中国柑桔黄龙病研究三十年

PAGEPAGE10PAGEPAGE10 中国柑桔黄龙病研究三十年30-yearResearchesofCitrusHuanglongbinginChina目录因时间紧迫，未对全文进行排版，故目录页码和正文对不上。第一章中国柑桔黄龙病研究三十年 11柑桔黄龙病发生与分布 11.1国外发生概况 11.2国内发生概况 22柑桔黄龙病寄主 73柑桔黄龙病的危害 113.1典型症状 113.2危害严重性 114柑桔黄龙病病原研究 124.1黄龙病病原问题 124.2病原提纯与抗体制备 154.3病原的分离培养 154.4诊断与检测 154.4.1田间诊断 154.4.2指示植物鉴定 164.4.3电镜观察 164.4.4血清学检测 164.4.5组织化学诊断 174.4.6生理生化指标诊断 204.4.7PCR检测 174.5柑桔黄龙病病原分化 205柑桔黄龙病传播途径与病害流行 215.1柑桔黄龙病传播途径 215.2柑桔黄龙病流行与蔓延 216柑桔黄龙病防控技术 226.1防控策略 226.2防控措施 236.2.1强化检疫 236.2.2适地建园 246.2.3培育和推广使用无病苗木 286.2.4及时挖除病株 286.2.5严格防除柑桔木虱 346.2.6加强果园管理 367结尾语 36第二章柑桔黄龙病研究文摘 371.12008年 371.22007年 431.32006年 671.42005年 911.52004年 1061.62003年 1141.72002年 1191.82001年 1211.92000年 1221.101999年 1251.111998年 1281.121997年 1311.131996年 1331.141995年 1351.151994年 1371.161993年 1371.171992年 1391.181991年 1401.191990年 1411.201989年 142第三章柑桔黄龙病研究参考文献 145第一章中国柑桔黄龙病研究三十年摘要文章综述了我国自1978年以来有关柑桔黄龙病的研究概况，其中包括柑桔黄龙病在我国的发生和分布，柑桔黄龙病寄主，柑桔黄龙病的危害，柑桔黄龙病病原研究，柑桔黄龙病传播途径与病害流行，柑桔黄龙病防控技术等。文章共引述了144篇参考资料。30-YearResearchesofCitrusHuanglongbinginChinaAbstract：Thepresentpaperdealswithageneralreviewoftheresearchesofcitrushuanglongbing(HLB)whichhavebeendoneinChinasince1978.Topicsincludedaretheoccurrenceandgeographicaldistribution,hostplant,destruction,studiesofpathogen,transmissionrouteanddiseaseepidemic,andcontrolofHLB.144literaturesarecited.我国为柑桔黄龙病(Huanglongbing,HLB)的老病区，自文字记载世界第一例柑桔黄龙病在我国发生以来已近百年，尽管期间有许多的争议和起伏，对柑桔黄龙病及其危害的研究还是日渐深入。尤其是1978年柯冲首次报道了电镜下观察到我国黄龙病病原的形态以后，经广大科研工作者不懈地努力和探索，我国柑桔黄龙病的研究取得了显著进展。本文主要是对我国三十年来有关柑桔黄龙病的研究作一个综述性的简明报道。1柑桔黄龙病发生与分布1.1国外发生概况柑桔黄龙病是世界柑桔生产上最具毁灭性的病害之一。自20世纪初在华南地区首次报道以来（Reinking,1919），除地中海盆地、西亚、澳洲和太平洋岛屿等尚未有柑桔黄龙病发生的报道外，已在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的40多个国家相继发生（Bové,2006）。柑桔黄龙病在各地有各种不同的病名，在南非被称为青果病（greeningdisease），菲律宾、印度和印度尼西亚又分别被称为叶片斑驳病（mottleleaf）、梢枯病（dieback）和韧皮部衰退病（veinphloemdegeneration）（Bové,2006）。2004年和2005年，世界最重要的两个柑桔主产区——巴西圣保罗州（Texeiraetal.,2004）和美国佛罗里达州（Halbert,2005）相继发生黄龙病，造成了世界柑桔从业者的恐慌，巴西和美国均加强了对该病害的研究力度。美国农业部已投入大量研究经费，美国国家科学院也介入柑桔黄龙病的研究行列（夏竹,2008a,2008b），国际合作广泛开展。1.2国内发生概况我国是世界主要柑桔的原产地，品种资源丰富，栽培历史悠久。自1990年以来，我国柑桔产业迅猛发展。迄今，柑桔栽培面积已达171.7万hm2以上，居世界第一位；其产量超过1591.9万t（中国农业年鉴编辑委员会,2006），居世界第二位，仅次于巴西。柑桔黄龙病是我国柑桔生产上最具毁灭性的病害，其发生的历史长，分布广，危害大。半个多世纪以来，严重地危害着广东、广西和福建三省区柑桔事业的发展。70年代末，四川省西昌地区及江西赣州地区也先后发现柑桔黄龙病（柯冲等,1980b），到80年代中期，柑桔黄龙病已在我国广东，广西，福建，海南和台湾的产区广泛蔓延，并在浙江，云南，贵州，湖南相继发生（吴世盘和李剑书,1986），我国有柑桔栽培的19个省、区已有11个遭受危害，其面积占柑桔总栽培面积的80%以上，产量占总产量的85%左右。更令人担忧的是，由于柑桔黄龙病病原能侵染各种柑桔类植物，将对我国柑桔种质资源的保护构成严峻的挑战。图1中国柑桔黄龙病的分布：表病区,表无病区.2柑桔黄龙病寄主黄龙病是高度专化性病害，能侵染各种柑桔类植物，主要为害柑桔属（Citrusspp.）、枳属（Poncirustrifoliata）和金柑属（Fortunellaspp.）。包括宽皮桔类，橙类，宜昌橙类，柚类，枸橼类，金柑类和枳类等的品种和栽培种。品种间的抗病性有差别，其中宽皮桔类，橙类，宜昌橙类最感病，柚类次之，其他各类较抗病，而枳类最抗病，感染后多不表现病状，尚未发现免疫品种。