生物技术制药复习总结材料

生物技术制药复习材料

（加粗内容重点掌握）

一、课程要求

1.通过本课程的学习达到了解和掌握现代生物技术制药的基本知识概念,掌握常规生物制

药的基本技术路线和工艺过程的目的。

2.了解生物药用资源的知识背景，把生物资源的科学利用与药物研制紧密结合，培养学生

的发明创造能力。

二、知识归纳

第一章：概述

1.生物技术概念：以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科

学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种

目的的技术。

2.生物技术内容包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程这四大工程，随着科技的不

断发展所包含的内容在不断扩大如：蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、海洋生物技术、

生物转化等。

3.基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术。

细胞工程是生物技术的基础，也是反应器。

酶工程是生物技术的条件。

发酵工程是生物技术的获得最终产品的手段。

4.基因工程：是把不同生物的基因在体外剪切组合，并和载体（如质粒、噬菌体、病毒）

DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行克隆，并使转入的基因在细胞或微生物内表

达，产生所需要的蛋白质的技术。

5.酶工程是利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借

助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。

6.发酵工程是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。

所采用的新技术主要应用于3个方面：工艺改进,新药研制和菌种改造。

7.蛋白质工程是从改变基因入手制造新型蛋白质的技术。

8.过程:找到与新型蛋白质基因接近的基因，基因修改/突变，修改后的基因导入工程菌或

细胞中生产所需蛋白。

区别于基因工程：前者改变基因生成新蛋白，后者利用基因拼接技术生产现有蛋白。

9.抗体工程：应用细胞生物学或分子生物学手段在体外进行遗传学操作，改变抗体的遗传

特性和生物学特性，获得所需、有特定生物学特性和功能的新抗体，或建立能稳定获得高

质量和产量抗体的技术。

10.生物药物:指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部

分，甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。

11.生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病

的药物，主要是蛋白质或核酸类药物。

“治疗药物：肿瘤坏死因子、胰岛素、凝血因子、干

扰素等

1、用途.预防药物：疫苗

12.生物技术药物分类诊断药物：占绝大多数；4废诊断、器官功能标志物诊所、

.放射性核素诊断、DNA芯片

2、作用类型:细胞因2类、激素类、梅类、疫苗、单

克隆抗体、反义核酸药物、RNA广扰药物、基因治疗药

物。

3、生化特性：多肽类、蛋白质类、核酸类、聚二醇化

多肽或蛋白质药物。

13.生物技术药物的特性:

1）理化性质特性

a.相对分子量大：几千、几万，甚至几十万；

b.结构复杂：一级结构、高级结构、三维立体结构；

c.稳定性差：易受T、pH、化学试剂、机械压力、空气氧化、光照、表面吸附等影响失活。

2）药理作用特性

A.活性与作用机制明确：先明确机制，后开发药物；

B.作用针对性强：特定靶受体、靶器官；

C.毒性低：天然存在或衍生物、生物相容性好；

D.体内半衰期短：易被代谢；

E.有种属特异性：人源、鼠源、猪源等；

F.可产生免疫原性：结构或构型上与天然来源的不同

3）生产制备特性

a.药物分子在原料中含量低：发酵；

b.原料液中常存在降解目标产物的杂质：酶；

c.制备工艺条件温和：目标产物稳定性差；

d.分离纯化困难：结构相近异构体

e.易污染：微生物污染、变性（热源）

4）质量控制特性

A.质量标准内容：包括基本要求、制造、检定等；

B.制造项下的特殊规定：对于利用哺乳动物细胞生成的生物技术药物，在本项下，要写

出工程细胞的情况；对于利用工程菌生产的生物技术药物，在本项下要写出工程菌菌

种的情况；本项下还要写出原液和成品的制备方法。

C.检定项下的特殊规定：规定了对原液、半成品和成品的检定内容和方法。

14.生物技术制药概念：指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程等生物技术的原理

和方法，来研究、开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。

15.生物技术制药业快速发展的四十年

第一个十年(1975—1985)：生物时代

第二个十年(1985—1995)：技术平台时代

第三个十年(1995—2006)：基因组时代

第四个十年(2006—至今)：后基因组时代

第二章基因工程制药

1.基因工程:是通过对不同来源的DNA分子，按照预先设计，在体外构建杂种DNA分子，

从而实现遗传物质的重新组合，再借助载体，将目的基因转移到受体细胞中，并使目的基

因在受体细胞中进行复制和表达的技术。

2.基因工程制药的基本过程

外源基因

位切J拼接(工具酶)

]目的1回大丽相承】+载体

连接(工具酶)[

重组DNA

宿主细胞懿

工程菌/工程细胞

|扩增

1表达

目标蛋白一►测

3.基因工程菌的构建与筛选的基本方法

>基因工程菌株或细胞株的构建的设计思路直接影响后续的表达和分离纯化，是决定性

的环节。

>基因操作中常用的工具酶：限制性内切内、DNA连接酶、DNA聚合酶、核酸修饰酶

>限制性内切酶：常用的是II型限制性内切酶

>DNA连接酶仅能链接缺口不能连接裂口而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子

的一部分。

>DNA连接酶一大肠杆菌的DNA连接酶,需NAD+做辅助因子

T4DNA连接酶，需ATP做辅助因子

>DNA聚合聚一大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow大片断酶、TaqDNA聚合酶、反转

