T-TPPA 0004-2022 DPPH 法评价中药注射剂体外抗氧化活性操作规程

ICS

11.120.01CCS

团 体 标 准T/TPPA

DPPH

法评价中药注射剂体外抗氧化活性操作规程Operating

procedure

for

injection

vitro

by

DPPH

method2022-12-22

发布 2022-12-22

实施T/TPPA

0004-2022前 言.............................................................................I1

范围............................................................................... 12

规范性引用文件..................................................................... 13

术语和定义......................................................................... 14

检测原理

........................................................................... 15

材料与设备......................................................................... 25.1

........................................................................... 25.2

........................................................................... 26

实验方法

........................................................................... 26.1

溶液配制....................................................................... 26.2

实验步骤....................................................................... 37

数据处理及判定..................................................................... 47.1

吸光度变化量的计算

............................................................. 47.2

IC50的计算

..................................................................... 47.3

的计算

..................................................................... 47.4

精密度的计算................................................................... 57.5

体外抗氧化活性的评价........................................................... 5天津市医药行业协会

发布T/TPPA

0004-2022 本文件按照GB/T

1.1-2020《标准化工作导则

第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由天津天士力之骄药业有限公司提出。本文件由天津市医药行业协会归口。性评价企业重点实验室、创新中药关键技术国家重点实验室、

现代中医药海河实验室、河南天地药业股份有限公司、天津红日药业股份有限公司。T/TPPA

0004-2022

1范围本文件规定了DPPH法评价中药注射剂体外抗氧化活性的要求。本文件适用于具有自由基清除能力的中药注射剂体外抗氧化活性的评价。2 规范性引用文件文件。GB/T

33087 仪器分析用高纯水规格及试验方法《中华人民共和国药典》20203 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1抗氧化

antioxidant基氧化的反应。3.2半抑制浓度

half

inhibitory

，IC50阳性对照或供试品的加入使反应溶液较相同浓度的2,2-联苯基-1-苦基肼基（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）控制溶液吸光度下降0.500时，对应的反应溶液中阳性对照或供试品的浓度。3.3相对抗氧化活性

relative

antioxidant

activity，RAA单位浓度供试品溶液使DPPH控制溶液吸光度下降与单位浓度阳性对照溶液使DPPH控制溶液吸光度下降的比值。4 检测原理T/TPPA

0004-2022DPPH是一种较为稳定的、以氮为中心的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在附近有强吸收。当DPPH乙醇溶液光吸收减弱。DPPH乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈线性关系，由此可评价供试品清除自由基的能力，即用IC50评价抗氧化活性的大小，L-的抗氧化活性。5 材料与设备5.1 材料5.1.1

耗材a）96孔微孔板（透明平底聚苯乙烯微孔板，带盖板，孔容积360µL）。b）按扣盖聚丙烯微量离心管（、5.1.2

试剂试药a）乙醇和DPPH均为分析纯。b）L-抗坏血酸为标准物质。c）水为GB/T

33087

规定的仪器分析用高纯水。5.2 设备电子分析天平、酶标分析仪、漩涡混合器、暗箱。6 实验方法6.1溶液配制6.1.1

DPPH溶液的配制取DPPH适量，精密称定，加乙醇适量，混合均匀，即得。临用现配，遮光保存。6.1.2

DPPH控制溶液的配制精密量取DPPH溶液适量（体积同V1），加入乙醇适量（体积同V2）稀释制成目标浓度（浓度可以参考为每1mL含DPPH

60µg）混合均匀，即得，临用现配。6.1.3

阳性对照系列浓度溶液的配制精密称取L-低不少于5含L-抗坏血酸20µg、µg、12.5µg、10µg和5µg临用现配。6.1.4

阳性对照系列浓度本底溶液的配制T/TPPA

0004-2022V2入乙醇（体积同V1），混合均匀，置于暗箱反应，即得，临用现配。6.1.5

阳性对照系列浓度反应溶液的配制V2入DPPH溶液（体积同V1），混合均匀，置于暗箱反应，即得。6.1.6

供试品系列浓度溶液的配制精密称取或量取供试品适量，加高纯水，分别制成一系列供试品溶液（至少配制由高到低不少于5个不同浓度水平，其浓度水平之比可以参考为1.50:1.25:1.00:0.75:0.506.1.7

供试品系列浓度本底溶液的配制V2乙醇（体积同V1），混合均匀，置于暗箱反应，即得。6.1.8

供试品系列浓度反应溶液的配制V2DPPH溶液（体积同V1），混合均匀，置于暗箱反应，即得。517nm品本底溶液的配制），定容至刻度后进行测定。6.2实验步骤供试品系列浓度反应溶液、DPPH控制溶液和空白溶液（乙醇）各200µL，分别加入至孔微孔板底部，盖上盖板，移入酶标分析仪，测定517nm处的吸光度。阳性对照和供试品系列浓度反应溶液的吸光度建议控制在0.10~0.80之间，且相邻浓度反应溶液的吸光度差值应较为均匀。暗箱反应时间的确定，以连续2次测定反应溶液吸光度的相对标准偏差（RSD）不超过2%DPPHDPPH一致。T/TPPA

0004-20227 数据处理及判定7.1吸光度变化量的计算∆ADPPH式：∆A=（A控制–A空白）–（A反应–A本底）……式1式中：A控制

—

DPPH控制溶液在处吸光度A空白

—

阳性对照或供试品系列空白溶液在517nm处吸光度A反应

—

阳性对照或供试品系列浓度反应溶液在517nm处吸光度A本底

—

阳性对照或供试品系列浓度本底溶液在517nm处吸光度7.2 IC50的计算7.2.1

解释变量的计算解释变量（C反应），即阳性对照或供试品系列浓度反应溶液中抗氧化活性物质的浓度。VV

……式

C反应

=

C系列

VIC50IC50

=

C系列

—

阳性对照或供试品系列浓度溶液的浓度7.2.2

模型拟合将C反应—∆A进行线性回归，或者可采用非线性模型。回归方程或非线性模型的相关系数应不低于0.98或判定系数应不低于0.96。∆A

=

a

C

+

b ……式37.2.3

IC50的计算依据式

4，计算求得

IC50

阳。……式

47.3 RAA的计算根据式

5

RAA，计算

RAA

时应使阳性对照和供试品的

50的单位统一。IC50

供

100%RAA

供IC50

供

100%

T/TPPA

0004-2022……式

5式中：IC50

阳

—

阳性对照的半抑制浓度IC50

供

—

供试品的半抑制浓度7.4 精密度的计算依据

6.1.8

项下要求制备不少于

6