酒饼簕属（Severiniabuxifolia）（Hungetal.,2001）和芸香科九里香属（Murrayakoenig）的九里香也是黄龙病的寄主（李韬和柯冲,2002;李韬等,2007;娄兵海和周常勇,2007）。黄龙病菌还可以在假黄皮（Clausenaexcavata）和象桔属（FeronialimoniaSwingle）的木苹果存活一段时间，为黄龙病暂时性寄主（杨建榕和李健,2007）。3柑桔黄龙病的危害3.1典型症状柑桔受黄龙病侵染后，产生一系列典型症状。初发病时，或是树冠上少数嫩梢新叶尚未完全转绿成熟便发病黄化，形成均匀黄化型黄梢；或是叶片已完全转绿成熟后发病，叶片退绿黄化，产生黄绿相间的斑驳，形成斑驳型黄梢。其后在病梢上再长的新梢，叶片榨小，多呈缺锌状花叶，病树上原来未发病的梢上叶片也陆续呈现斑驳，黄化脱落，树势衰退，产量大减（范怀忠等,1986）。黄龙病的病状十分复杂，易与缺素等生理性病害的病状相混淆。但在柑桔特定的生长期（新梢期）和气温由高转低的季节（10月份至翌年春梢前），表现出特异性的黄梢和斑驳病状，可以作为田间诊断的依据。最初，在广东潮汕地区的芦柑和蕉柑病树上常见的病状是黄梢，二十世纪60年代，在福建地区的福桔病树上最先发现斑驳病状。此后，在各地病树上表现的斑驳病状比黄梢更突出，成为最常用的田间诊断依据。最近，各地黄龙病树上表现红鼻果的病状十分明显，经常在福桔病树上只表现红鼻果病状。引起病状变化的原因值得探讨。3.2危害严重性柑桔黄龙病能侵染各种柑桔类植物，病树主要表现为经济寿命短，产量低，果品质劣，引起巨大的经济损失。柑桔树的经济寿命原来可达几十年，乃至上百年，可是受黄龙病危害之后，柑桔树的寿命大大缩短，仅有10年左右（吴如健和柯冲,2007）。柑桔黄龙病曾给广东、广西和福建三省区的柑桔产业造成严重影响，近年来该病害又有卷土重来之势。广东杨村柑桔场，1978年开始，黄龙病严重为害，每年清除病树两三百公顷，1972年以前种植的96万株大树几乎全部被毁，1972年以后种植的植株损失20万株，总产量由1977年的2.15万t降为1982年的0.53万t（赵学源,2008）；作为国内外独一无二的特产，广东廉江市的红橙种植面积如今发展到近8万亩。然而，令当地果农至今仍心有余悸的黄龙病，目前仍然继续蔓延。据了解，现在红橙果园的发病率达10％～20％，其中部分果园发病率达30％～40％，对红橙生产造成严重影响。广西自治区的柳州市，1977年柑桔产量达到0.57万t，因受柑桔黄龙病的危害，产量逐年下降，至1982年仅有0.14万t（范怀忠等,1986）；梧州市20世纪60年代就查出有柑桔黄龙病发生，1982年全区柑桔黄龙病普查时发现，该市的黄龙病普遍比较严重，梧州市郊及藤县、岑溪和蒙山等地均有不少桔园因柑桔黄龙病的严重危害而被迫淘汰(邱柱石等,2007)。20世纪60年代在桂林地区荔浦县只有零星分布，70年代末由于该县被国家外贸部认定为全国夏橙出口生产基地县，柑桔种植面积尤其是夏橙面积迅速增加，曾达3300hm2。但在夏橙生产的发展过程中，柑桔黄龙病也在不同程度地蔓延扩散，每年毁于该病的果树数以万计，给全县夏橙生产带来极大损失(韦宗便，2006)。福建为我国柑桔的主产区之一，2006年栽培面积为17.0万hm2，产量达226.7万t，产量、人均占有量和鲜果出口量均居全国第一位（龚守栋和陈建,2007），柑桔生产已成为福建省农民增收致富的一条重要途径。然而，自2003年以来，福建柑桔主产区普遍反馈柑桔黄龙病呈爆发态势，危机产业安全。永春县引种柑桔已达50年之久，一直以来，黄龙病发病率均控制在1％以下，在全国南亚热带柑桔产区中属发病率最低的地区，但近年来黄龙病为害日益严重，3年时间内发病率由不到1％上升至5％，一些果园达20％～30％以上，并有成片果园被毁(张生才，2005)；著名芦柑产地漳州市受黄龙病的危害严重，每年柑桔死亡面积达5％，曾因“柑中之冠”而闻名的长泰县已成为柑桔返销地（谢钟琛等,2007）。因此，柑桔黄龙病已成为我国柑桔产业发展的重大威胁。柑桔受黄龙病感染后，不仅产生黄梢、叶片斑驳及缺素等症状，也引起一系列的细胞生理和病理变化。通过草地菟丝子将长春花中的黄龙病病原回接柑桔的实验中，发现其回接成功率低的原因主要在于渗透压的区别，因为无论是病、健株，柑桔渗透压均比长春花的高一倍（柯穗等,1988a）。更为有趣的是，寄主植物的病株叶脉压榨液的渗透浓度都比健株的高出1/3至1/2（柯穗等,1989），其中的病生理问题值得探讨。黄龙病病原主要局限于柑桔韧皮部的筛管细胞内，严重破坏韧皮部组织，其细胞的亚显微结构也有明显的变化。病叶中叶绿体受到严重破坏，淀粉粒异常膨大，基粒片层被膨大的淀粉粒所挤压，排列松散，不规则，有些切片中还可看到叶绿体中的嗜锇体亦有变大的现象；在染病的韧皮部和木质部中，细胞质膜凹入形成质膜体，内含多数形态不一的空泡；线粒体内嵴断裂不完整或消失（吴世盘和章潜才,1985），引起原生质和线粒体逐渐消失。随着菌体数量的增多，导致韧皮部的崩坏，这与黄龙病叶片的黄化、变硬、有草质感以及病树的多花现象是相一致的。所以在叶片表现明显病状时，其筛管细胞内菌体含量最高。病原体有通过筛板中的筛孔进入相邻的筛管细胞的现象（吴世盘和李剑书,1986）。菌体还会侵蚀筛管细胞的胞壁形成许多侵蚀孔，成为菌体除了筛孔以外向邻近筛管细胞移动的另一个通道（柯冲等,1991）。4柑桔黄龙病病原研究4.1黄龙病病原问题我国黄龙病的病原问题，经历长期的研究与激烈的争论后，科学地统一了认识。1956年前，对黄龙病的病原有种种推测，但都缺乏有说服力的实验根据（柯冲,1979）。1956年，林孔湘发表病芽接种能传病的研究成果后，认为是病毒病害（林孔湘,1956）。七十年代发现传病昆虫是柑桔木虱（华南农学院植保系植病教研组,1977），而且当病树注入盐酸四环素后，病情受到明显抑制（广西柑桔黄龙病小组,1978），斑驳叶片中的淀粉积累现象消失（陈乃荣等,1981），筛管细胞内多型性、双层膜厚度为20nm左右的病原物也出现萎缩、变形、聚集崩坏现象，曾设想病原是类菌质体（Mycoplasma-likeorganism,MLO）（陈作义等,1979a,1979b;陈乃荣等,1981）。