录酶等。

>核酸修饰酶一末端转移酶、碱性磷酸酶、T4多核昔酸激酶

4.目的基因的制备

问题：

为什么不能直接将分离真核细胞的目的基因，用于产生基因工程药物？

答案：

目的基因仅占染色体的很小一部分，从染色体直接分离纯化目的基因极为困难；

原核细胞无RNA加工剪切系统，含有内含子的基因组无法在原核细胞中表达。

5.目的基因获取的方法：化学合成法、PCR法、基因文库法（鸟枪法）、cDNA文库法

6.载体

克隆载体：是指能使外源目的基因在宿主细胞中大量繁殖的功能性载体

常见的载体有质粒、噬菌体、柯斯质粒等。代表：PBR322

表达载体：是指能使外源目的基因在宿主细胞中转录和表达的功能性载体。

常用：质粒、噬菌体、cosmid质粒

特点：带表达元件一转录和翻译所需的DNA序列

7.载体与目的基因的连接

a.DNA分子体外重组：连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接。形成重组子

（recombinant）的过程。

b.连接方式：粘性末端的连接、平头末端的连接

8.重组DNA导入宿主细胞

宿主细胞：

原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌

真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞

9.常用的基因工程药物表达系统

1）原核细胞

A.大肠杆菌：胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达（原核细胞

工程菌外源基因表达的形式）

B.枯草芽抱杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体；不

能使蛋白质糖基化；有很强的胞外蛋白酶，对产物进行不同程度的降解。

C.链霉菌：不致病、使用安全；分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中；具有糖

基化能力。

❖原核细胞工程菌的目的基因类型：CDNA,非基因组DNA,

2）真核细胞

a.酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养；表达产物直接分泌到细胞外；表达产物糖基化。

酿酒酵母、毕赤酵母应用最多。

b.丝状真菌：分泌能力强；翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；成熟的发酵和后处理工艺。

c.哺乳动物细胞：外源基因表达产物分泌到培养液中，产物易纯化；产物糖基化，接近或

类似于天然产物：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。

3）昆虫表达系统

杆状病毒作为载体，具有高度宿主专一性（节肢动物），操作安全

10.提高外源基因表达效率的有效途径：

1）优化表达载体的构建：启动子的强弱，SD序列和AUG的间距等。

A.启动子的强弱：目的基因插入表达载体启动子的下游，可增加基因的表达。/ac、trp、tac.

B.核糖体结合位点的有效性。

C.SD与AUG的间距：影响非融合蛋白的合成水平。

2）提高稀有密码子的表达频率。设计引物或合成基因时选择大肠杆菌“偏爱"的密码子。

3）提高表达产物的稳定性：组建融合蛋白；利用信号肽；特异性突变；位点特异突变

改变二硫键位置；宿主蛋白酶缺陷。

4）工程菌发酵过程的优化：细胞的代谢负荷：细胞生长和外源基因表达分为两

个阶段，即宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开。优化培养条件。

11.重组DNA导入细菌方法：化学转化法：氯化钙

电转化法：高压电脉冲

感染法：病毒（噬菌体或包装病毒）

12.重组DNA导入酵母：化学转化法：PEG、DMSO

电转化法：山梨醇、电击

原生质体转化法：酶消化除壁，PEG/CaCI2

13.重组子的筛选

载体遗传标记法：①抗生素抗性筛选法②互补筛选法

③营养缺陷型筛选法④噬菌斑筛选法

14.重组子的筛选与鉴定

A.核酸分子杂交法：

既可筛选重组子，也可鉴定目的基因，利用放射性核素或生物素标记的探针与目的DNA互

补杂交，从基因组文库、CDNA文库或者重组质粒中直接筛选和鉴定

探针序列可由已知的目的产物序列进行设计

特点：高度特异、灵敏度高

14.重组子的筛选与鉴定方法

A.核酸分子杂交法：①菌落（或噬菌斑）原位杂交

②DNA印迹分析(Southernblotting)

©NorthernBlotting（Northern印迹）

B.限制性酶谱分析法

C.DNA序列测定

D.目的基因表达产物测定法：酶联免疫吸附实验(ELISA),westernblotting

15.各种产物表达形式采用的分离纯化方法

基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质。具有以下特点:

①表达产物在初始料中含量较低;

②含有大量细胞及代谢产物;

③表达产物稳定性差，易失活变性；

④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异;

