基因治疗课件

基因治疗Genetherapy基因治疗的发展简史时间发生事件研究者1944DNA是转化物质Avery1953DNA双螺旋结构模型WatsonandCrick1963遗传密码的破译Brenner1979重组体DNA技术、基因转染MulliganandBerg1980临床地贫研究Cline1990第一个临床试验（ADA)基因BlaséandAnderson1992大量癌症临床试验美国等1993中国制定第一部基因治疗质控要点中国1997至今重组病毒的产业化及其技术改进美国

准备期（1980-1989）“禁锢时代”，存在争议。89年，FDA才同意基因治疗先将载体导入体内的实验，90年才批准正式的临床试验。FrenchAnderson与SteveRosenberg、MichaelBlease等对基因治疗的问世起了重要的历史作用。基因治疗的发展简史

FrenchAnderson于90年9月应用腺苷脱氨酶基因ADA，经反转录病毒载体导入病人AshanthiDesilva的自身T淋巴细胞，经扩增后输回其体内，从而获得成功。患儿5年后体内10%造血细胞呈ADA基因阳性，除了还需应用部分ADA蛋白外，其他体征正常。2007年，患者各项体征正常，而且已经上大学。狂热期（1990-1995）

在这短短数年，有100多个临床方案，经FDA批准进入临床试验。从专业刊物到一般媒体，给人的印象是基因治疗即将成为临床治疗的一种成熟的治疗方法。但是，其中一些没有成熟到可以取得临床疗效的方案也过早地进入了临床试验。JesseGelsinger理性期（1996年至今）OrnithineTranscarbamylaseDeficiency(OTCD)鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷/1989-2010

基因治疗临床试验数量基因治疗的现状CountryGeneTherapyClinicalTrials

Number%Australia281.7Austria20.1Belgium241.5Canada221.3China191.2CzechRepublic10.1Denmark20.1Egypt10.1Finland40.2France412.6Germany795Israel90.5Italy181.1Japan181.2Mexico10.1Netherlands261.5NewZealand20.1Norway40.3Poland60.4Russia10.1Singapore20.1SouthKorea130.9Spain110.4Sweden70.3Switzerland473.1Taiwan10.1UK19312.1USA103462.9Multi-country130.9Total1472

基因治疗临床试验的疾病分布基因治疗临床试验的基因类型分布基因治疗临床试验所用的载体基因治疗临床试验阶段分布/wiki/Gene_therapyGenetherapyistheuseofDNAasapharmaceuticalagenttotreatdisease.ItderivesitsnamefromtheideathatDNAcanbeusedtosupplementoraltergeneswithinanindividual'scellsasatherapytotreatdisease.狭义概念将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。第一节基因治疗的概念及其策略

一、基因治疗（Genetherapy）概念广义概念将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。1.分子缺陷清楚2.可以得到相应基因的克隆3.病理生理机制已知4.有利的风险-利益比5.治疗基因可以被调控6.合适的靶细胞7.有效安全8.相关法规健全基因治疗的必备条件：（1）基因矫正（genecorrection）对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能；

（2）基因置换（genereplacement）用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；

（3）基因增补（geneaugmentation）将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能，但致病基因未去除；（4）基因表达调节（modulation）

指将特定的反义核酸、RNA干扰或核酶等技术抑制目的基因表达从而消除致病基因的作用。第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略针对致病基因而言第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略（1）自杀基因这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。

（2）免疫基因治疗将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。（3）耐药基因治疗在肿瘤化疗过程中，把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。（4）More……针对非致病基因而言第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略Germlinegenetherapy

Inthecaseofgermlinegenetherapy,Germcells,i.e.,spermoreggs,aremodifiedbytheintroductionoffunctionalgenes,whichareintegratedintotheirgenomes.Therefore,thechangeduetotherapywouldbeheritableandwouldbepassedontolatergenerations.Thisnewapproach,theoretically,shouldbehighlyeffectiveincounteractinggeneticdisordersandhereditarydiseases.However,manyjurisdictionsprohibitthisforapplicationinhumanbeings,atleastforthepresent,foravarietyoftechnicalandethicalreasons.Somaticgenetherapy

Inthecaseofsomaticgenetherapy,thetherapeuticgenesaretransferredintothesomaticcellsofapatient.Anymodificationsandeffectswillberestrictedtotheindividualpatientonly,andwillnotbeinheritedbythepatient'soffspringorlatergenerations.根据靶细胞的类型分类：

