动物细胞融合和单克隆抗体(1)(部编)课件

专题2细胞工程2.2.2动物细胞融合和单克隆抗体学习目标:1.了解动物细胞融合的原理、过程和意义2.举例说出单克隆抗体制备的原理和应用重点：单克隆抗体的制备过程难点：单克隆抗体的制备过程2002年12月30日，

两场筹备了10年的“太空婚礼”首次在神舟四号飞船上举行，植物细胞“新人”—黄花烟草和革新一号烟草叶肉细胞原生质体，动物细胞“新人”是小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，两批新人同时在“产房”—电融合仪内孕育新生命。“太空婚礼”这两场“太空婚礼”实质是哪两项细胞工程技术？植物体细胞杂交技术动物细胞融合技术实例1：自然条件受精作用一.动物细胞融合1970年人工条件下的人-鼠细胞融合实验实例2：人工诱导１、动物细胞融合过程（P52资料卡）思考：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？3、原理：1、动物细胞融合的基本原理是什么？2、动物细胞融合的诱导方式是什么？与植物细胞融合的诱导方式有什么不同？与植物原生质体融合的基本原理相同，即细胞膜的流动性。4、诱导方式：物理法：电激、振动、离心化学法：聚乙二醇（PEG）生物法：灭活的病毒例如：仙台病毒2、概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。5、过程：动物细胞A动物细胞B诱导，融合2个完整的杂交细胞AB有丝分裂（膜融合、细胞融合的实质质融合、核融合）单核细胞筛选灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成杂交细胞（细胞膜具有一定的流动性）注意：动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞6、意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。7、应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡、人—胡萝卜等重要用途：制备单克隆抗体。问题讨论１、植物体细胞杂交最终得到的是完整的植物个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？

不能，只能得到杂交细胞2、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？相同，都是细胞膜的流动性3、为什么要用灭活的病毒？病毒一般对生物体是有伤害的。仙台病毒丧失感染活性保留融合活性物理或化学方法主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振动、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物、动物细胞融合的比较1.概念：2.结果：杂交细胞3.原理：细胞膜的流动性5.意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体6.应用：4.诱导方法：物理法;化学法和生物法活动1：请同学们快速阅读课本P52总结

动物细胞融合也称________。是指_________动物细胞结合成一个细胞的过程。形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的

____细胞，称为________。两个多个或单核细胞杂交

8、动物细胞的筛选方式：1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本A：色氨酸缺陷型亲本B：苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。二、单克隆抗体的制备1.图中是哪种免疫类型是？２.抗体由何种细胞产生？３.抗体主要分布在哪里？４.传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？温故知新浆细胞主要在血清体液免疫

反复注射浆细胞

抗原

动物体内抗体产量低、纯度低,特异性差,反应不够灵敏活动２:阅读P５３找一找：科学家发现B淋巴细胞有什么特点？并讨论：怎样才能获得大量的单一抗体？体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖问题１：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的问题２：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和无限增殖能力同时具备科学家发现：１.体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上２.每个B细胞只分泌一种特异性的抗体单克隆抗体克隆一个B淋巴细胞

细胞群抗体遗憾：癌细胞动物细胞融合一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖杂交细胞动物细胞培养１.实验设想：动物细胞融合单克隆抗体既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体1975年，米尔斯坦和柯勒1984年，诺贝尔生理学或医学奖杂交瘤细胞考考你！1.在制备单克隆抗体的过程中，选用哪两种细胞进行融合？为什么选择这两种细胞？浆细胞和骨髓瘤细胞浆细胞能产生单一抗体，但不能无限增殖；骨髓瘤细胞能无限增殖，但不能产生单一抗体。（经过免疫的）B淋巴细胞注射特定抗原蛋白骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞在具有筛选作用的培养基上培养专一抗体检验阳性克隆上述杂交细胞分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞单克隆抗体注射到小鼠体内体外培养2、单克隆抗体的制备过程:第2次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。特异性强，灵敏度高瘤-瘤细胞B-瘤细胞B-B细胞动物细胞融合第1次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。动物细胞培养杂交细胞灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞经免疫的小鼠提取杂交瘤细胞第一次筛选用特定的选择性培养基第二次筛选能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体单克隆抗体制备过程单克隆抗体的制备