⑤应用面广，对其质量要求纯度高、无菌、无热原。

16.基因工程药物分离纯化的一般流程

发酵液一细胞分离

胞内产物胞外产物

细胞破碎

固必离•基闪【.程药物的分离

纯化般包括细胞破

包含体同质发达蛋门可溶性衰达产物碎、固液分离、浓缩

。初步纯化、高度纯

化”至内到纯M以及

___成__品_加__I工__。______________

—初步分离一高度纯

A.细胞分离方法

a.离心:利用固体及液体间的密度差来实现分离;

b.膜分离:常规过滤、微滤、超滤（微粒与大分子的分离）、反渗透（脱溶剂）、透析

（脱盐）、电渗透（脱盐）

,选择分离纯化方法的依据

B.细胞破碎方法

＞先浓缩（沉淀、超滤），后色谱

离心沉淀、膜过滤、双水相萃取＞先除量大杂质（非蛋白），后除难除杂质

＞先成本低、快速，后成本高、耗时

C.固液分离

＞先非特异、低分辨，后特异、高分辨

D.目的产物的分离纯化＞工艺衔接：不同分离机制的方法组合；前

操作单元的产物适合于下一单元的操作，

根据产物表达形式来选择如：盐析后一疏水性层析

a.细胞外分泌蛋白纯化前需浓缩

b.周质表达一溶菌酶+渗透裂解

c.细胞内可溶性表达一首选亲和层析

d.包涵体表达一洗涤变性复性

E.表达产物考察

/基因工程药物质量控制要点：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性、一致

性。

/生物学活性测定：效价测定、免疫学活性测定、体内生物学活性测定、体外生物

学活性测定、蛋白质的比活。

/蛋白质含量测定：Folin-酚试剂法、染色法、双缩胭法、紫外吸收法等。

/蛋白质纯度分析：SDS、等电聚焦、HPLC等

第三章：动物细胞工程制药

1.学习要求

掌握细胞工程制药、动物以及植物细胞工程制药的含义、基本技术；动、植物工程细胞

的体外培养方法；熟悉动物工程细胞的大规模培养及生物反应器；转基因动物的构建

方法

2.细胞工程制药的基本技术：细胞或原生质体的分离、培养技术；细胞或原生质体融

合技术；细胞核移植技术；转基因技术等。

3.体外培养动物细胞类型：贴壁依赖性细胞、悬浮细胞、兼性贴壁细胞

4,动物细胞的培养基：天然培养基、合成细胞培养基、无血清培养基

5.动物培养基采用膜过滤法灭菌

6.动物细胞培养常用的其他溶液：平衡盐溶液（BSS）、培养基pH调整液、细胞消化

液

7.生产用动物细胞的获得：原代细胞、传代细胞系、转化细胞系、工程细胞系（融合

细胞系，如杂交细胞，如骨髓瘤细胞系、基因工程细胞系，如CHO细胞，生产INF、IL、

EPO等）

8.动物细胞培养的基本技术：细胞的原代培养、细胞的传代培养、细胞的克隆培养、

动物细胞的冻存与复苏

9.动物细胞的大规模培养方法：悬浮培养法、微载体培养法、多孔载体培养法、微囊

培养、中空纤维培养法

10.动物细胞生物反应器类型：搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维式生

物反应器、透析袋或膜式生物反应器、固定床或流化床式生物反应器、一次性摇袋式细

胞培养生物反应器细胞匚程制药的基木过程

11.细胞工程制药的基本过程

12.外源目的基因转入动物的早期胚胎方法

显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞方法、基因打靶、精子载体导入法、人工

酵母染色体法(YAC)(转入较大基因)

13.基因打靶：根据同源重组原理实现外源基因的定点整合技术,包括基因敲除

(Knock-out)、基因敲入(Knock-in)、基因替代。

14.基因打靶必备条件：打靶载体、胚胎干细胞(ES细胞)

15.转基因动物反应器

动物生物反应器(bioreactor):目的片段在器官或组织中表达的转基因动物

优点：表达产物充分修饰，活性稳定，成本低，可大规模生产，产品质量高且易纯化

类型：动物乳腺反应器、转基因动物血液生物反应器、

转基因动物尿液生物反应器、转基因鸡蛋生物反应器

16.细胞工程制药尚待解决的问题

转基因动物的转入基因存在随机整合、调节失控、遗传不稳定、表达率不高等；

目的基因异位表达或表达产物泄露问题；

产物的分离纯化问题；

产物的结构和生物性与人体蛋白相似性不够

第三章：植物细胞工程制药

1.学习重点：掌握植物细胞工程及植物细胞工程制药的概念、内容、优势；植物细胞体

外培养方法；熟悉植物工程细胞及转基因植物生产药物的应用

2.植物细胞工程制药基本概念

/植物细胞工程

利用植物细胞为基本单位，按照人们的设计，在细胞水平上进行遗传操作，以及在体外条

件下进行培养、繁殖，改变细胞某些生物学特性，从而改良品种加速繁育植物个体或获得

有用物质的技术。

/植物细胞全能性：植物体中任何一个具有完整细胞核(染色体组)的细胞，在一定条件

下都可以重新再分化形成原来的个体。

/脱分化：己分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下又分化成未分化的细胞和组织

的过程。

再分化:通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化为胚状体或直接

分化出器官。

愈伤组织培养：从植物体的各种组织、器官等外植体，经脱分化而形成的细胞聚集体的

培养。

分生组织培养：又称生长锥培养，指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。

外植体：用于植物细胞（组织）培养的器官或组织.