1、生殖细胞（germcell)基因治疗

2、体细胞（somaticcell)基因治疗第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略(1)生殖细胞基因治疗：生殖细胞基因治疗(germcellgenetherapy)是将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞、早期胚胎中）使其发育成正常个体。由于有着床前诊断技术，生殖细胞基因治疗已无必要。第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略(2)体细胞基因治疗：体细胞基因治疗(somaticcellgenetherapy)是指将正常基因转移到体细胞，或整合到染色体上，或独立于染色体外，使之表达基因产物，以达到治疗目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用，同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性。对特定座位基因转移，目前还有很大困难。第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略

第二节基因治疗的基本程序第二节基因治疗的基本程序

基因治疗的途径根据基因转移的途径分类：

1、ExVivo(回体转移或称二步法）将人体细胞从体内取出,基因改造,再移植到人体中。2、InVivo(活体直接转移或称一步法）直接将基因转移到人体中,如DNA注射,口服,喷雾等。有如普通治疗药物,商业化发展方向所在。第二节基因治疗的基本程序

基因治疗的exvivo

途径家族性高胆固醇血症是由于肝细胞表面低密度脂蛋白（LDL）受体缺乏所致。取出一小部分肝脏，打碎体外培养，用反转录病毒携带的LDL受体基因转染培养细胞，将整合有LDL受体基因的肝细胞通过门静脉输回肝脏。基因治疗就向打针和吃药一样.

基因治疗的invivo途径在大多数基因治疗临床试验中，来自患者血液或骨髓的细胞在实验室中培养。这些细胞被暴露在带有目的基因的病毒中。病毒进入细胞后，目的基因就成为宿主细胞DNA的一部分。这些细胞在实验室培养后，通过静脉注射重新回到患者体内。这类基因治疗被称为exvivo，就是"体外"的意思。基因是被运送到患者细胞中，但这些细胞存在于患者体外。在其他研究中，载体被用于将目标基因运送到患者体内的细胞中。这种基因治疗被称为“体内，invivo"。基因治疗的途径第二节基因治疗的基本程序

第二节基因治疗的基本程序1.目的基因的选择和获取2.目的基因与转运载体结合3.靶细胞的确认4.载体携带外源基因进入细胞5.外源基因的整合6.外源基因的表达及检测7.治疗作用及稳定性、安全性评价第二节基因治疗的基本程序

在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的特定基因。如对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。治疗性基因获得的方法很多：用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。第二节基因治疗的基本程序

一、目的基因基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒载体、疱疹病毒载体等非病毒载体：裸露DNA、脂质体、分子耦联载体、染色体载体、多聚物、纳米载体等。

：与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。第二节基因治疗的基本程序

二、转运载体第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运Safety:deletionofapartoftheviralgenomecriticalforviralreplication.Suchaviruscanefficientlyinfectcellsbut,oncetheinfectionhastakenplace,requiresahelpervirustoprovidethemissingproteinsforproductionofnewvirions.Lowtoxicity:Theviralvectorshouldhaveaminimaleffectonthephysiologyofthecellitinfects.Stability:Somevirusesaregeneticallyunstableandcanrapidlyrearrangetheirgenomes.Celltypespecificity:Mostviralvectorsareengineeredtoinfectaswidearangeofcelltypesaspossible.Identification:Viralvectorsareoftengivencertaingenesthathelpidentifywhichcellstookuptheviralgenes.ThesegenesarecalledMarkers,acommonmarkerisantibioticresistancetoacertainantibiotic.第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（逆转录病毒载体）（1）两端各有一长末端重复序列LTR。

（2）LTR由U3、R和U5三部分组成。(1)在U3内有增强子和启动子；

(2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS)；(3)在R内还有poly(A)加尾信号。

逆转录病毒载体1、逆转录病毒载体的结构（3）病毒有三个结构基因（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的包装信号序列（ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。

(1)gag基因，编码核心蛋白及属特异性抗原；(2)pol基因，编码逆转录酶；(3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

