅介绍其中几种较为常用的方法。

碘化丙啶（propidiumiodide,PI）检测

初期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI)不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

检测方法：获取11×106细胞/ml的细胞悬液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观测。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外线激发，前者荧光为红色（620nm）,后者荧光为蓝色（480nm）。正常细胞蓝色最强。初期凋亡细胞由于DNA的漏出蓝色稍弱并有少量的红色荧光，晚期凋亡细胞红色荧光加强。坏死细胞红色荧光最强。

膜联蛋白（annexin）V标记

正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。PS表面化发生于凋初期，其机制尚不清，也许是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。膜联蛋白V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表现PS结合，再用显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观测凋亡过程中细胞膜PS的表面化。结合PI染色进行双参数检测尚能区分正常细胞、初期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。正常细胞膜联蛋白V（-）PI（-），初期凋亡细胞膜联蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞膜联蛋白V（+）PI（+）。有研究表白膜联蛋白V标记仅有不到三分之一的凋亡细胞出现阳性标记，其因素尚不明。同时需注意度的是凋亡后期溶解阶段，细胞碎片也可出现明显的阳性着色。

检测方法：1×106细胞/ml细胞悬液，先后用膜联蛋白V--FITC及PI染色，流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图（cytogram），每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数在所点的组份。左下象限代表正常细胞（An-PI-）,右下象限代表初期凋亡细胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+）,左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（An-PI+）。用生物素标记膜联蛋白V还可以作体内实验。将生物素标记膜联蛋白V注射小鼠体内，30分钟后处死，迅速取出要研究的组织置于甲醛内固定，然后，常规石蜡切片，脱蜡、水化，用亲和素标记的过氧化物酶程程序孵育，DAB显色，光镜下观测凋亡细胞。

DNA琼脂凝胶电泳法

细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，DNA在核小体间被切割成180-200bp整数倍的单或寡核苷酸片段，在电泳时表现为特性性的“梯形带”。自Wyllie把内源性核酸内切酶降解产生“梯形带”与细胞凋亡相联系以来，“梯形带”被作为细胞凋亡的一个重要的生化指标。尽管有报道指出，实验中出现典型的形态改变时可不伴有核小体间的DNA降解，对这一指标提出质疑，本方法仍被广泛应用。但此方法敏感性不高，大量凋亡细胞同时存在时才出现典型的结果，且只能被用于细胞群体，不能用于组织的原位检测。

检测方法：培养细胞清洗、离心，加入细胞裂解液裂解，高速离心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已锭的1％-2％的琼脂糖凝胶的样品的孔中进行电泳，最后在紫外线灯下观测和摄影。

DNA裂解的原位检测

在细胞水平检测DNA裂解的原位标记技术已越来越多地被用于组织切片和培养细胞，细胞凋亡时，由于DNA的裂解，形成单或寡核小体的双链相对分子质量小的片段及在相对分子质量大的DNA上形成单的继裂（缺口，nick）。此类断裂可用生物素、地高辛或荧光素标记的核苷酸在3`-OH端予以显示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脱氧核苷酸转移酶（TdT），前者使核苷酸结合于缺口，需要模板存在，标记方法通常被称为“原位缺口平移”(insitunicktranslation,ISNT),后者使核苷酸在双链的断端延伸，不需要模板的存在，其方法被称为未端记（endlabeling）、加尾法（tailingreaction）或TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）。上述方法，特别是TUNEL的应用已很广泛，其优点是可用于原位标记，可用于病理组织，并可进行定量分析。值得注意的是坏死期由于内源性核酸内切酶和蛋白质酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出现阳性反映。组织或细胞外理不妥时可出现假阳性。因而，TUNEL等方法对凋亡细胞的标记是选择性的。而不是特异性的，TUNEL或其他DNA裂解原位标记的分析应结合阳性细胞的形态，特别是核的特性，细胞的分布和有无炎症反映，除外非凋亡的阳性反映。