无性繁殖系：使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外植体而获得越来越多的

无性繁殖后代。从同一无性系分离形成两个或多个不同系列，称无性系变异体。

突变体：经过确定已发生遗传变异，或新的培养物至少通过一种诱变处理发生变异所得

的新细胞。

继代培养：由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间称为第一代培养，连

续多代的培养为继代培养或连续培养。

次级代谢：由特异蛋臼质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合过程0

次级代谢产物：生物碱、黄酮、菇类、有机酸等。

植所采用技术

物植物细胞的全能性

的理论基础

细

胞

工

程

3.植物细胞工程药物包括：植物工程细胞生产药物、转基因植物生产药物

植物细胞工程制药

4.植物细胞工程制药流程，…、

分装冻干成品检定

离体的植物器官、

4.植物细胞全能性植物体中任何一个组织或细胞（外植体）

|脱分化

具有完整细胞核（染色体组）的细胞

愈伤组织

在一定条件下都可以

|再分化

重新再分化形成原来的个体的能力。

根、芽

5.植物细胞的培养I

植物体

/培养基：MS培养基

/生长调节剂/植物生长激素：生长素，细胞分裂素

赤霉素，脱落酸，乙烯。

,诱导子：刺激植物细胞合成防御性

次生代谢产物的物质，可以通过改变

次生代谢途径中催化酶的酶活力引起代谢通量和反应速率的改变，提高次生代谢产

物的产量。

/非生物诱导子：水杨酸，茉莉酸等，稀土及重金属盐类

/生物诱导子：微生物类，如真菌胞子，菌丝体真菌培养物滤液等

6.植物细胞的获得：外植体直接分离法、愈伤组织分离法、原生质体再生法

7.植物细胞的培养方法：单细胞的培养、单倍体细胞的培养（花药培养）、愈伤组织培

养、毛状根诱导和培养

8.植物细胞的大规模培养：大规模悬浮培养、细胞或原生质体的固定化培养

9.植物细胞生物反应器：改进的搅拌式生物反应器和气升式反应器

10.植物细胞培养工业化存在的问题

a.生长缓慢，通常完成一次生产周期需4-5周

b.次级代谢物含量低

c.培养细胞不稳定等，不耐受剪切力，易聚集化

d.多数次生代谢产物积累于胞内，提取困难

e.下游产物分离纯化成本较高

f.一般的说，只有当次级代谢产物的价格非常昂贵时，才考虑采用植物细胞培养方

法。

g.生物反应器技术还有待发展

1L转基因植物生产药物

优点：基因工程改造的植物细胞全能性、大田种植成本更低，易于管理、运输

应用：转基因植物生产重组抗体、转基因植物疫苗、利用转基因植物生产其他药物、极

具药用潜力的转基因植物（转基因胰岛素大米、转基因葛苣胰岛素胶囊）

12.转基因植物目前仍存在的问题

①产量偏低（至少需要达到1%）：目的基因沉默或不稳定表达的现象

②糖基化问题：抑制或消除植物糖基化;

③生物安全性和公众接受性以及工业化技术问题

④药用植物资源问题：野生资源匮乏，品质退化，受地区气候影响，不利于质

量控制、标准化、规范化

第四章酶工程制药

1.学习要求：掌握酶和细胞的固定化的概念、方法、优缺点；抗体酶、核酶、模拟酶

的概念及应用；非水相催化；熟悉酶的化学修饰；酶在医药领域的应用；

2.1953年，德国人提出了酶固定化技术。

3.1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：1酶的生产、2酶的分离纯

化、3酶和细胞的固定化、4酶的修饰及其分子改造、5非水相催化、6酶的传感器、

7酶的反应器、8抗体酶，人工酶和模拟酶、9酶和固定化酶技术的应用。

r单纯解

4-梅［结合丽（全酹）=的蛋白+辅因子

辅酶与梅蛋白结合得比较松的小分子有机物。

他囚r辅基与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。

金属激活剂金属离子作为辅助因子。

5.固定化所采用的酶可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或者使细胞碎片

上的酶或酶系。

6.现代酶工程的主要内容

a.酶的分离、提纯、大批量生产以及应用开发；

b.酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测；

c.酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；

d.酶的分子改造和化学修饰，酶的结构与功能的研究；

有机相中酶反应的研究;