逆转录病毒载体1、逆转录病毒载体的结构构成逆转录病毒介导的基因转移系统

——逆转录病毒载体由两部分组成：(1)保留病毒颗粒的包装信号而缺失病毒蛋白基因(2)辅助细胞株(如PA317)：它由缺陷型逆转录病毒感染构建而成RetroviralpackagingsystemLTRgagpolenvLTRGag蛋白PoL蛋白Env蛋白包装细胞系LTRLTR靶细胞目的基因标记基因LTRφLTR目的基因标记基因12345假病毒颗粒的产生并感染靶细胞逆转录病毒载体重组逆转录病毒(核酸部分只能是逆转录病毒载体)辅病毒逆转录病毒载体的特点（1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；（2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；（3）感染靶细胞后不扩散；（4）假病毒感染靶细胞的效率非常高；（5）不感染非增殖细胞。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（逆转录病毒载体）同时也存在一定的缺点:①容量小，只能容纳8kb-10kb的外源基因片段；②血清补体能使之失活；③病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度；④病毒整合到DNA后，可能引起插入突变和激活癌基因的可能；⑤宿主范围有限，只感染增殖细胞，故在应用上有一定局限性。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（逆转录病毒载体）慢病毒(HIV)载体Lentivirus优点：高效感染宿主细胞，并且其感染范围广；能逃避人体免疫系统的监视，从而防止免疫排斥缺点：引起抑癌基因的受抑和原癌基因的激活，以及对细胞的毒性和产生变种病毒第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（腺病毒载体）腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。DNAmRNA蛋白质腺病毒感染细胞的过程2、腺病毒载体特点（1）宿主范围广（2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件（3）可获得高病毒效价（4）重组体非常稳定（5）不会引起肿瘤（6）有较高的安全性（7）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用（8）不整合入染色体第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（腺病毒载体）腺病毒表达系统与慢病毒表达系统的比较病毒表达系统腺病毒表达系统慢病毒表达系统病毒基因组双链DNA病毒RNA病毒复制自主复制自主复制感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞；嗜上皮细胞感染分裂和不分裂细胞，适合难转染的原代细胞（如神经细胞）及体内实验表达方式瞬时表达长时间、稳定表达表达时间快（1-2天）慢（1-3天）表达丰度高水平表达中水平表达滴度高达1011-1012pfu/ml最高可达109-1010pfu/ml克隆容量8-40kb8kb免疫原性高免疫原性低免疫原性生物安全性不整合；有一定机率出现RCA；大多数成人有抗体整合；有一定机率出现RCL痘苗病毒载体线形双链DNA的有包膜病毒，其核心颗粒不依赖宿主细胞而独立引进转录和复制，宿主范围广泛且易于培养，容易获得高滴度的病毒颗粒。同时痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺乏并不影响其在宿主细胞的复制能力，可允许在同一或不同非必需区插入多个基因，以表达多种或一种外源蛋白。缺点：细胞毒性；病毒能被人体的补体系统灭活并降解第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运单纯疱疹病毒载体abU1b`a`c`Usca2、特点（1）滴度高（2）容量大（3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染（4）不整合，但可长期存在并可稳定表达1、结构第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运脂质体

脂质体载体是用人造双层磷脂质，包装DNA后形成的脂质体-DNA复合物。脂质体载体无毒无抗原性，目的基因与脂质体的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大，可单独或联合其他载体使用，并可通过静脉注射使目的基因进入特定部位。缺点：表达时间短，不能通过血脑屏障。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运分子耦联载体分子耦联载体由DNA、DNA结合因子和配体三部分组成。配体与特异的受体结合，经受体介导的细胞内吞途径，将目的基因转移至细胞内。缺点：DNA易被降解，降低了基因转移效率；靶向性不高第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运多聚物载体是利用带正电荷的多聚阳离子与带负电荷的DNA相结合，形成稳定的多聚复合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可与细胞表面带负电荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。多聚物载体聚合物聚乙烯亚氨(PEI)

：PEI分子量的增加，其对细胞的转染效率和细胞毒性同时增加；聚乙二醇(PEG)：降低PEI的毒性；聚D，L22，42二氨基丁酸(PDBA)