看书上53页图，分组讨论，单抗制备过程分哪几步？请用箭头把以下代表单克隆抗体制备过程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来。顺序是？

检特别提醒：1.1.杂交瘤细胞的特点①B淋巴细胞的特点:有产生单一抗体的能力，但不能大量增殖②骨髓瘤细胞的特点：能在体外大量增殖，但不能产生抗体③杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体。2.筛选的目的：第1次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）第2次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。3.技术手段：动物细胞融合、动物细胞培养4.培养杂交瘤细胞的方式：体外培养；注射到小鼠腹腔内增殖5.单克隆抗体的特点：特异性强，灵敏度高，可大量制备。学科网已成功的动物细胞融合实例有很多，如鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—鸡、人—蛙等上百种融合细胞。甚至已成功完成了酵母菌—鸡、人—胡萝卜等细胞的融合。想了解更多信息，可通过网络、电视、杂志等途径关注动物细胞融合和单克隆抗体的最新信息。生物种间杂交想像图第一步：从一只小鼠体内提取T淋巴细胞，然后与骨髓瘤细胞诱导融合。第二步：再用普通培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死去。第三步：对上述经选择性培养的杂交瘤细胞直接在体外条件下做大规模培养，这样从细胞培养液中就可以提出破伤风杆菌单克隆抗体。已注入过灭活破伤风杆菌的小鼠B淋巴细胞选择培养基必须经过克隆化培养和专一抗体检验阳性1.下面是某同学根据单克隆抗体技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。指出不足之处。小结三、检验[变式练习]２.如图为细胞融合的简略过程，请据图回答：⑴若A、B是植物细胞，在细胞融合之前用

处理，除去了

；A、B到细胞C的过程中，常用的化学方法是用

诱导．

⑵若A、B是植物细胞，则形成的D细胞还要应用

技术把D培养成植株。⑶若A、B是动物细胞，一般用

，使其分散开来，A、B到C的过程中，常用的不同于植物细胞的诱导因素是

，所形成的D称为

。⑷若该过程是制备单克隆抗体，A为B淋巴细胞，在获得此细胞之前，小鼠已被注射了

。在A、B到C的过程中，所形成的C有

种，用来培养的D细胞应该是

。纤维素酶和果胶酶细胞壁聚乙二醇植物组织培养胰蛋白酶或胶原蛋白酶灭活的病毒杂交细胞特定抗原３杂交瘤细胞小结B体外培养骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群注射到小鼠腹腔AC

[自我评论]

3、下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的实验方案。2、该方案能达到预期效果吗？为什么？3、图中B为________

过程，特有的诱导方法_________。该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。1、该实验方案的目的是

４、C过程指细胞培养此细胞的分裂方式

_______。制备单克隆抗体动物细胞融合灭活的病毒双亲细胞产生专一抗体迅速大量增殖不能没有将抗原注小鼠体内,无法获得产生单一抗体的B淋巴细胞有丝分裂小结四、单克隆抗体的应用１.作为诊断试剂：有准确，高效，快速的优点２.可用于治疗疾病３.可用于运载药物（作为运载对应疾病的药物的“生物导弹“。）“生物导弹”＝单克隆抗体＋药物单抗导向药物为弹头结合同位素的单抗-----生物导弹单抗放射性同位素课堂小结动物细胞融合动物细胞A动物细胞B动物细胞_____________法诱导培养物理化学生物杂交细胞（单核）膜融合质融合单克隆抗体筛选二杂交细胞等杂交瘤细胞体外或体内培养筛选一骨髓瘤细胞

诱导融合分泌特异抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞群提取已免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术单克隆抗体的制备既能迅速大量繁殖又能产生专一抗体特异性强灵敏度高可大量制备课堂注射抗原1、(2006，广雅中学考题)研究单克隆抗体治疗癌症的思路是（）A．利用单克隆抗体特异性地对抗癌细胞B．以单克隆抗体作抗癌药物杀死癌细胞C．抗癌物质在克隆细胞中大量合成D．单克隆抗体携带抗癌药物特异性地与癌细胞结合2.根据下图，回答相关问题(1)若A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则B细胞是取自小鼠体内的