f.酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；

g.抗体酶、核酸酶的研究；

h.模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。

7.酶的来源：提取分离法、化学合成法（固相合成技术）、生物合成法

8.筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛、纯化、复筛、生产性能检定

9.菌种改良的途径：基因突变、基因转移和基因克隆

10.常用的产酶微生物：Ecoli、枯草杆菌、啤酒酵母、曲酶（黑曲酶和黄曲酶）

细胞破碎一动物、植物或微生物细胞

11.酶的分离纯化

前提取,_发酵液

睡分离纯化

离心分离，过滤分离,

I沉淀分离,层析分离,

梅浓缩

电泳分离，萃取分离,

I结晶分离等。

梅贮存

酶的纯化方法

过滤、膜分离、电泳、凝胶色谱、离子交换层析、疏水层析、反相层析、亲和层析等

12.酶制备的基本原则：防止酶的变性失活、建立有效的目的醵跟踪监测方法

13.酶和细胞的固定化

（1）固定化酶的定义：指被固定在载体或被束缚在一定空间范围内进行催化反应的酶

制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以

是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。

（2）固定化酶的优点

①可多次使用，酶的稳定性提高;

②酶与底物和产物易于分开，易于纯化;

③反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；

④酶的利用率高，用酶量少；

⑤比水溶性酶更适合于多酶反应；

⑥一般不能长期保存。添加底物、产物、抑制剂和防腐剂，并于低温保存。

（3）固定化酶的缺点

①固定化时，酶活性有所损失；

②成本增加；

③只适用于可溶性底物；

④与完整菌体相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅酶因子的反应；

⑤胞内酶经常需要经过酶的纯化过程

14.酶的固定化方法

（1）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上（物理吸附法，离子结合法，共价结合法）

（2）交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间形成共价键，交叉

连接，形成网格结构。

（3）包埋法：酶和载体混合后，借助引发剂进行聚合反应

（4）新型的酶固定化方法：耦合固定化、无载体固定化、定向固定化

15.固定化细胞：将具有一定生理功能的生物细胞限制或定位在特定空间区域。

15.固定化酶（细胞）的应用：用固定化酶生产各种产物、制备酶传感器

16.制备酶传感器：将活性酶覆盖在电极表面，酶与被测物反应，形成一种能被电极响应

的物质。

17.酶电极：固定化酶一般用凝胶包埋成薄膜，与电极相连。

18.酶传感器可以简便快速测定特异性强的物质：糖类、醇类、有机酸、氨基酸、激素

等物质浓度的测定，在临床分析、工业检测等应用。

19.常见的酶反应器类型

固定化酶(细胞)的反应器：用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。

/按结构区分

搅拌罐式反应器(StirredTankReactor,STR)

鼓泡式反应器(bubblecolumnreactor,BCR)

填充床式反应器(packedcolumnreactor,PCR)是目前工业生产及研究中应用最

为普遍的反应器。

流化床式反应器(FluidizedBedReactor,FBR)

膜反应器(MembraneReactor,MR)常用的是中空纤维反应器。

/按操作方式区分

分批式反应(batch)

连续式反应(continuous)

流加分批式反应(feedingbatch)

/按混合形式

连续搅拌罐反应器(ContinuousStirredTankReactor,CSTR)

分批搅拌罐反应器(BatchStirredTankReactor,BSTR)

20.模拟酶

根据酶的作用原理，人为制造的具有酶性质的催化剂。利用有机化学合成的比酶结构

简单得多的具有催化功能的蛋白或非蛋白质分子。

特点：高效，高适应性，结构简单。

21.模拟酶的分类(按照模拟酶的属性)

①主-客体酶模型：代表-环糊精模拟酶

②胶束酶模型：胶束在水溶液中提供疏水微环境，可对底物束缚将催化基团(如

咪噗，筑基,羟基)和辅酶共价或非共价连接或吸附在胶束上,可提供“活性部位”

③肽酶：肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽，这

是多肽合成的一大热点。

④抗体酶

⑤分子印迹酶模型

⑥半合成酶

抗体酶

或称催化抗体是一类免疫系统产生的、具有催化活性的抗体。是一种新型人工酶制剂

特点：更高的专一性和更好的稳定性：精细识别

分子印迹

是指制备对某一特定化合物具有选择性的聚合物的过程。这个特定化合物叫印迹分子

（print-molecule,P）或模板分子（template-molecule,T）。

分子印迹酶

一种分子为模版，周围用聚合物交联，模版分子除去后，聚合物留下一空穴产生类似酶

活性中心的空腔.在结合部位的空腔诱导产生催化基团，并与底物定向排列.