：一种新型多聚物基因载体第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运裸露质粒DNA将裸露质粒DNA直接注入肌肉，外源基因在肌肉中的表达量与注入的外源基因含量成正比，与溶液体积无关。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运染色体载体一些参与哺乳动物基因表达和复制的染色体成分如转座子、基因隔离子、增强子、基因座控制区、核骨架结合区以及基质结合区等在转基因实验中，均被用来设计载体，并整合入基因组而发挥作用。转座子是一类小的DNA片段，可以在染色体不同的区域移动并携带遗传信息；转座子的整合位点具有可预测性，从而提高转基因治疗的安全性。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运细胞转导肽介导基因导入系统蛋白质之所以能够进入细胞，就是因为在它们的结构中含有能够携带生物大分子进入细胞的多肽-细胞转导肽。如果将这个多肽结构和目的基因结合，它就能将目的基因带入靶细胞。细胞转导肽的表达效率高，但价格昂贵，稳定性差，在一定程度上限制了它的应用。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（其他新型载体

）2.纳米微生物技术基因治疗载体纳米微生物具有许多优点：1)纳米脂质体主要由磷脂以及胆固醇合成，可以通过与细胞膜的融合或者胞吞作用将目的基因导入靶细胞；2)纳米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在传递过程中无毒，无免疫原性，并且可以通过新陈代谢降解，因此不会对细胞产生毒性；3)通过调节纳米材料的降解速度，还可以控制目的基因的释放速度，延长其治疗效果；4)纳米基因载体比表面积大，并可在表面偶联靶细胞的配体或抗体，实现基因治疗的主动靶向性，大大提高基因传递的特异性和加强靶细胞对目的基因的摄取。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（其他新型载体

）选择靶细胞的原则是：1）必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内；2）具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；3）易于受外源遗传物质的转化；4）在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。第二节基因治疗的基本程序

三、靶细胞的选择

干细胞

一种具有复制能力、可以形成各种组织的早期未分化细胞1.Embryonicstemcells(ES)胚胎干细胞

4~5d胚泡内细胞团（innercellmassofblastocyst）

具有自我更新和分化为任何类型组织细胞的能力（全能性）2.Pluripotentstemcells多能干细胞

5~10Wfetus(Embryonicgermcells)

外层细胞→胚胎等与发育相关组织内细胞团→人体所有器官3.Specialstemcells专能干细胞

adult(adultstemcells,AS)hematopoieticstemcell(HSC)neuralstemcell(NSC)mesenchymalstemcell(MSC)

骨髓干细胞骨髓中至少含有两种干细胞：造血干细胞Hematopoeiticstemcells（HSC）骨髓间质干细胞Bonemarrowstromalcells（MSC）

HSC一般处于静止期，必要时才进入细胞周期多能干细胞(造血干细胞,HSC)

红系祖细胞定向干细胞(造血祖细胞,HPC)巨核系祖细胞单核系祖细胞成熟的终末细胞

1）具有可移植性和自我更新能力，在体内永不耗竭，只需单次治疗；

2）具有多能性，可分化为粒、红、淋巴和血小板等各种血细胞，且在分化过程中保持基因组的相对稳定，使目的基因随细胞的分化成熟而相对扩增，病人可终身受益；

3）外源基因表达产物可通过血液循环遍布全身；

4）造血干/祖细胞的功能活性可在体内外进行分析；

5）取材于自体骨髓或脐带血，易于获取也便于植回并存活，临床已有成熟技术

骨髓中的非造血干细胞，能分化成多种中胚层来源的间质细胞（骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等）

MSC在体内可定向成骨、成软骨或成肌腱分化，可能是不同组织的微环境含有不同因子，促进MSC向不同谱系分化。

MSC体外易于分离和培养，回输体内后可定位于骨髓并通过自我更新而长期存活，因而可作为理想的靶细胞用于基因治疗（直接移植MSC可治疗骨和软骨的疾病）骨髓间质干细胞成纤维细胞是一种容易获得和在体外培养并进行遗传修饰的细胞。经修饰的细胞又容易移植回体内，必要时还可将已植入的细胞重新移走，使其介导的基因治疗终止。已有多种细胞因子基因被转移到小鼠皮肤成纤维细胞，然后再移植回小鼠。这些细胞再体内持续分泌细胞因子，使小鼠对肿瘤的免疫功能明显增强。成纤维细胞遗传修饰后的成纤维细胞也可移植入脑内，以治疗神经系统疾病国内薛京伦等以逆转录病毒为载体，将人凝血因子IXcDNA在体外转移到两例血友病患者的皮肤成纤维细胞中，用胶原基质包埋后再自体移植回体内，结果IX因子在体内持续高水平表达2年以上，使两患者的出血症状得到不同程度减轻。