1978年，在中国植物病理学会阳朔会议上，福建省农科院柑桔黄龙病研究组报告了采用超薄切片和电镜技术的研究结果，首次报道了电镜下观察的我国黄龙病病原的形态。由于菌体界限膜厚17～33nm，呈波浪状外形，称之为类立克次体（Rickettsia-likeorganisms,RLO）（柯冲等,1979）。随后通过指示植物、电镜观察和抗生素反应（尤其是青霉素）实验进一步证实黄龙病的病原既不是真正的病毒（赵学源等,1979b），也不是类菌质体，而是一种类细菌的原核生物（赵学源等,1981），其界限膜似有细胞壁的性质（陈乃荣等,1981）。有称之为类立克次体或类细菌（Bacteriumlikeorganism,BLO），也有称之为类薄壁菌型细菌（Gracilicutelikebacterium）（吴世盘和李剑书,1986;范怀忠等,1986）。柯冲等（1991）应用超薄切片与细胞化学的方法，对黄龙病病原形态和病原细胞壁进行研究，认为我国柑桔黄龙病和印度青果病病原是相同的，同属于一种革兰氏阴性细菌，但它们之间具有不同的血清型。从此，我国植物病理界统一了对黄龙病病原性质的认识。黄龙病也是国际柑桔上最重要的一种病害。长期以来国外多称之青果病（Greeningdisease）。最初认为黄龙病的病原是类菌原体。后来，法国学者进一步对病原菌体的细胞壁结构及DNA的研究，确认黄龙病的病原是一种革兰氏阴性细菌，属于候选的韧皮部杆菌属（Candidatusliberibacter）。1995年，在福建省福州市召开的第十三届国际柑桔病毒学会（IOCV）的工作会议上，全体代表鉴于我国林孔湘教授证明黄龙病的传染性比南非的青果病早十年，一致通过决议，将这一类柑桔病害正式称为柑桔黄龙病（Huanglongbing,HLB），国际上统一了柑桔黄龙病的病名。4.2病原提纯与抗体制备在实验室内，利用菟丝子成功地将黄龙病菌从柑桔转到草本植物长春花上，黄龙病菌能够得到比在柑桔树体内更好的生长与繁殖，菌体浓度较高，为直接从长春花病株中提纯黄龙病病原奠定了基础（柯穗等,1986;唐伟文和范怀忠,1987）。采用草地菟丝子(CuscutacampestrisYunck)为桥梁，将黄龙病病原从柑桔传到长春花（Catharanthusreseus），起初引起长春花叶脉局部黄斑，后渐扩展为全叶黄化，其潜育期为3～6个月（柯穗等,1986）。通过草地菟丝子也可将长春花上的病原回接到柑桔（唐伟文和范怀忠,1987;柯穗等,1988a），但回接成功率低（柯穗等,1988a）。虽然日本菟丝子（CuscutajaponicaChois）在毒源柑桔植株和长春花上生长良好，但并不能把黄龙病病原传到长春花上，说明不同种的菟丝子作为黄龙病病原的传染媒介具有选择性（柯穗等,长春花是草本植物，不仅容易种植，而且其筛管细胞受黄龙病病原侵染的比例和筛管细胞内所含病原的数量都比柑桔多，所以长春花是柑桔黄龙病病原最适宜的草本寄主，是研究黄龙病病原的良好材料（柯穗等,1986）。图2．健、病长春花图3.长春花病株筛管细胞内病原体（31000X）以发病长春花的叶片为材料，黄龙病病原获得了粗提纯（柯穗等,1988b），并制备了小鼠抗腹水，由于所提取病原的浓度和纯度较低，该鼠抗腹水效价低，并伴有非特异反应（柯穗等,1989）。李德望等（1992）也以类似的方法制备了小鼠抗体IgG，建立了间接ELISA法和间接免疫荧光法，因效价和灵敏度问题难以推广应用。用BLO粗提纯物为抗原，筛选到二个杂交瘤细胞株(CF1和CF2)能分泌抗黄龙病BLO的单克隆抗体。采用免疫荧光法检测，抗体能识别长春花和柑桔病株，前者产生强荧光反应，后者产生弱荧光反应，而长春花和柑桔健株以及长春花感染类菌原体的病株均不产生荧光反应（田亚南等,1998）。4.3病原的分离培养在国外，柑桔黄龙病病原最早于1985年有人工培养成功的报道（Garnett,1985），但并未获得认可。中国科学院武汉病毒研究所和华南农业大学分别报道了柑桔黄龙病菌体外培养获得成功。赵鸿燕等（1989,1990）将患柑桔黄龙病的柑桔树叶片，消毒、匀浆，并经细菌过滤器抽滤，接种于修改后的培养柑桔青果病病原的培养基，置30℃恒温培养箱中培养，以超薄切片验证培养物，并进行抗菌素敏感性试验和生物感染试验。胡勤学等（1991）采用感染柑桔黄龙病菌的长春花嫩叶作为外植体，诱导形成愈伤组织，建立类细菌离体培养系统，并认为切片观察到的类细菌不是外植体中有限量的类细菌，而可能是通过愈伤组织扩增后产生的类细菌，还发现了类细菌类似出芽的一种增殖方式。但以上分离培养试验都未经柯赫法则（Koch′sPostulate）验证。张景宁等（1994）报道了以感病柑桔叶脉浸出液，在自配的半合成复合培养基培养柑桔黄龙病菌获得成功。分离培养的类细菌以虫传、针注、剥皮、浸根等方法接种健康的柑桔幼苗，表现出典型的黄龙病症状，经组织超薄切片的电镜观察，证明筛管细胞存在着病原类细菌。接种发病的植株再次分离到同样的类细菌，所得分离物的菌体和菌柄形态与原分离物完全一致。尽管该分离培养方法一定程度上验证了柯赫法则，也制备了免疫抗血清并用于检测诊断（刘仲健等,1993,1999;何平等,1997;张景宁等,1997;廖俊杰等,2005），但存在很大争议，没有获得广泛的认同。4.4诊断与检测柑桔黄龙病的检测是一个从传统生物学向分子生物学、从定性检测到定量检测的发展过程。从观察病状，生物鉴定，电镜与超薄切片技术，血清反应，到PCR（polymerasechainreaction,PCR）反应等技术，对黄龙病诊断和检测的研究，经历了很长时间，取得很大的进步。目前，使用PCR技术诊断黄龙病，已达到快速、准确的定性与定量的要求。4.4.1田间诊断研究柑桔黄龙病的困难，在于它的病原无法人工培养｡因此，长期以来对黄龙病的诊断，主要依据典型的黄梢和叶斑驳症状｡柑桔感染黄龙病后，全年均可表现症状，在田间以夏梢、秋梢发病最多，其次是春梢。新抽出的病梢，其叶片不能正常转绿，表现均匀黄化或呈斑驳症状。这样症状是十分明显和较为特异的，具有诊断的价值。目前，主要选择各个新梢的成熟期，特别是在每年的10～12月秋梢成熟以后，症状表现的最适期间，根据当年秋梢叶片的斑驳症状来诊断田间的黄龙病病树，可以达到相当可靠的程度。