22.酶的化学修饰

/目的：提高酶的稳定性,解除酶的抗原性,改变酶学性质，扩大酶的应用范围

/概念：通过主链切割，剪切和侧链的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，以改变其理

化性质及生物活性。

/酶的化学修饰方法：

A.酶的表面化学修饰

（1）大分子修饰：可溶性大分子如PEG通过共价键连接于酶分子的表面形成一层覆盖层。

（2）小分子修饰：侧链基团

（3）交联修饰：双功能基团，加固结构

（4）固定化修饰

（PEG是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫

原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用

于酶的修饰。获FDA认证）

B.酶分子内部的修饰

1）非催化活性基团的修饰：空间构象、酶动力学

2）蛋白主链的修饰：水解

3）催化活性基团的修饰：

4）与辅因子有关的修饰：辅因子共价结合，金属取代等

C.定点突变和化学修饰结合技术

化学修饰成本高，难度大

非天然AA,关键部位修饰

23.突变酶：采用基因工程技术对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，通过表达修改的

基因获得的酶

突变酶的应用：提高酶活性及稳定性、研究酶的功能基团

定点突变的方法：寡核苦酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变、盒式突变或片

段取代突变、循环延伸突变。

24.酶的分子定向进化，定向进化=随机突变+选择

25.酶的分子定向进化的突变策略：

①随机突变：易错PCR技术、连续易错PCR

②同源改组

③非同源改组

④结构域改组

26.核酶（RNase）：具有催化功能的小分子RNA属于生物催化剂可降解特异的mRNA序列。

核酶在医学上的应用：核酶抗肝炎病毒的研究、抗人类免疫缺陷病毒I型（HIV-炎核酶

抗肿瘤治疗（核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基

因的表达。）

27.非水相催化：酶在水活度受控制的非单一水相（有机溶剂、气体、超临界流

体、离子液等）中进行的催化反应称为非水相催化。

特点：酶构象比水溶液中更具“刚性”。通过选择不同性质的溶剂来调控酶

的某些特性。例如，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底物专一性，立体选择

性和手性选择性等。

28.酶非水相催化的应用：手性药物的拆分、功能高分子聚合物的合成、精细化

工产品的生产

29.酶工程主要研究内容是什么？

30.固定化酶和固定化细胞的特点和优点各是什么？怎样制备?

31.为什么要对酶进行化学修饰？

32.何为分子印迹？分子印迹的应用范围有哪些？

33.有机相酶反应的定义及其优点是什么？

34.何为人工模拟酶？

第六章蛋白质工程制药

1、掌握蛋白质工程的概念、研究内容、基本原理；蛋白质分子设计的层次、内容、流程

和策略；蛋白质药物的化学修饰；熟悉蛋白质工程的基本思路与基因工程的差异；

2.蛋白质工程：以蛋白质分子的结构功能的关系研究为基础，利用基因工程技

术，按照人类自身的需要，定向改造天然蛋白质，甚至创造新的、自然界本不

存在的、具有优良特性的蛋白质分子的现代生物技术。

3.蛋白质工程的理论依据：基因指导蛋白质合成。

基因工程一蛋白质L程

相同点操作环境——生物体外：操作对象——

基因；操作水平——分子

结果天然存在的蛋白自然不存在的蛋白

实质基因重组基因修饰或基因合成

流程中心法则中心法则逆推

蛋白质工程是在基因工程基础上的延伸

联系，是第：代基因工程

5.蛋白质工程的主要研究内容

1）从DNA水平改变基因，改造蛋白质

2）从一个或多个氨基酸残基、结构域、全新蛋白质，从不同尺度改造蛋白

3）有目的地改造，获得期望功能，强调分子设计

4）结合DNA重组技术改造蛋白质

6.蛋白质分子设计（ProteinDesign）：依赖于蛋白质结构测定和分子模型的建立，按照

蛋白质构效关系的理论基础，设计出比天然蛋白质性能优越的新型蛋白质。

7.蛋白质分子设计的层次

定点突变或化学修饰法（小改）、拼接组装设计法（中改）、全新蛋白质从头设计（大

改）

8.蛋白质工程的操作方法

①

②合理化的分子设计：活性、结构、专-一性

__________天然蛋门―

质结向预测蛋白液晶

③基因的定向突变和定向进化蛋白体学

1

蛋白质三维结构

④突变体的大规模筛选1

结构与功能关系

1

⑤突变体的表达及其分析检测从数据-蛋白质突变体设计及结构预测一

库输入1

几何优化及蛋白质动力学研究

蛋白质分子设计流程1

——-结构分析与原先的结构比较一

1

蛋白质合成定位突变

______分离、纯化1及表征________

—新蛋白质

9.突变策略

定点突变（寡核甘酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变、盒式突变）、随机突变

（易错PCR）、同源改组、非同源改组、结构域改组

10.筛选策略

荧光标记、平板分析（遗传互补筛选法）、噬菌体展示和细胞表面展示、高通量筛选

11.蛋白质药物的修饰：指在分子水平上对蛋白质药物进行化学改造，通过对主链的切

割、剪接及化学基团的引入，实现对蛋白质药物理化性质和生物活性的改变

12.PEG修饰

修饰靶点：多为蛋白质氨基，赖氨酸氨基和末端氨基

缺点：修饰产物同分异构体多而难以分离，难获得单一的PEG化产物

思考题

1、蛋白质工程的含义及其主要内容

2、蛋白质工程的主要步骤

3、蛋白质分子设计的原理与流程

4、蛋白质工程的基本思路与基因工程的差异

第七章核酸类药物

如何分清核酸、核酸药物、珍奥核酸三者之间的区别？

1）珍奥核酸：是从动植物组织中提取的核酸类物质

2）核酸类药物：是天然的代谢激活剂，有助改善机体的物质代谢和能量代谢，加速

受损组织的修复。

3）核酸：是由许多核昔酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。

1.学习要求：掌握翻反义核酸药物的作用机制、设计策略；RNAi的作用机制、特点;