检测方法：石蜡切片常规脱蜡、水化，蛋白质酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，显色（辣根过氧化物酶标记可用DAB显色，碱性磷酸酶标可用NBT+BCIP显色），复染，脱水，封片。凋亡细胞核呈现蓝色（NBT+BCIP显色）或者棕黄色（DAB显色）。

凋亡蛋白质酶（Caspase）-3及其底物的检测

凋亡蛋白质酶是一类半胱氨酸蛋白质酶，具有特异性水解底物分子天冬氨酸（Asp）残七C端肽键功能，是近年随着调亡研究的进一步而发现的重要凋亡分子。迄今已有13个分子得到命名，分别为凋亡蛋白质酶1-13。基中凋亡蛋白质-3是被认为在多种组织、细胞类型中最常涉及的凋亡效应分子。活化的凋亡蛋白质酶-3仅在凋亡细胞中发现，因此，检测凋亡蛋白质酶-3的活性有助于发现初期的凋亡细胞。一般采用人工合成四肽荧光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白质酶-3在D与AMC之间水解，释放荧光物质、AMC，后者在紫外线激发下发出波长为430-460nm的荧光，通过流式细胞仪或分光光度计对其强度进行定量，从而测定凋亡蛋白质酶-3的活性。由于醛对凋亡蛋白质酶-3的水解活性克制作用，因此同时加入含醛四肽如DEVD-CHO可以克制凋亡蛋白质酶-3对DEVD-AMC的水解，不产生荧光。这样的克制实验可作为对照，使凋亡蛋白质酶-3的活性分析更有特异性。但是，上述方法不合用于组只切片，因此有人尝试采用针对活化的凋亡蛋白质酶-3亚基的抗体，通过免疫组化显示凋亡细胞，然而其敏感性及特异性尚不能令人满意。

检测方法：培养细胞（也可以预先作凋亡诱导并在不同时段收集细胞）在裂解液内裂解、离心、去上清液。加入凋亡蛋白质酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同时用不加底物的样品作对照，流式细胞仪检测，加有底物的样品释放出的荧光强度样对照样品明显增强。如加入DEVD-AMC时再加入DEVD-CHO，样品释放的荧光强度与对照样品无差异。

凋亡蛋白质酶-3导致细胞凋亡是通过水解或灭活一些细胞关键蛋白质实现的，因此检测凋亡蛋白质酶-3底物的改变也有助于辨认细胞的凋亡。PARP是第一个被结识的凋亡蛋白质酶-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000及相对分子质量为25000的两个片段，用运载相对分子质量为85000片段的抗体可以观测细胞是否发生凋亡。细胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白质酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸残基形成一个新的抗原表位，用抗此表位的抗体可以在组织切片上辨认凋亡细胞。此外一种细胞骨架蛋白质肌动蛋白（actin）被水解后产生一种称为“fractin”的片段，在凋亡初期出现，并认为与细胞膜的起泡有关，也许有助于初期凋亡细胞的辨认。总之，随着对凋亡蛋白质酶及其底物的进一步研究，将会发现更有价值的有助于检测凋亡细胞的方法。

三、展望

除了以上介绍的几种较常用检测细胞凋亡的方尖，尚有一些尚未被列入的检测方法，新的方法正将出现。尽管用于检测细胞凋亡的方法较多，但形态学观测，特别是透射电镜观测仍具有不可替代的作用，只是其应用受到一定限制。在细胞化学检测方法中，迄今没有任何一种方法具有足够的敏感性和特异性，特别在病理组织中要作出准拟定量分析仍较为因难。在目前情况下标本和病变的特点，选择多种适当的方法进行综合检测，常可行到较准确结果，同样重要的是，要充足理解各种方法的原理及应范围，并对结果作出合理的分析和判断。随着对细胞凋亡结识的深化和有关技术的进展，期待更敏感、更特异的方法面世，这对于病理状态（涉及肿瘤）中细胞凋亡的研究将具有重要意义。

