各种液相色谱检测器介绍 液相色谱操作规程

第第页各种液相色谱检测器介绍液相色谱操作规程紫外吸取检测器ultravioletabsorptiondetector紫外吸取检测器ultravioletabsorptiondetector简称紫外检测器（UV），是基于溶质分紫外吸取检测器ultravioletabsorptiondetector

紫外吸取检测器ultravioletabsorptiondetector简称紫外检测器（UV），是基于溶质分子吸取紫外光的原理设计的检测器。由于大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外吸取性质，所以该检测器是液相色谱中应用广泛的检测器，几乎全部液相色谱仪都配置了这种检测器。它不仅有较好的选择性和较高的灵敏度，而且对环境温度、流动相构成变化和流速波动不太敏感，因此既可用于等度洗脱，也可用于梯度洗脱。其检测灵敏度在mg/L至mg/L范围。

可见光检测器visiblelightdetector

可见光检测器visiblelightdetector又称分光光度检测器，是基于溶质分子吸取可见光的原理设计的检测器。能够直接接受可见光检测的溶质不是很多，而且多数灵敏度也不高，但接受具有高摩尔吸光系数的有机试剂（配位体和螯合剂）作为衍生化试剂进行柱前或柱后衍生操作的衍生化光度检测法是相当有用的，特别是在金属离子搭配物液相色谱中的应用是相当成功的。

低压梯度low—pressuregradient

低压梯度low—pressuregradient又称外梯度，是在低压状态下完成流动相强度调整的梯度装置。只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。由于比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合之后再增压输送到色谱柱的。

蒸发光散射检测器克服常见的HPLC检测难题

虽然阵法光散射检测器（EvaportivelightScattering,ELSD）已经开发生产15年，但是对于很多色谱工来说，它仍是一个新产品。第一台ELSD是由澳大利亚的UnionCarbide讨论试验室的科学家研制开发的，并在八十时代初转化为商品，八十时代以激光为光源的第二代ELSD面世。此后，通过不断设计提高了ELSD的操作性能。现在ELSD越来越多的作为通用型检测器]用于高效液相色谱，超临界色谱（SFC）和逆流色谱中。ELSD最大的优越性在于能检测不含发色团的化合物，如：碳水化合物、脂类、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性剂、药物，并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物。

ELSD的通用检测方法除去了常见于传统HPLC检测方法中的难点，不同于紫外和荧光检测器，ELSD的响应不倚靠与样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。ELSD

的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。示差检测器（RI）也可以说是一种通用型检测器，打它灵敏度低，并与梯度脱洗不相容。质谱是另一种通用型检测器，但它的昂贵操作费用和多而杂性限制了它的应用。

ELSD的独特检测方法，对于它的多种用途和高性能至为关键。ELSD检测只要分为三个步骤：（1）用惰性气体雾化脱洗液（2）流动相在加热管（漂移管）中蒸发（3）样品颗粒散射光后得到检测。

讨论:

UV检测的紧要缺点在于紫外不吸取的化合物灵敏度很低。ELSD可以检测任何挥发性低于流动相的样品。ELSD的通用性响应值使得ELSD响应值比UV响应值更能代表样品的质量

不同于紫外检测只能使用不吸取紫外的流动相，ELSD能与任何的挥发性流动相相容，不论其光学特性。您可依据样品的溶解度或分别特性选择流动相，例如选择氯仿和丙酮用于脂类的分别以提高样品的溶解性。用紫外检测器定量未知物是困难的，由于样品的紫外吸取值往往和代表样品的质量的色谱峰的大小无关。ELSD对几乎全部的样品给出一致的响应因子。因此可以通过和内标比较定量未知化合物，此特性对于使用组合化合技术而合成的系列化合物的定量尤其有用。用组合合成技术合成的化合物通常是用HPLC联合低波长紫外或质谱检测进行分析，但是，在缺乏已表面活性剂特别灵敏，并在梯度脱洗下维知结构参数已知的参照标准品情况下，两种方法都不能精准的定量分析此种系列化合物。

荧光检测

荧光检测的紧要缺点在于只有少数化合物产生荧光。大多数的分子不发荧光，但含有可衍生的官能团用于合成能发荧光的衍生物，例如，邻苯二甲醛是一种常用荧光基团用于柱后衍生氨基酸。虽然荧光检测很灵敏，但对于常见的样品分析来说不需要如此高的灵敏度。由于ELSD的响应不倚靠于荧光基团，所以不需要衍生，因此大大降低了样品预处理和分析时间。

示差检测：

虽然示差检测在原理上是通用型检测器，但是它的灵敏度低，和梯度脱洗不相容，因此它对于HPLC来说不是理想的检测器。室温的变化会影响基线的稳定性，大的溶剂前沿峰可能会掩盖前期脱洗的色谱峰。由于ELSD在检测前将流动相蒸发，所以基线的噪声和漂移都很小，因此基线稳定和样品检测的灵敏度高。流动相的蒸发使得ELSD和梯度脱洗相容，因而可提高色谱分别的辨别率和缩短分别时间。另外ELSD比RI检测蔗糖灵敏度高和基线稳定。