熟悉反义核酸药物的作用特点；miRNA的基本特征；siRNA和miRNA的异同；

2.核酸类药物（广义）：腺甘、肌甘、尿昔、核甘酸、脱氧核甘酸、双丁酰环腺昔酸、

胞二磷胆碱等核酸组分及衍生物，是天然的代谢激活剂，有助改善机体的物质代谢和

能量代谢，加速受损组织的修复。临床广泛用于放射病、血小板减少、急慢性肝炎、

血细胞减少、心血管疾病等。

3.核酸类药物（狭义）：又称核甘酸类药物，寡聚核糖核甘酸（RNA）或寡聚脱氧核糖核

甘酸（DNA）,可以在基因水平上发挥作用：特异性针对致病基因，具有特定的靶点和作

用机制的药物。分类：反义核酸、RNA干扰药物

4.核酸类似物：主要有叠氮胸背、阿糖腺昔、阿糖胞甘、聚肌胞甘酸等。干扰病毒

DNA的合成，治疗病毒性疾病、肿瘤、艾滋病等。

5.反义技术（antisensetechnology）：人工或生物合成的特定DNA或RNA片段抑制或

封闭基因表达的技术；

6.反义核酸药物(反义药物)：包括：反义DNA、反义RNA、核酶；通常指反义脱氧

寡核甘酸(antisenseoligodeoxy-nucleotide,ASODN)。

7.反义RNA：指能和mRNA完全互补的一段小分子RNA或寡聚核甘酸片段

8.反义DNA：指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子

9.核酶：一类具催化活性和自我催化剪切的核酸分子，可精确地自我切除某些片段并

重新连接。

10.反义核酸作用机理

反义核酸可在转录、剪接、转运和翻译等各个环节上发挥调控作用。

①抑制转录：与DNA调控区或编码区结合，终止正在转录的mRNA链延长；抑

制mRNA剪切和成熟；

②抑制翻译：与mRNA形成dsRNA,诱导RNaseH对其降解;

③糖环修饰：包括a构型、/位取代、2'位取代、3'-3'连接、5'-5'

连接等。使核酸酶不能有效识别磷酸二酯键。

④肽骨架：ASODN的磷酸-糖骨架以肽键取代，即多肽核酸(PNA),PNA与DNA

以及RNA与PNA之间均可形成碱基配对。

10.反义核酸药物设计策略(3个S)

①选择性(selectivity)：5,端帽结构区、mRNA编码区、核前体mRNA拼接区、

反转录病毒的引物区等；

②稳定性(stability)：核酶酶解玲化学修饰反义核酸；C-G序列未被甲基化玲免

疫原性玲避免C-G序列；磷的修饰；

③溶解性(solubility):透过细胞膜玲分子大小(15-20)、电荷、脂溶性；化

学修饰，合适的药物递送系统；

11.硫代磷酸寡核甘酸(phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN)最为常用，称为"第一代

反义药物”。

12.反义核酸药物的应用

用于治疗恶性肿瘤、感染性疾病、炎症等。

已有一个FDA批准上市的反义核酸药物福米韦生(fomivirsen)

13.RNATife(RNAinterference,RNAi)：指进化过程中高度保守的、由双链RNA诱

发的同源mRNA高效特异性降解的现象。

14.RNAi作用机制(右图)

①启动阶段『^成21・23个臆基对的

小干扰性RNA

②RNA诱导的沉默复合物形成阶段IIIII

与青白结合

RNA诱导沉默复合体

(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)

③效应阶段

15.miRNA(microRNA,微＜1、RNA)

JfjTT识匚别二程二序列

IgffiRNA(mRNA)

长度约为21~25nt小分子单链RNA

调控基因表达的小分子，具有阶段特异性、组织特异＞撷被降解，基因沉默出现

16.RNA!的作用特点

1)高度特异性、高效性

2)可传播性和可遗传性

3)高稳定性

4)dsRNA长度限制性

5)RNAi效应的依赖性

6)ATP依赖

项目siRNAmiRNA

长度特征都是约为22nt的小分子

相合成底物均由双链RNA或RNA前体加工而来

同Dicer®均需Dicer®来加工

点Argonaut屋白均需Argonaute蛋白参与

RISC均是RISC组分，在介导沉默机制上有相似之处

作用方式均可导致mRNA的稳定性降低

思考题

1、什么是核酸药物

2、反义核酸药物的作用机制;