但是，症状的发展过程会受到环境条件的影响。例如在果园管理不良、营养缺乏或其他病虫危害严重的情况下，病树若不表现典型症状则难以诊断。这也是造成对黄龙病病原种种混淆看法的一个主要原因。因此，症状诊断必要时要与鉴别寄主(芦柑)的生物学测定相结合（田亚南等,1998）。4.4.2指示植物鉴定指示植物鉴定因不需要许多设备和技术、方法简易可行，是柑桔黄龙病早期主要的鉴定方法。虽然现有的栽培品种对黄龙病都是高度敏感的，本身就是一种良好的指示植物，但考虑到不同品种发病症状的多样性和不稳定性，对于一些柑桔新区来说，为了弄清黄龙病是否确已侵入本区，对一些怀疑树可用指示植物加以鉴定。常用的指示植物有芦柑、蕉柑、甜橙等（吴世盘和钱菊梅,1988）。芦柑因显症快、症状稳定被我国作为柑桔黄龙病的指示植物（张天淼,2000）。作为鉴定用的指示植物必须采用实生苗，砧木种子事先用55～56℃温水处理50min，整个鉴定过程都必须在防虫设备中进行。过去用单个病芽腹接传病，近年来的研究发现，用含2～3个（甚至多个）病芽的枝段嫁接可提高其传病率（赵学源等,1982;王芝生和柯冲,1985），潜育期4~12个月。嫁接接种后，如将指示植物重修剪，每株只剩下2~3片叶，并加强肥水管理，促使新梢发生，可以大大缩短潜育期，二个月左右即可发病（吴世盘和钱菊梅,1988）。4.4.3电镜观察自1977～1978年间利用电镜与超薄切片技术，在柑桔黄龙病病树叶片的筛管细胞内发现病原类细菌以来（柯冲等,1979a,1980b;陈作义等,1979a,1979b,1980），电镜便成为诊断黄龙病的一个重要手段。在电镜下，病原BLO的形态、大小及菌体的壁膜结构等特征都能观察得清楚，可以做出正确的诊断。但是，由于柑桔病树体内BLO浓度较低，分布不均匀以及电镜制样采用的叶脉较小等因素的影响，电镜对BLO的检出率偏低，多在60～70％之间。近来，采用症状明显、老熟的叶片为材料，采用侧脉代替中脉和纵切代替横切韧皮部制样，能够有效地提高电镜对BLO的检出率（田4.4.4血清学检测柑桔黄龙病病原属于难培菌，仅限于感病柑桔韧皮部筛管细胞，含量低、分布不均匀，导致抗血清制备艰难。从发病长春花粗提纯黄龙病病原（柯穗等,1988b），以粗提纯黄龙病病原为抗原制备了小鼠抗腹水，由于所提取病原的浓度和纯度较低，该鼠抗腹水效价低，并伴有非特异反应，难以推广应用（柯穗等,1989）。随后的研究表明，以类似方法制备的小鼠抗腹水尽管其效价有了较大提高，能够比较准确的检测发病长春花中的黄龙病病原，但是对未显症或初显症柑桔植株，以及部分具典型病状的柑桔叶片的检测并无血清学反应（李德望等,1992）。有利用国外机构提供的多克隆抗体成功检测柑桔黄龙病病原的报道（张陶等,1993）。国内对柑桔黄龙病单克隆抗体的研制并未获得满意的结果。福建省农业科学院果树研究所柑桔黄龙病组曾以柑桔黄龙病菌粗提纯物为抗原，筛选到二个杂交瘤细胞株(CF1和CF2)能分泌抗黄龙病病原的单克隆抗体。采用免疫荧光法检测，抗体能识别长春花和柑桔病株，前者产生强荧光反应，后者产生弱荧光反应，长春花和柑桔健株以及长春花感染MLO（植原体）的病株均不产生荧光反应（田亚南等,1998）。柑桔黄龙病的单克隆抗体多仅适用于免疫荧光检测，尚难用于酶联免疫吸附测定法（ELISA），所以单抗的应用受到很大的限制。4.4.5组织化学诊断主要基于两个原理，一是感染黄龙病菌的寄主植物，其韧皮部坏死细胞群或经化学染色后的愈伤组织，在荧光的激发下会形成特殊的荧光而加以诊断。如以透射式荧光显微镜观察，健叶和病叶叶柄切片在荧光的激发下，木质部导管胞壁发黄色荧光，韧皮纤维发绿色荧光，但感染黄龙病的病组织切片，在韧皮部中则可看到一到多个鲜明的黄色或黄绿色荧光团块（坏死细胞群），但取样必须是完全老熟的黄化叶片，而且以病秋梢的结果最稳定，嫩梢、嫩叶以及感染黄龙病但尚未表现症状的叶片，因未产生坏死细胞无法检测（吴世盘,1987）；苯胺兰作为荧光色素染色后，荧光显微镜下，病叶切片韧皮部愈伤组织会发出明亮的、不正常的黄绿色荧光，其强弱与症状有关，斑驳叶荧光最强，其次为黄化后期缺素状叶，健叶没有或只有稀疏的几点黄绿色荧光。其准确性同样受取样时间和取样部位的影响，以夏梢和秋梢叶片转绿而尚未充分老熟时取中脉切片染色观察，准确性最高（吴世盘和范怀忠,1988）。二是韧皮部坏死细胞群或病原菌经化学染色后，能够使坏死细胞群或病原菌与柑桔韧皮部筛管细胞分色，达到在光学显微镜下进行区分诊断的目的。如番红染色感染黄龙病的柑桔叶柄切片，显微镜下可观察到韧皮部出现特有的红色团块，这种特征性红色团块可以作为鉴定黄龙病的依据（吴世盘和范怀忠,1987）；以FBA法浸染新梢主脉或嫩茎切片，能使病原体与柑桔韧皮部筛管细胞分色，光学显微镜下可观察到病原的形态（林尤剑和高日霞,1990）。显微镜观察法方便直观，但易受取样部位、取样时期和制样方法(切片厚度等)的限制，容易造成漏检，实际生产中少有采用。4.4.6生化指标诊断用聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）分析柑桔蛋白质种类上的差异，感染黄龙病的病株中，存在一种健株所没有的特异性蛋白质，这种差异蛋白质与供试柑桔种类和症状严重度无关，也不存在于类似黄龙病症状的生理性病株中（陈肇春和李德葆,1987）。因此，可凭借特异性蛋白的有无加以诊断。贡柑的黄龙病病株果实同工酶缺少Rf=0.24的主酶带，可能是贡柑感染黄龙病早期检测的生化指标(吉前华等,2007)。4.4.7PCR检测1991年Weisburg等首次成功扩增并测定了柑桔黄龙病菌的16SrDNA（16SribosomalDNAs,16SrDNA）序列，DNA杂交和PCR方法检测柑桔黄龙病菌的分子生物学技术得以迅速发展。由于PCR检测具有灵敏、快速、便捷等特点，已成为柑桔黄龙病菌检测的主流技术。黄龙病亚洲种分布最广，我国至今尚未有黄龙病非洲种或美洲种的报道，所以检测的靶标是黄龙病亚洲种，其PCR引物也就以黄龙病亚洲种细菌的已知序列为模板加以设计，主要是16SrDNA和操纵子序列。