细胞，从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射_____________类物质。（2）d过程是一个_____________过程，该过程的进行常用_____________或_____________的诱导。(3)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成

种类型的C细胞，因此需用__________培养基筛选出D细胞用于培养，D细胞的名称是

，其特点是_________________________________________。浆

抗原

动物细胞融合

聚乙二醇灭活的病毒

选择3既能迅速大量增殖又能产生专一抗体

杂交瘤细胞(4)在培养时通过________分裂方式大量繁殖。D细胞体外培养需要注意的条件是（要求答5项）__________________________________。（5）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，其特点是_________________。特异性强、灵敏度高

有丝无菌、无毒的环境；充足的营养；适宜的温度和pH；适宜的气体环境

3、下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。（1）_______________技术是单克隆抗体技术的基础。（2）根据培养基的用途分类，图中HAT培养基属于________培养基。（3）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是________________。（4）动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采用________________。（5）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的_______________特点，又具备淋巴细胞的_______________特点。（6）淋巴细胞是由动物体_________中的______________细胞分化、发育而来。动物细胞培养选择特异性强,灵敏度高灭活的病毒迅速大量增殖分泌专一抗体骨髓造血干细胞4、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（）A、经过免疫的B淋巴细胞B、不经过免疫的T淋巴细胞C、经过免疫的T淋巴细胞D、不经过免疫的B淋巴细胞5．只能使动物细胞融合的常用诱导方法（）A．PEGB．灭活的病毒C．电刺激D．离心6、“生物导弹”是指（）A.单克隆抗体B.杂交瘤细胞C.产生特定抗体的B淋巴细胞D.在单抗上连接抗癌药物7.已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有

种融合细胞。（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。方法：

。原理：培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞加入氨基嘌呤后,使D合成的途径阻断,所以仅D合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理融合前处理用_____________和__________去除细胞壁后诱导原生质体融合用____________使细胞分散后诱导细胞融合诱导融合的方法

杂种植株（或杂交细胞）特点杂种植株含有两种生物的遗传物质杂交细胞具有意义和用途克服

不亲和的障碍，获得杂种_________

突破_________________，使__________成为可能。获得杂交细胞，用于_______归纳提升细胞膜的流动性植物细胞全能性细胞膜的流动性纤维素酶果胶酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶物理法（离心，振动，电激）化学法：PEG物理法（离心，振动，电激）化学法：PEG还有生物法：灭活的病毒远缘杂交两个或多个细胞的遗传物质远缘杂交单克隆抗体制备植株有性杂交局限25.无性繁殖和有性繁殖的主要区别是什么？26.动物细胞融合的基本原理是什么？

27.什么是病毒的灭活？有性繁殖是通过产生有性生殖细胞——配子（包括精细胞、卵细胞），配子结合后生长成新的个体。无性繁殖是不经生殖细胞结合的受精过程，由母体的一部分直接产生子代的繁殖方法。细胞膜的流动性灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。28.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合29.什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。30.抗体有什么应用价值？（1）诊断疾病：如对癌症、乙肝等疾病的诊断（2）治疗疾病：如治疗毒蛇咬伤等

（3）物质检测：如目的基因表达的检测31.怎样获得抗体？向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，从血清中分离出的抗体,称为血清抗体。特点：多种抗体的混合物，纯度差、特异性差、产量低。32.如何获得单一种类抗体？

由于每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。利用动物细胞培养技术，培养单个B淋巴细胞，就可以克隆单一B淋巴细胞，获得单一种类抗体。33.正常情况下，一个B淋巴细胞不能无限增殖形成细胞群，怎样才能克隆出单一的B淋巴细胞？设法使一种能产生特定抗体的B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。34.怎样才能获得产生特定抗体的B淋巴细胞？用某种抗原（多次）注射实验动物，使其发生特异性免疫反应，分化形成能产生特定抗体的B淋巴细胞34.从何处取得经过免疫的B淋巴细胞？35.可以采用什么方法诱导动物细胞融合？36.把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起融合时，有几种融合方式？离心、振动、电激；聚乙二醇；灭活的病毒