应用实例：

近年来，脂类在生物学和经济领域中的紧要性正在日益引起广泛的关注。脂类的分析方法对于很多讨论工作，临床使用和质量掌控方面都特别紧要。大多数的脂类分子都缺乏适当的发色团，因此脂类除非通过衍生化，否则不能用紫外检测。一般但一样品种含有的各种脂类其极性差异很大，弱项要达到个作分的较佳分别和辨别率需要使用梯度脱洗，因而限制了示差检测器的使用。不同于UV和RI的局限性，ELSD是脂类检测的有用工具。

碳水化合物不带有发色团，因而不能用UV来检测。他们通常用氨基柱或者阳离子交换树脂分别。但是示差检测器不是很灵敏，而且需要掌控温度来维持基线稳定，不能与梯度脱洗相容。ELSD灵敏度高，基线稳定，与梯度脱洗相容。

随着高聚物和表面活性剂在很多行业中的广泛应用，简单和牢靠的分析方法的尤为紧要，他们通常是不含有发色团的复合分子。此类化合物不带有适当的发色团和分别是需要接受梯度脱洗意味着不能接受示差和紫外检测器。ELSD检测高聚物和表面活性剂可以保持基线稳定。

在科研、临床和生产的工艺掌控上，药物需要分析评估。目前，随着日益增长的加速药品开发的要求，药品工需要一种开速的鉴定方法来测定带物的代谢物、杂质、降解物和各种天然产物，很多不含有适当的发色团，限制了紫外检测器的使用。示差比紫外检测器的灵敏度要低，且不能与梯度脱洗相容，而多而杂的药品分析常需要梯度脱洗。ELSD的通用检测本领和梯度相容性使得ELSD是药物分析的理想工具。由于ELSD的响应接近于代表产品的质量，所以即使在降解产物和杂质的性质不明确的情况下ELSD的使用为药物杂质分析供应较快速的方法。

结论：蒸发光散射检测器正日益成为分析碳氢化合物、表面活性剂、聚合物、脂肪酸和氨基酸、油和其他难检样品的强大工具，多用途的ELSD能检测任何挥发相低于流动相的样品，克服了常见于示差和紫外检测器的缺点。

紫外—可见光（UV—VIS）检测器

原理：基于Lambert—Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸取，且吸取强度与组分浓度成正比。

很多有机分子都具紫外或可见光吸取基团，有较强的紫外或可见光吸取本领，因此UV—VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV—VIS对环境温度、流速、流动相构成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。一般的液相色谱仪都配置有UV—VIS检测器。

用UV—VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸取的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸取稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸取的流动相。

二极管阵列检测器（diode—arraydetector,DAD）：以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV—VIS检测器（图8—15）。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与一般UV—VIS检测器不同的是，一般UV—VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV—VIS检测器是先让全部波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使全部波长的光在接受器上被检

直接紫外检测：所使用的流动相为在检测波长下无紫外吸取的溶剂，检测器直接测定被测组分的紫外吸取强度。多数情况下接受直接紫外检测。

间接紫外检测：使用具有紫外吸取的溶液作流动相，间接检测无紫外吸取的组分。在离子色谱中使用较多，如以具有紫外吸取的邻苯二甲酸氢钾溶液作阴离子分别的流动相，当无紫外吸取的无机阴离子被洗脱到流动相中时，会使流动相的紫外吸取减小。

柱后衍生化光度检测：对于那些可以与显色剂反应生成有色搭配物的组分（过渡金属离子、氨基酸等），可以在组分从色谱柱中洗脱出来之后与合适的显色剂反应，在可见光区检测生成的有色搭配物

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色谱是一种分别分析手段，分别是核心，因此担负分别作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等，色谱柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到较佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构及装填技术。1、高效液相色谱柱的保养色谱柱在使用前，可以进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是依照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是较佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。我们在对色谱柱使用前进行测试以后，我们要依据不同的情况对色谱柱进行保养：①反相色谱柱每天试验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，试验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应当在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。②长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必需存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度可以是室温.2、高效液相色谱柱的维护我们在使用新的色谱柱应当在我们本身的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。而且在使用的过程中常常有堵塞的现象，造成这种现象的紧要原因是①溶剂中的不溶物；②样品中的不溶物；③泵进样器等中的不溶物；④柱内不溶物的形成等。假如当色谱柱堵塞以后我们可以对色谱柱进行修复，首先，使用含盐缓冲液后（如离子对试剂）应用溶解性强的溶剂（如水）进行冲洗。其次，先断开检测器，然后用对来自样品中的物质有强溶解性的溶剂进行冲洗，对于反相色谱柱，可使用甲醇、乙睛、四氢呋喃、氯仿、庚烷等，在此条件下，应避开溶剂的pH低于2或高于8、最后假如经过上述还是没有修复，色谱柱压力还是没有下降，则要断开检测器，将色谱柱反方向放置，然后检查柱压，若压力稳定下降，则保持色谱柱反方向连接，用低于0.5ml/min流速冲洗一小时。假如压力不下降，则要看内置过滤器是否被堵塞，假如被堵塞应冲洗或更换，若进口端的填料发生堵塞，柱子将不可能被彻底恢复，只能通过去掉进口端的部分填料，重新填充进行有限的柱效恢复。而且修复的厚度是2—5mm