因检测的要求不同，研究者建立了一系列的PCR检测方法，如常规PCR、巢式（或半巢式）PCR、多重PCR、以及能对黄龙病病菌进行定量的Q-PCR（竞争性定量PCR）和实时荧光PCR（Real-timeFluorescentPCR）等。对于症状典型的黄龙病病株，用常规PCR就能加以检测。因其对设备和技术要求不高，一般的分子生物学实验室都可开展，应用也最为普遍（田亚南等,2000;孔维文等,2000;贺红,2005;孟幼青等,2006a,2006b;孟祥春等,2006,2007;刘柏玲等,2006;廖祥六等,2007;王红等,2007;Dengetal.,2007）。由于黄龙病菌在柑桔病株中含量低、分布不均匀，以及柑桔中含有大量的PCR抑制物，导致常规PCR的检测灵敏度不高而出现漏检现象。甚至在同样的反应体系下，因所用PCR引物的差异，其检测灵敏度也有很大差别，有的可达近千倍。因此，按照不同目的选择合适的检测引物非常重要，特别是当待测样品中的黄龙病菌浓度极低时，应选择高灵敏度的小片段特异性引物（丁芳等,2007）。巢式（或半巢式）PCR检测灵敏度比常规PCR有明显的提高(邓晓玲等,1996,1998;丁芳等,2004;Dingetal.,2005)，能检出单头叶蝉和尚未显症植株中的黄龙病菌（李韬和柯冲,2002;Hungetal.,2004）。当然，通过提高引物的特异性和优化的PCR反应体系，也有采用常规PCR技术检测已带病但尚未显症的柑桔黄龙病病株的报道（(邓晓玲等,1999）。柑桔经常受黄龙病菌、柑桔裂皮类病毒（Citrusexocortisviroid，CEVd）、柑桔衰退病病毒（Citrustristezavirus，CTV）等2种或3种病原的复合侵染（吴如健和柯冲,2000），利用多重(RT-)PCR技术进行检测可大大提高检测速度（邹敏等,2005;丁芳等,2006）。由于PCR反应的特殊性，多重PCR反应要优先考虑退火温度高的引物，其所需浓度要大于相应退火温度低的引物（肖远辉等,2006）。Q-PCR技术检测柑桔黄龙病菌国内报道不多。在系列试管中，已知浓度的竞争物和等量病原DNA在同一试管内进行PCR，彼此竞争PCR引物和其他反应底物。结果竞争物和病原DNA的PCR产物比值与竞争物初始浓度呈反向线性相关。当竞争物初始浓度已知时，通过反向线性相关曲线，可以推算出每一试管中相对病原DNA浓度，结果表明虫媒柑桔木虱含量最高，长春花次之，而柑桔最少（田亚南等,1996,1998）。该法操作相对复杂，已被实时荧光PCR方法所取代。实时荧光PCR技术具有快速、特异、敏感、重复性好等优点，已被广泛应用（廖晓兰等,2004;胡浩等,2006;Wangetal.,2006）。4.5柑桔黄龙病病原分化柑桔黄龙病病原是一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌。由于它尚无法人工培养，其营养需求、胞壁成分和基因组成等方面的资讯甚为缺乏，造成分类研究上的困难。柑桔黄龙病的病原属于变形菌门（Proteobacteria），α-变形菌纲（Alphaproteobacterial），根瘤菌目（Rhizobiales），根瘤菌科（Rhizobiaceae），候选的韧皮部杆菌属（Candidatusliberibacter）（Jagoueixetal.,1994）。根据病原16SrDNA和β-操纵子基因的序列特征，以及传病媒介和病原性质，柑桔黄龙病菌分为亚洲种、非洲种和美洲种（Texeiraetal.,2005）。其中，黄龙病亚洲种分布最广，危害最大。A．黄龙病亚洲种主要分布于亚洲（西起阿拉伯半岛，南亚，东南亚，东亚至日本南部岛屿），非洲大陆东南印度洋岛屿，南美洲（巴西）和北美洲（美国）以及大洋洲（巴布亚新几内亚）的广大地区。本病属耐热型，在25～35℃气温下病状明显。传病昆虫是柑桔木虱（Diaphorinacitri），病原称CandidatusLiberibacterasiaticus。B．黄龙病非洲种主要分布于非洲的撒哈拉沙漠以南地区、东南印度洋岛屿及亚洲的阿拉伯半岛等地。本病属于热敏感型,在20～25℃气温下病状明显。传病昆虫是非洲木虱（Triozaerytreae），病原称Ca.L.africanusC．黄龙病美洲种是2004年3月由巴西与法国学者发现的。它仅分布于南美洲巴西圣保罗州柑桔产区，病原被鉴定为Ca.L.americanus。传病昆虫是柑桔木虱（Diaphorinacitri），已存在于巴西地区多年。他们在该地区同时发现少数柑桔树感染亚洲种黄龙病，并有极少数两种病原混合感染的现象。图4.世界柑桔黄龙病的分布我国为黄龙病亚洲种的发源地，受其危害亦最为严重，迄今尚未有受非洲种和美洲种危害的报道。近年来，国内学者对我国柑桔黄龙病菌的分化问题进行了初步研究，总体上并没有突破黄龙病亚洲种“种”的属性，但部分已存在种内分化。廖晓兰等（2004）克隆并测定了福建厦门柑桔黄龙病菌16SrDNA基因全序列（1167bp），经同源性比较，与日本冲绳（GenBank登录号AB008366）、印度浦那（L22532）和非洲种（L22533）柑桔黄龙病菌相应序列同源性分别为99.8%、98.7%和97.3%，表明福建厦门柑桔黄龙病菌属于亚洲种。将我国柑桔主产区、泰国和法国留尼湾等8个地方的柑桔黄龙病亚洲种病原进行PCR-SSCP分析，所扩增的16SrDNA部分基因片段泳动速率一致，揭示所分析的柑桔黄龙病亚洲种病原扩增的DNA片段之间没有差异（刘利华等,2005）。扩增引起沙田柚斑驳症状的黄龙病病菌部分β-操纵子和16SrDNA基因，经序列测定与多重比对，其与亚洲柑桔黄龙病菌相应序列的同源性均为99％，无明显变异(单振菊等,2005;冯震等,2006)。分析引起文旦柚斑驳症状的黄龙病菌16SrDNA、β-操纵子以及外膜蛋白（outermembraneprotein）基因的结果也显示，文旦柚上的黄龙病菌仍为柑桔黄龙病亚洲种（Dengetal.,2008）。对来自7省区不同寄主上的黄龙病病原16SrDNA基因区PCR-RFLP-SSCP分析显示，7省区不同寄主上9个黄龙病病原菌分离物的16SrDNA无可见变异，序列测定与多重比对结果也表明在不同的地域､寄主内没有发现分子变异(丁芳等,2008)｡