从免疫动物的脾脏获取。B-B融合细胞杂交瘤细胞瘤-瘤融合细胞资料：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。淋巴细胞有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。骨髓瘤细胞中只有D途径而没有S途径，但能不断分裂增殖。在培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞，就是杂交瘤细胞。这种培养基被称为“HAT”选择培养基。37.如何筛选杂交瘤细胞？38.杂交瘤细胞有什么特点？既能大量繁殖，又能产生专一抗体。39.筛选出的杂交瘤细胞产生的是同一种抗体吗？否，由于与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞有许多种，因此从这些种杂交瘤细胞中提取抗体的仍然是多种抗体的混合物。

抗原

抗原针对同种抗原的多种抗体40.怎样从众多杂交瘤细胞中筛选到能产生我们需要的产生特异性抗体的杂交瘤细胞？通常采用有限稀释克隆细胞的方法获得单细胞克隆，再利用抗原抗体杂交法检测，筛选出分泌产生所需特异抗体的杂交细胞株，然后进行扩大培养。41.如何得到大量的单一抗体？42.如何培养杂交瘤细胞？培养特异的杂交瘤细胞，从中提取出单一抗体，即单克隆抗体。体外培养或体内培养43.单克隆抗体的概念由单个杂交瘤细胞进行无性繁殖,也就是通过克隆，形成细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。44.单抗隆抗体的特点①特异性强、灵敏度高②可以大量制备45.单抗隆抗体有何应用价值？①作为诊断试剂具有准确、高效、简易、快速的优点，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。

。②定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病③用于治疗疾病和运载药物

制成生物导弹，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。46.动物细胞融合与植物体细胞杂交过程有何不同47.诱导动物细胞融合与植物原生质体融合的原理和方法是否基本相同?植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。诱导动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同——细胞膜的流动性，方法也基本类似，不同的是除物理法、化学法外，还用到生物方法，即灭活的病毒。例：1975年Kohler和Milstein的单克隆抗体技术在生产和使用抗体方面开创了新纪元，图10示单克隆抗体制备流程阶段示意图。请据图回答下列问题：（1）该技术是在动物细胞培养技术和

技术的基础上发展起来的。（2）图10中细胞A体外培养不具有分裂能力，但能分泌

，细胞B体外培养能够

。（3）动物细胞融合常用的方法是

。图10动物细胞融合分泌特异性抗体无限增殖PEG（灭活的病毒、电激）图10（4）细胞融合是随机的过程，在HAT培养基中培养，要筛选出

细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，常向培养液中加入

(激素)（5）培养2周后，即测定培养细胞的特征，筛选出

细胞置于不同孔内（如图所示）培养。此操作前要将培养细胞稀释到7～10个细胞/ml，每孔滴入0.1ml细胞稀释液，其目的是

。（6）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞进行

培养。保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保证抗体的纯度）体外或体内杂交瘤胰岛素特异性分泌抗X蛋白抗体的1.人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，且疾苗生产和抗体制备的流程之一如下图：提取③②病毒RNADNAA基因A基因表达载体受体细胞A蛋白小鼠皮下小鼠骨髓瘤细胞效应B淋巴细胞X抗A蛋白的单克隆抗体①请回答：（1）过程①代表的是

。（2）过程②构建A基因表达载体时，必须使用

和

两种工具酶。DNA连接酶逆转录限制性核酸内切酶③②病毒RNADNAA基因A基因表达载体受体细胞A蛋白小鼠皮下小鼠骨髓瘤细胞效应B淋巴细胞X抗A蛋白的单克隆抗体①（3）过程③采用的实验技术是

，获得的X是

。（4）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的

所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可以疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行_________比较；或用图中的_______进行特异性结合检测。抗A蛋白的单克隆抗体细胞融合杂交瘤细胞A蛋白核酸（基因）序列该RNA病毒表面的A蛋白为主要的抗原，故而可选用通过基因工程生产的A蛋白制备疫苗；确诊时为判断该病毒是否为题目中的RNA病毒，可以进行核酸序列的比对；也可以利用单克隆抗体具备特异性，利用抗A蛋白的特异性单克隆抗体通过能否特异性结合判断病毒表面是否有A蛋白的存在进一步进行检测是否为目的RNA病毒。⑴写出ａ、ｂ所指的细胞工程各称：ａ

ｂ

。⑵实施细胞工程ａ时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是：。⑶多莉面部的毛色是

，判断依据是：。⑷继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功