骨骼肌优点：最常用的注射途径，对外源药物耐受力强；面广量大又位于体表易于操作，是表达外源基因的良好场所。肌细胞

外周血淋巴细胞（peripheralbloodlymphocyte，PBL）主要优点：

1.易于从体内取出和回输。应用IL-2尚可使PBL在体外进行培养并扩增，从而获得足够数量以适应体外操作。

2.PBL对目前常用的RV,AAV等都有一定敏感度，可被有效导入外源基因，并可耐受筛选。

3.筛选出转导成功的细胞回输体内可继续存活，应用

IL-2可使之继续生长且有功能。世界上首例遗传病的基因治疗：ADA缺乏症（SCID）淋巴细胞化学方法物理方法膜融合法病毒载体法质粒DNA直接转移法磷酸钙法DEAE－葡聚糖法电穿孔法粒子轰击法（基因枪法）第二节基因治疗的基本程序

四、载体携带外源基因进入细胞1）物理方法（1）电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。细胞细胞膜核膜通透性增加

高压脉冲

DNA渗入细胞瞬间第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核（2）显微注射法（microinjection）第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染例：转基因动物的制备

重组基因DNA

微注射（体外）

小鼠受精卵回植假妊娠

仔鼠

动物模型：转基因鼠

(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)clonesheepDolly体细胞提取核重组细胞回植Dolly卵细胞去核细胞利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。（3）微粒子轰击法第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。2）化学法第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染磷酸钙+DNA→混合微细颗粒↓沉淀反应20~30min↓

细胞在沉淀物中暴露5~24h

方法简单，但转化效率低。第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染DNADNA脂膜PEG仙苔病毒细胞融合转化细胞应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构-脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。3）脂质体法（liposome）第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染同源重组（homologusrecombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。是将外源基因定位导入细胞的染色体上。

单交换双交换4）同源重组法第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染通过同源重组定点插入珠蛋白基因

C重组后，插入外源基因片段带有——neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo

的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正常基因座位带有珠蛋白基因的质粒第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染感染细胞重组病毒5）病毒介导基因内转移是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染分子杂交与印迹技术的原理核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

印渍技术(Blotting)

首先由EdwenSouthern在1975年提出。

Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋白质的检测第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

探针技术(probe)将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

理想探针标记的特性1.高灵敏度；2.与探针的结合不能影响该分子的结构；3.与探针的结合不影响探针的主要理化性质；4.用酶促方法标记时，应该不影响酶促反应；5.标记后的检测方法具有高灵敏度和高特异性；6.具有化学稳定性、检测方便、无毒、无环境污染。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

DNA印迹技术又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将

DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着;

附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

RNA印渍技术又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析;是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

蛋白质印渍技术又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

三种印迹技术的比较第二节基因治疗的基本程序

六、外源基因的整合不整合整合随机整合定点整合第二节基因治疗的基本程序

七、有效性、稳定性和安全性评价动物模型临床试验第三节、基因治疗的现状

进行基因治疗必须具备下列条件：1)选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚；2)纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件；3)该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；4)具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。1991年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功1992年实施了TNF／肿瘤细胞和IL－2/肿瘤细胞方案，即分别将TNF、IL－2基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90%的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。我国也在1994年用导入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者对一些遗传病如血友病，地中海贫血、高雪氏病等正在探索中。第三节、基因治疗的现状

ADA-Gene+vector（逆转录病毒）重组分子患者TLyCIL-2刺激C分裂导入细胞生长分裂

10天

Gene表达

回输患儿体内

1~2月治疗一次,10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%

第三节、基因治疗的现状

一、复合免疫缺陷综合征的基因治疗

XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3-q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。例如：我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗。第三节、基因治疗的现状

二、乙型血友病逆转录病毒载体+FⅨcDNA

重组体

5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①导入仓鼠细胞（CHO）→FⅨ表达；②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞→FⅨ表达；③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。第三节、基因治疗的现状

二、乙型血友病①IL-2Gene②TNF-Gene

（白介2）

（肿瘤坏死因子）

逆转录病毒载体导入

TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内

TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞的作用。第三节、基因治疗的现状

三、黑色素瘤的基因治疗

PNAS：靶向亨廷顿氏病突变基因治疗患者2012-11-7亨廷顿氏病是一种遗传性神经退行性疾病，能导致不协调的肢体动作和认知能力下降。在最近发表在PNAS杂志上的一项研究中，西班牙研究人员成功地减少了亨廷顿氏病突变基因的染色体表达，抑制了亨廷顿氏病的发展。Nat