引起琯溪蜜油叶片斑驳的柑桔黄龙病，其病原与亚洲柑桔黄龙病病原相应序列同源率仅为94.2%，而从柑桔病树分离的病原与亚洲柑桔黄龙病病原间的序列同源性更高，均在98%以上（田亚南等,2002），说明已存在种内分化。对采集于广东、广西、贵州、福建、云南5省区的8个柑桔黄龙病样品，经序列同源性分析和聚类分析，我国南方5省区的柑桔黄龙病病原16SrDNA的序列与亚洲种（L22532）的同源性为96.9％～98.6％，与非洲种（L22533）的同源性为94.5％～97.1％，与美洲种（AY742824）的同源性为92.5％～94.2％，表明我国南方5省区柑桔黄龙病菌均属于亚洲种，但在亚洲种内部不同地区的黄龙病病原也发生了微小的变异(单振菊等,2008)。5柑桔黄龙病传播途径与病害流行5.1柑桔黄龙病传播途径黄龙病可通过嫁接传病，病接穗和病苗的传运是该病远距离传播的主要途径（赵学源,2004）。不同时期、不同组织嫁接传病的效率存在差异。5～7月份嫁接的苗木基本不发病，单芽枝段传病率最高，其次是无芽枝段，叶碎片可以传病，而枝皮的传病率很低，甚至不传病（赵学源等,1982）。随后的研究还表明，多芽枝段的传病率又比单芽枝段更高（王芝生和柯冲,1985）。除韧皮部外，柑桔木质部也可传播黄龙病病原，尽管其传病率极低，潜育期很长（吴世盘和李剑书,1986;柯冲等,1989），有时在木质部细胞（吴世盘和李剑书,1986）和髓部组织细胞还发现病原菌（林尤剑和高日霞,1990）。未获得柑桔种子传病的证据（柯冲等,1989）。柑桔黄龙病除通过嫁接传染外，还可以通过柑桔木虱（Diaphorinacitri）进行传播（华南农学院植保系植病教研组,1977），以致在病区新植的果园往往8～10年内全园果树感病毁灭。汕头地区柑农称柑桔一代为10年便由此而来。电镜观察带“毒”木虱的结果表明，木虱唾液腺细胞中可见圆形或椭圆形的类细菌体（戴月明等,1982），证实柑桔木虱传播黄龙病的虫媒性质（陈乃荣等,1981）。后续的研究还发现，细菌体在木虱体内分布较广，虫体主唾腺和消化道滤室（黄炳超等,1985）、以及唾液腺周围的脂肪体、中肠和后肠的细胞内均能观察到病原，尤以唾液腺外皮层和中肠细胞病原密度最大（许长藩等,1985），推测病原有可能在这些地方增殖（许长藩等,1988b）。木虱的口器吸取柑桔病树叶片的液汁时，病原体随食物流经消化道、体液到唾液腺。获“毒”饲育后3天的木虱唾液腺内可以找到病原体，说明3天内病原便可从成虫的口器经消化道和血腔循回到唾液腺内（许长藩等,1990）。由于黄龙病病原体能在木虱体内繁殖，所以木虱一旦茯得病原体后能终身传病，属于持久性传染的机制。病原在虫体内循回期的长短及其持续传染时间是木虱传病效率高低的重要标志。黄龙病病原在木虱成虫体内的循回期长短不一，短的为3天或少于3天，长的26～27天（许长藩等,1990）。木虱传病潜育期一般为2～8个月（陈循渊等,1986），甚至5年（许长藩等,1985）。集团或单个木虱成虫均能传病。用一年生苗木进行带菌木虱接种，每苗每次接虫20～30只或多次重接，其发病率是很低的，但用一个月苗龄（三片叶）的小苗，进行单虫接种能茯得十分高的发病率。4～5龄若虫会传病，高龄若虫携带的病原会传到成虫并终身携带病原，能间断传染多株实验苗，但不经卵传播（许长藩等,1990）。带“毒”成虫在柑桔苗上取食5小时以上会传病（许长藩等,1988b）。获毒饲育成虫和从带毒若虫羽化的成虫均能在短时间内获毒传病，说明木虱成虫在田间自然传播黄龙病病原的效率相当高（许长藩等,1990）。图5.木虱传病示意图5.2柑桔黄龙病流行与蔓延病害的蔓延与流行，取决于传染源的多寡与重复侵染频率的高低。这与侵染源密度，带菌木虱密度，木虱活动力，木虱天敌以及气象等因素有密切关系。黄龙病的传染源主要是病株，病苗木，病接穗，带菌木虱和野生寄主病株。研究表明，有传染源存在的情况下，黄龙病的流行区和柑桔木虱分布大体上是一致的（赵学源等,1979a），虫口密度与发病多少呈正相关（吴定尧,柑桔木虱在自然界的寄主植物有柑桔类和九里香(Murrayapaniculata)、黄皮(Clausenalansium)等十多种芸香科植物。在浙南和福州地区，木虱在柑桔上1年发生6～7代（谢佩华等,1989;许长藩等,1994），九里香上为9～11代（许长藩等,1994），华南地区柑桔上1年发生8～10代（戴月明等,1982），主要以成虫越冬（陈循渊和廖长青,1982），在冬季温暖地区也会以卵越冬。木虱雌成虫具有选择寄主嫩梢产卵的习性，若虫聚集新梢为害。感染黄龙病的病树梢次多而乱，会引诱大量木虱前来取食、产卵繁殖，形成大量的带菌木虱。幼年柑桔树梢次多、梢势旺，极易吸引木虱前来取食，增加了被感染的几率。所以，外来带菌木虱的侵入时空，是威胁新果园发病迟早与经济寿命长短的最重要因素，却是一个最不确定的变数。在一般情况下，果园的黄龙病发病率达到5%以上时，往往在3～5年内会迅速蔓延，造成果园被毁，经济寿命仅8～11年。此外，还可能造成邻近新植果园早期感染，产生“后种先死，先种后死”的恶性传染与流行现象。黄龙病主要集中在秋季的原因，一方面是秋季气温比较适合黄龙病亚洲种发病，另一方面可能是由于柑桔木虱在仲夏大发生，田间扩散传病，使被感染的柑桔树经过半年左右的潜育期，到秋季大发病的结果（许长藩等,1992）。6柑桔黄龙病防控技术治理黄龙病是我国柑桔产业发展中最重要的问题。在我国广泛存在黄龙病和木虱的柑桔产区，特别南方产区，在尚无理想的杀病原农药和抗病良种的情况下，治理黄龙病成为一个最需要大力探索的难题。6.1防控策略柑桔为多年生木本植物，对柑桔黄龙病目前尚无抗性品种的报道。柑桔一旦被黄龙病菌感染不仅无法治愈，而且将成为新的传染源，在田间柑桔木虱的取食传播下，使其它健树受到感染，导致黄龙病的大爆发。因此，林孔湘教授提出“隔离、消毒、防疫”的观点，对柑桔黄龙病采用健康栽培的“综合防治”措施加以防控。柑桔黄龙病是一种传染性病害，种苗和柑桔木虱是其主要的传染途径。在种苗带病和田间存在病株的情况下，如果治虫不力，田间发生木虱，就有可能引起黄龙病流行。反之，种苗无病，田间不残留病株和治虫得力，田间基本无木虱危害，或者在田间无病株和无木虱危害两项中做到其中一项，就有可能控制住黄龙病的危害。