◆有关细胞爬片

1.解决细胞爬片：用灭菌的去离子水将多聚赖氨酸配成0.1mg/ml,解决载玻片过夜即可。用前再用去离子水漂洗一次，就可直接接种细胞！

2.热疗对细胞内热休克蛋白70的诱导

陈必良1，安晓汾2，辛晓燕1，王德堂1，郭慧玲1（1第四军医大学西京医院妇产科，

陕西西安710032；2第四军医大学吉林军医学院附属医院妇产科，吉林省吉林市，132023）

【摘要】目的探讨肿瘤细胞（以人卵巢癌细胞为例）在受热不同时间、不同间隔后细胞内热休克蛋白70表达的异同；明确人卵巢癌细胞对热耐受的敏感限度。方法体外培养人卵巢癌细胞HO-8910，制成细胞爬片。加热温度设为42℃，实验提成两部分：①加热时间分别设为15、30、60、90、120、150min，加热后立即固定细胞；②将细胞加热120min后，置于37℃细胞培养箱中复温不同时间，收集复温后1h、4h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h后的细胞爬片固定。然后将两组细胞爬片行HSP70的免疫组化染色，观测热疗前后HSP70的不同表达。结果未加热细胞仅有少量HSP70的表达，随加热时间延长，HSP70的表达逐渐增多；加热后不同间隔HSP70的表达不同，间隔6hHSP70的表达最强，随后逐渐减少，5-6天后，恢复至未加热状态。结论①温和加热时间过长可诱导HSP70的大量产生，从而使肿瘤细胞对热疗产生热耐受作用;②卵巢癌HO-8910细胞对加热有较强的耐受性。

关键词：热休克蛋白70；免疫组织化学；热耐受；卵巢癌；

随着科学技术和医学科学的发展，对癌症的诊断和治疗有了长足的进步。高温治疗也称热疗（hyperthermia，HT，又叫温热疗法）,以其无手术痛苦、无术后并发症及无化疗及放疗带来的副反映而发展成为癌症治疗的有一种有效方法[1]。高温可导致肿瘤细胞死亡或者生长克制，同时高温还可提高肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性，由于肿瘤细胞对于高温的敏感性明显高于正常细胞。但在应用过程中也发现，随热疗反复次数的增长，热疗效果反而下降，会出现所谓“热耐受（thermotolerance）”现象，即第1次加温可影响第2次加温的生物学效应。这说明在热疗过程中，肿瘤细胞内生成了某些物质可减少其对热的敏感性。研究表白[2]，该现象与热休克蛋白家族特别与热休克蛋白70（HSP70）的关系密切。本研究运用人卵巢癌细胞HO-8910受热后进行HSP70免疫组化染色，以了解在该细胞中HSP70的表达与加热之间的关系。

1材料和方法

1.1材料人卵巢癌细胞系HO-8910为分化差的卵巢浆液性囊腺癌细胞，由第四军医大学西京医院实验室提供。HSP70成套免疫组化试剂盒（产品编号SA2077）及DAB显色试剂盒（产品编号ED1022）均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1加热解决将细胞接种于含热灭活的15%小牛血清及双抗的RPMI1640(GibcoBRL,USA)培养液中，常规培养。取对数生长期的细胞，经0.25%胰酶消化后制成细胞悬液，细胞密度为1×105/ml。将1cm×1cm大小的盖玻片置于24孔板中，每孔加入1ml的细胞悬液，制成细胞爬片。12h后，将24孔板置于42℃培养箱中分别进行两种实验解决：①加热时间分别设6个时间点，即15、30、60、90、120和150min，加热后的细胞即刻用0.01MPBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定细胞40min，制成细胞爬片后置于4℃冰箱中保存备用；②将细胞加热120min后，置于37℃细胞培养箱中复温不同时间，收集复温后1、4、6、12、24、48、72、96、120及144h后的细胞爬片按照上述环节解决细胞固定后备用。

1.2.2H