Med.:新基因疗法或可恢复嗅觉功能2012-9-13《自然—医学》杂志报道了一种恢复纤毛发育和嗅觉反应的基因疗法。这从原理上论证了基因疗法或可在特定遗传病中使用以恢复纤毛发育和修复感知功能。2012-2-8美国研究人员在《科学—转化医学》杂志上报告说，3名遗传性眼病患者接受基因疗法治疗后，视力显著提高且无排异反应等不良情况发生。这为利用基因疗法治疗其他视网膜病变带来了希望。这3名患者患有罕见眼疾—莱贝尔先天黑内障。这种病通常在患者年幼时发作，患者视网膜细胞的一种基因发生变异，致使视力严重下降、眼球活动异常。到二三十岁时，患者可能完全失明。宾夕法尼亚大学和费城儿童医院研究人员利用腺病毒载体将修正基因RPE65植入患者眼球内，病毒将感染视网膜患病细胞，将变异基因“重写”为正常基因。出于谨慎，研究人员最初仅为每名患者视力较差的一只眼进行了治疗，经过几年的观察确认安全性和有效性后，研究人员又利用同样方法对患者另一只眼进行了治疗。治疗后患者能辨认出人脸，而这是接受治疗前做不到的，并且患者对弱光的敏感度显著提高。/biology/Special/genetherapy/Index.shtml是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段，使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的第三节、基因治疗的现状

四、反义技术

第三节、基因治疗的现状

四、反义技术

第三节、基因治疗的现状

五、RNA干扰第三节、基因治疗的现状

六、药物靶向治疗

第四节、基因治疗的靶向性靶向性基因载体的作用原理靶向性是指在治疗过程中，把治疗作用或药物效应限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响其他正常的细胞、组织或器官的功能。靶向性载体在这里不仅仅起一个靶向作用，还要通过各自的不同作用力和DNA分子链结合形成一个相对紧密的复合物粒子，使其更容易穿过细胞膜并且免受核酸酶的降解。三个步骤：1.靶向性载体和目的基因以适当比例混合，通过静电荷力、分子间作用力等结合力结合在一起，使链状的DNA分子折叠，形成粒状的复合物。2.复合物在靶向性基团的引导下接近靶细胞，通过细胞的内吞或者吞噬作用进入细胞内部，在细胞内紧密的复合物可以保护DNA避免核酸酶的降解。3.靶向性载体和目的基因脱离，目的基因通过核膜孔或者是在细胞分裂过程中进入细胞核，修补缺失基因或者关闭异常基因，而靶向性载体则分解成小分子化合物通过细胞的新陈代谢排出细胞。第四节、基因治疗的靶向性

一、靶向性基因载体的作用原理理想的基因载体应具备以下特点：1)靶向特异性，并且不易被免疫系统识别；2)高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化；3)安全，无毒性，对人体以及环境无危害；4)有利于基因高效转移和长期表达。第四节、基因治疗的靶向性

二、靶向性基因载体的选择在携带目的基因进入靶细胞后，某些基因载体并不能马上分解，滞留在细胞内影响细胞正常的新陈代谢，甚至引起基因突变从而杀死正常细胞乃至对人体的生命安全产生危害。尤其是病毒载体，存在着较为明显的安全问题：病毒载体中可能产生有传染性、野型或辅助型病毒；可能随机整合于宿主基因组中，从而活化癌基因或抑制癌基因失活；病毒载体自身或编码的基因产物过度表达。第四节、基因治疗的靶向性

二、靶向性基因载体的选择靶向性基因载体的安全性首先是基因转移的有效性，通过靶向递送技术将目的基因尽可能多地导入靶细胞；其次是基因转录的有效性，通过使用组织特异性或疾病状态下过表达基因调控元件控制基因在靶细胞内转录；第三是基因表达时间和水平上的有效性，应用人工合成可调控表达系统来操纵基因表达，使其一方面在一定时区表达，另一方面表达水平不至于过高过低，尽可能地满足治疗需要。第四节、基因治疗的靶向性

二、靶向性基因载体的选择靶向性基因载体的有效性第五节、基因治疗应用及存在的问题

1.遗传病替补法，导入正常基因2.病毒性疾病阻断病毒基因在体内的转录和翻译3.肿瘤基因的补充和修复，