这就是实施“综合防治”计划的主要依据（许长藩等,1993）。对疫区病果园，首先进行经济与病情评估。有经济效益的、黄龙病发病率在10%以下的病园，严格挖除全部病树，同时加强化学防治木虱；发病率10%以上的病园，对有生产价值的病树采取不挖掉，只修剪病枝，争取在病园改造中增多些收入。对于非疫区新果园，按照健康栽培的观点严格实施。做到园地选择要注重“隔离”原则，果苗选择要注重“无病”原则，果园健康情况要定期检查，果园管理措施要严格执行（柯冲,2001）。6.2防控措施6.2.1强化检疫对于尚未发生柑桔黄龙病的地区，采用检疫手段防止病害的传入最为经济有效。柑桔种苗是除柑桔木虱之外传染黄龙病的另一个重要途径。大力推广种植无病苗，不仅可以保护新区不发生黄龙病，而且可以降低或消灭旧病区新果园的发病中心，减轻危害，是综合防治中的一个关键环节（林先沾等,1985）。因此，对于内检部门，应严格执行检疫制度，加强产地检疫，清理不符合实际标准的苗圃、严禁病苗或带病接穗的流通，对非疫区实行保护，防止“病从苗入”。目前柑桔商品苗木生产问题十分突出，品种混杂，带黄龙病等危险性病害率高。所以对苗木商品生产要立“法”，保证苗木按规定的操作技术繁育和保证质量。各省根据柑桔区域计划的要求，建立一个省级无病中心采穗母本园，几个市、县级无病采穗母本园和若干个注册苗圃。省级无病中心采穗母本园负责向市、县级无病采穗母本园提供建园的无病基础苗。注册苗圃必须经过省级农业主管部门审查批准，接穗由无病母本园供应，在技术部门监督下进行育苗，才能保证苗木的纯度、质量和无病（林先沾等,1986）。对于外检部门，应加强口岸检疫，防止黄龙病非洲种、美洲种及其变异株系以及相应的媒介昆虫传入我国造成新的危害。农业科研部门则需积极研制快速、灵敏、稳定的标准检测体系供检疫部门使用，密切合作，将可能的威胁拒之于国门之外。6.2.2园地选择要注重“隔离”原则。无病苗在隔离环境条件下种植和严格防止传染的措施是果园成败的关键。园地既要远离病果园，最好还有天然屏障如高山、大洋能与病果园相隔离，又要清除园地内可能携带病原及其虫媒的野生寄主。隔离条件好坏是嫁接性病害发生与否的关键。在种植无病苗的果园内，病害的发生主要是由于虫媒的侵入。所以,只有无虫媒的环境，才是绝对可靠的隔离环境，才可保证无病苗不发生病害（柯冲,2001）。6.2.3培育和推广使用无病苗木种植无病苗是综合防治措施中的一个关键环节。苗木不仅要品种对路，品质优良，还要健壮，不带黄龙病，衰退病，裂皮病和碎叶病等四种嫁接传染性病原。“隔离、消毒、防疫”的综合性措施是培育柑桔无病良种苗木缺一不可的三个重要条件。砧木的选育在福建地区，柑桔的砧木主要是福桔和枳壳，福桔砧能抗裂皮病和碎叶病，但由于无病苗本身不带裂皮病和碎叶病，又无传病虫媒，而且枳壳砧又比福桔砧耐寒，所以在福建地区，特别是寒冷的北部和东部产区，无病苗的砧木应采用枳壳最为适宜（柯冲,2001）。将选取的砧木种子经55～56℃处理50min，不仅可消灭种子内部和外部附着的病原，还可使苗木生长整齐而健壮（周友智,1984），将处理后的种子播种于隔离地带或防虫网室中供嫁接使用。因尚无获得柑桔黄龙病菌能通过种子传播的证据，如果仅从脱除黄龙病菌而言，育苗使用的砧木种子可以直接播种，不必要应用热水或其它方法的消“毒”处理（柯冲等,1989）。接穗的选择与处理从外观健康、优质、丰产的母树上采集接穗，经湿热空气（47～49℃、50min）、四环素（1000ppm、2h）、湿热空气和四环素复合或茎尖微芽嫁接方法脱“毒”处理，供嫁接使用。经上述处理的接穗嫁接在其种子经热水处理（55～56℃、50min）的砧木上育成的嫁接苗，可能获得部分无黄龙病和衰退病的苗木（林先沾和柯冲,1985,1986）。因为，四环素处理不能100％脱除黄龙病，湿热空气与四环素复合处理不能脱除衰退病和裂皮病。茎尖微芽嫁接的方法能100％脱除黄龙病（陈駉等,1987,1988;宋瑞琳等,1990,1999），对衰退病、裂皮病都有较好效果。将预热处理（40℃/30℃，昼16h/夜8h）和茎尖微芽嫁接相结合的方法脱除碎叶病毒，能获得理想效果（宋瑞琳等,1999）。经湿热空气处理的接穗，其嫁接成活率低。采用热水间歇消毒（骆学海,1983）、热四环素处理（罗志达,1991）或通过接穗留叶柄和处理时接穗倒置可显著提高成活率（周友智,1984）。通过嫁接前在接口处滴加一定浓度的激动素或玉米素（宋瑞琳等,1990），或改进切口的方法，可明显提高嫁接成活率（姜玲等,1995）。随后的研究还发现，利用50℃湿热空气、相对湿度95％处理苗木60min，促使其抽出新梢，再利用新梢茎尖进行微芽嫁接，既能脱毒又可明显提高嫁接成活率（谭祖国等,1996）。最近的研究表明，采用玻璃化冷冻法（vitrification-cryopreservation）可以高效脱除柑桔黄龙病菌，其脱除率可达98.1％以上（Dingetal.,2008）。无病苗木的培育与鉴定对于柑桔黄龙病的老病区，在无法获得完全地理隔离条件育苗的情况下，也可采用防虫网棚培育柑桔无病苗，该方法已在广西推广(叶伟其等,2005)，有些主产区还建起了自己的无病苗圃(莫健生等,2007)。通过上述方法育成的苗木，还需经生物学测定、血清学测定和电镜检查的鉴定证明是可靠无病的，方可作为无病基础苗，用于建立无病母本园，再从无病母本树采穗繁育无病苗，供新区种植。四环素1000ppm、2h处理直接育成的无病苗，可作为二级苗在老区推广（林先沾和柯冲,1985,1986）。6.2.4果园健康情况要定期检查，建立检查制度。尽管通过使用盐酸四环素或青霉素G高压注射柑桔病树有一定的治疗效果，病树的病状会产生暂时的消失，但1～2年后又重新表现和加剧，不能根治（柯冲和王芝生,1988）。因此，对于田间病树要及时挖除，以免成为新的传染源。在快速检测技术尚未在田间应用之前，在每年病株表现最明显的10～12月间，检查果园，依据斑驳病状进行诊断，及时处理重病、放弃、失管果园以及病树（柯冲,1996）。由于黄龙病的病树既是传染源，又是木虱茯得病原体的主要场所，所以果园一旦发现黄龙病，挖病树和治木虱两项重要措施必需密切结合进行。