3、RNAi的作用机制；

4、siRNA和miRNA的异同；

5、反义核酸药物的设计策略;

第八章多肽类药物

1.学习要求

掌握多肽类药物的定义、分子组成、优点；

熟悉人工合成多肽的方法；多肽类药物的剂型与给药途径

2.多肽类药物的优势

1）活性高，特异性强；

2）分子量小，易吸收，生物利用度高；

3）易合成，合成效率高，过程自动化，易于控制；方便结构改造；

4）副作用小。序列同源，不易引起免疫反应；

5）信使作用（神经递质），载体作用；

3.多肽：由氨基酸缩合而成的化合物；一般10-50个氨基酸；多数无特定空间构象

4.活性多肽：体内含量低，但生理功能强，在神经、内分泌、生殖、消化、生长等系

统中发挥着不可或缺的生理调节作用。

多肽类药物（多肽类激素）是机体的特定腺体合成并释放的一种物质，通过与远程敏感

细胞内或细胞表面的受体相互作用而使靶细胞发生变化。主要包括垂体多肽激素、下丘脑多

肽激素、甲状腺多肽激素、胰岛多肽激素、肠胃道多肽激素和胸腺多肽激素等。

5.多肽类药物的作用靶点：主要为G蛋白偶联受体（GPCRs）

6.多肽药物的制备方法

化学合成（液相合成法、固相多肽合成法SPPS）、酶解法、基因工程法

8.多肽类药物的剂型与给药途径

•多肽类药物的稳定性：稳定性差，半衰期短；

原因：脱酰胺、氧化、水解、错误二硫键、消旋、变性、吸附、聚集或沉淀

如何提高：定点突变、化学修饰、基因融合、添加剂、冻干

•多肽类药物的剂型：大部分为注射剂，静脉注射或静脉滴注为主，冻干粉

•目前上市的多肽药物制剂有微球、埋植齐I」、脂质体、微乳纳米粒等

9.研发上市的多肽药物

/齐考诺肽：具有镇痛作用的芋螺毒素Ziconotide（齐考诺肽），为N-型电压门控钙

通道阻滞剂，于2004年12月被美国FDA正式批准为鞘内注射治疗疼痛的新药，

商品名为Prialt»

/艾塞那肽：细胞因子模拟肽，大毒蜥的唾液中提取出十多种蛋白和毒素。其中，

种名为exendin-4（39aa）的蛋白被发现同人体消化管中的胰高血糖素类多肽-1有

50%的同源性治疗II型糖尿病。

/恩夫韦肽：在美国上市（罗氏）。新一代抗HIV新药，病毒的融合阻止剂类药

物（36aa）»

10.多肽类药物的应用

①抗糖尿病或低血糖症多肽

②抗肿瘤多肽

③抗感染多肽：与传统的抗菌药不同，抗菌肽作用于细菌的细胞膜，使细胞膜穿

孔，细胞质外溢而达到杀菌的目的。

④抗心血管与泌尿系统疾病治疗多肽

⑤多肽疫苗：价格低廉、安全性高、特异性强（HIV-I病毒多肽疫苗；丙肝病毒

（HCV）多肽疫苗）

⑥其他药用多肽、诊断用多肽

思考题

1、多肽药物特点

1）调节各种各样的生理活动和生化反应；

2）生物活性高；

3）分子小，结构易于改造；

4）许多活性多肽都是由无活性的蛋白质前体经酶加工剪切转化而来；

5）安全性高

2、多肽药物制备方法；

3、多肽类药物的剂型和给药途径；

4、多肽类药物的应用

第九章治疗性抗体

1.学习要求

掌握基因工程抗体的分类、结构和特点；单克隆抗体制备的过程;

熟悉噬菌体表面展示技术建立抗体库；抗体的功能和基本结构；

2.抗体分类：IgG、IgM、IgD、IgA、IgE

3.抗体的结构：

1）基本结构：四肽链结构，两条轻链（L）

2）可变区（V区）

L链N端1/2处（VL）

H链N端1/5处（VH）

3）恒定区（C区）

L链C端1/2处（CL）

H链C端3/4处（CH）

（在同一种属动物中比较恒定）

4）超变区&骨架区

都在可变区

超变区（HVR）/互补决定区（CDR）：

某些特定位置的氨基酸残基显示更大的变异性；

骨架区（FR）：维持HVR的空间结构

5）被链区：位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，易伸展弯曲

4.抗体的结构与功能：VL和VH是抗原结合的部位（FV区）。

CL1和CH1上具有同种异型的遗传标记。

CH2具有补体结合点。IgG可通过胎盘屏障。

6.细胞融合：

骨髓瘤细胞：次黄喋吟鸟喋吟磷酸核苗转移酶（HGPRT）缺陷型，确保其对HAT培养基

的敏感性；融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长

期稳定等特点

细胞融合基本方法：取适量脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*107-3*107）进行混合,

在PEG作用下诱导融合。为提高融合率