病树先喷药，后挖除，防止木虱迁移传染。缺株不宜补种，以防发生“后种先死，先种后死”的恶性传染（但可考虑种植其他果树）（柯冲,1979b）。6.2.5控制柑桔木虱是柑桔黄龙病综合防治最重要的技术措施。利用寄生蜂防治木虱，在非洲法属留尼旺岛（Reunion）取得很好的结果（夏雨华1988）。木虱的寄生蜂主要为姬小蜂（Tamarixiaradiata,营外寄生）和跳小蜂(Diaphorencyrtusaligarhensis,营内寄生)，但是在我国福建等地，由于木虱有多种重寄生蜂危害，应用寄生蜂防治木虱的效果不大。柑桔木虱寄生菌在田间的发生不普遍，在自然界没有抑制木虱繁殖的能力。谢佩华等（1988）从柑桔木虱的多种寄生菌中，分离出致病性较强的蜡蚧头孢菌（CephalosphoriumlecaniiZimm）。室内测验结果显示，该菌在相对湿度90～98％条件下，致病率可高达98％以上。在室外笼养试验，蜡蚧头孢菌只有在阴雨季节，相对湿度90％以上时，对木虱成虫、若虫的致病率可达80～100％，但在晴天干旱的条件下则不发病。采用目测与黄板检测，监测木虱的种群变动，指导和加强化学防治。每次新梢在新叶始见时喷药一次，10天后再喷一次，冬季清园要喷药1～2次。防治其他害虫时，要兼治木虱。因柑桔木虱成虫的高效传病性、近距离扩散性、终生带毒性和快速传病性，决定了用来防治柑桔木虱成虫的农药要求速效性好、防效高（邓明学和石晓雨,2007）。治虫要求在生态区内实行联防，统一喷药计划。由于获“毒”饲育成虫和从带毒若虫羽化的成虫均能在短时间内获毒传病，说明木虱成虫在田间自然传播黄龙病病原的效率相当高。而且卵及若虫比成虫更为群聚，更易于防治，因此治虫防病的重点应放在防治木虱的卵和若虫上（许长藩等,1990）。最近，有采用烟雾机防治柑桔木虱取得成功的报道（钱开胜,2007）。由于我国柑桔栽培区冬季气温转暖，木虱种群变大，其地理分布明显北移（周启明等,1989），发生范围进一步扩大（林云彪和王映雪,1998;孟幼青等,2005），多数年份能在新的寄生地完成世代发育（王洪祥等,2001）。因此，对柑桔黄龙病的防控提出了更为严峻的挑战。6.2.6加强果园管理在切实做好防止病害蔓延的前提下，加强果园管理。创造柑桔生长的优良农业生态环境，并综合而巧妙地对各项措施加以运用，可以做到新果园不发生或少发生黄龙病、老果园黄龙病发生率逐年下降的效果（柯冲,1996）。实践证明，上述六项措施的综合运用，是目前防治柑桔黄龙病最有效而又切实可行的办法（吴如健等,1994;许长藩等,1998a），只有这样才能控制病害的蔓延，达到保持果园健康和延长果园经济寿命，把柑桔黄龙病的危害减少到最低限度。7结尾语从林孔湘教授证明柑桔黄龙病的传染性以来，我国对柑桔黄龙病的研究已愈半个多世纪，虽然通过综合防治技术措施能够限制病害的传播和蔓延，但在尚无理想的杀病原农药和抗病良种的情况下，治理黄龙病仍是一个最需要大力探索的难题。这也是我们研究柑桔黄龙病的出发点和归宿。鉴于柑桔黄龙病菌的难培养特性，在以常规方式进行药剂筛选及防治研究已显得举步维艰的情形下，借助现代分子生物学技术，探讨柑桔树体和黄龙病菌的互作机制，揭示黄龙病菌的致病机理，通过导入外源基因、培育和筛选抗病品种等方法，将有助于柑桔黄龙病问题的最终解决。主要参考文献Bové,JM.Invitedreview,huanglongbing:adestructive,newly-emerging,century-olddiseaseofcitrus.JournalofPlantPathology,2006,88(1),7-37.DengX,ChenJ,FengZ,ShanZ,GuoH,ZhuJ,LiH,CiveroloEL.IdentificationandCharacterizationoftheHuanglongbingBacteriuminPummelofromMultipleLocationsinGuangdong,P.R.China.PlantDisease,2008,92(1).DengX,ZhouG,LiH,ChenJ,CiveroloEL.DetectionofCandidatusLiberibacterasiaticusfromwampee(ClausenalansiumSkeels)bynestedPCR.Online.PlantHealthProgress,2007,doi:10.1094/PHP-2007-0419-01-BR.DingF,JinS,HongN,ZhongY,CaoQ,YiG,WangG.Vitrification–cryopreservation,anefficientmethodforeliminatingCandidatusLiberobacterasiaticus,thecitrusHuanglongbingpathogen,frominvitroadultshoottips.PlantCellReports,2008,27(2).DingF,WangG,YiG,ZhongY,ZengJ,ZhouB.Infectionofwampeeandlemonbythecitrushuanglongbingpathogen(candidatusliberibacterasiaticus)inchina.JournalofPlantPathology,2005,87(3),207-212.GarnettH.M.Isolationofthegreeningorganism.CitrusandSubtropicalFruitJournal,1985,611.HalbertSE.ThediscoveryofhuanglongbinginFlorida.Proceedingsof2ndinternationalcitruscankerandhuanglongbingresearchworkshop,FloridaCitrusMutual,Orlando,2005,H-3.HungTH,HungSC,ChenCN,HsuMH,SuHJ.Detecti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