T-STIC 130021-2024 乳及乳制品中2-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖含量的测定液相色谱-串联质谱法

ICS67.050CCSX00STICDeterminationof2'-FucosyllactoseandLacto-N-neotetraoseinMilkandDairyproductsbyLiquidChromatography-Mass/MassSpectrometryIT/STIC130021—2024 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 5试剂和材料 6仪器和设备 7测定步骤 8分析结果的表述 9精密度 10检出限与定量限 附录A多反应监测（MRM）条件 5附录B2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖多反应监测（MRM）色谱图示例 6T/STIC130021—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市检验检测认证协会提出并归口。本文件由上海市检验检测认证协会发布。本文件起草单位：上海市质量监督检验技术研究院、内蒙古智慧质量中心有限公司、蒙牛乳业（沈阳）有限责任公司、内蒙古欧世蒙牛乳制品有限责任公司、雅士利国际集团有限公司、青岛海关技术中本文件主要起草人：李冰、赵玉然、刘天益、张慧萍、黄文强、钱文涛、李秋琴、吕宁、唐亚娟、李慧娟、王艳华、潘思奕、刘明、白国平。1T/STIC130021—2024乳及乳制品中2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖含量的测定液相色谱串联质谱法本文件规定了乳及乳制品中2′-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的液相色谱串联质谱测定方法。本文件适用于液体调制乳、发酵乳以及以牛乳和羊乳为原料的婴幼儿调制乳粉中2′-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的含量测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理样品经乙醇溶液沉淀提取，低温高速离心，除去脂肪蛋白，样品中的低聚糖经硼氢化钠还原成结构相同的开环结构，经高效液相色谱串联质谱仪测定，基质外标法定量。5试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的一级水。5.1试剂5.1.1乙腈（C2H3N），色谱纯。5.1.275%乙醇（C2H6O）。5.1.3甲酸铵（NH4HCO2优级纯及以上。5.1.4硼氢化钠溶液（10g/L）：优级纯硼氢化钠（NaBH4），称取1.0g硼氢化钠，加入80mL水，溶解后，用水定容至100mL，现用现配。5.1.5乙酸溶液（15mL/L）：优级纯乙酸，吸取1.5mL乙酸，用水稀释至100mL。5.1.6甲酸铵溶液（10mmoL/L）：称取0.318g甲酸铵，用水溶解并定容到500mL中，混匀。5.1.72'-岩藻糖基乳糖（C18H32O15CAS号41263-94-9，纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.1.82'-岩藻糖基乳糖标准储备液（10mg/mL准确称取100mg2'-岩藻糖基乳糖（按照实际纯度折算质量），用水溶解稀释并定容10mL。分装后置于-18℃条件可储存6个月。5.1.9乳糖-N-新四糖标准品（C26H45NO21CAS号13007-32-4，纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。2T/STIC130021—20245.1.10乳糖-N-新四糖标准储备液（10mg/mL准确称取100mg乳糖-N-新四糖（按照实际纯度折算质量），用水溶解稀释并定容10mL。分装后置于-18℃条件可储存6个月。5.1.112'-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖混合标准中间液：分别准确吸取1mL2'-岩藻糖基乳糖标准储备液和0.5mL乳糖-N-新四糖标准储备液于10mL容量瓶中，并用水定容至刻度配制成2'-岩藻糖基乳糖浓度为1mg/mL、乳糖-N-新四糖浓度为0.5mg/mL的标准物质中间液，置于-18℃条件可储存6个月。5.1.12混合标准工作液：可采用同类样品类型的空白基质溶液或水配制，2'-岩藻糖基乳糖标准工作液参考浓度1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL，乳糖-N-新四糖标准工作液参考浓度0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL。5.2材料5.2.1离心管：2mL，15mL。5.2.210mL比色管。5.2.310mL容量瓶。5.2.4微孔滤头：有机相，0.22μm。6仪器和设备6.1液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）。6.2色谱柱，ACQUITYBEHAmideColumn(150×2.1mm,1.7μm,Waters)或性能相当着。6.3移液器，量程10μL-100μL和100μL-1000μL。6.4分析天平，感量0.0001g和0.001g。6.5高速离心机，转速不低于12000r/min。6.6涡旋混合器。7测定步骤7.1提取7.1.1固体试样：准确称取20.0g（m1，精确至0.001g）固体乳粉试样,加水至100g（m2，精确至0.001g彻底溶解混匀，取5.0g（m3，精确至0.001g）至可准确定容的10mL比色管或容量瓶中，用75%乙醇定容至10mL，涡旋混匀，取1mL样品溶液至2mL离心管，进行低温离心处理。将2mL离心管中样品-20℃冷冻1h，4℃12000r/min离心15min沉淀蛋白及除脂肪，准确吸取离心管中的上层清液100μL（低浓度样品如小于30mg/100g时，可加大吸取体积）至10mL比色管或容量瓶中，用30%乙腈溶液定容至10mL，混匀，取1.5mL样品12000r/min离心5min，得样品清液备用。7.1.2液体试样：用可准确定容的10mL比色管或容量瓶称取均匀液体试样1.0g（m3，精确至0.001g加入水4mL混匀，用75%乙醇定容至10mL，涡旋混匀，取1mL样品溶液至2mL离心管，进行低温离心处理。将2mL离心管中样品-20℃冷冻1h，4℃12000r/min离心15min沉淀蛋白及除脂肪，准确吸取离心管中的上层清液200μL（低浓度样品如小于30mg/100g时，可加大吸取体积）至10mL比色管或容量瓶中，用30%乙腈溶液定容至10mL，混匀，取1.5mL样品12000r/min离心5min，得样品清液备用。7.2还原3T/STIC130021—2024取0.8mL样品清液转移至15mL离心管内，加入500μL硼氢化钠溶液，旋涡振荡混匀，室温反应30min，期间每隔5min旋涡振荡一次。缓慢加入500μL乙酸溶液，室温下放置30min，每隔5min旋涡振荡一次，不再产生气泡为止。基质标准工作液也同步取0.8mL，与样品同步进行还原，且最终定容体积相同。最终处理液经0.22μm微孔滤头过滤至进样小瓶，待测试上机。7.3工作标准曲线的制备空白基质溶液：取同类型不含2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的样品做空白基质，前处理过程同样品，得空白基质，用于标准工作液配制。标准物质工作液曲线：准确吸取适量标准中间液，用空白基质溶液制备不同浓度系列的标准工作液，混匀后同样品同步还原、上机测定后制作标准曲线。7.4液相色谱-串联质谱仪参考条件7.4.1液相色谱参考条件7.4.1.1色谱柱：ACQUITYBEHAmideColumn(150×2.1mm,1.7μm,Waters)或性能相当着。7.4.1.2流动相：流动相A为10mmol/L甲酸铵溶液，流动相B为乙腈；7.4.1.3流速0.3mL/min。7.4.1.4进样体积：5μL。7.4.1.5柱温：40℃。7.4.1.6梯度洗脱参考程序：见表1。表1酰胺色谱柱梯度洗脱程序时间(min)流动相A(%)流动相B(%)09036.560409909.5907.4.2质谱参考条件7.4.2.1离子源：ESI源。7.4.2.2离子源参数：离子传输管温度250℃。7.4.2.3喷雾电压：4.5kV。7.4.2.4监测模式：负离子监测模式。7.4.2.5扫描模式：多反应监测（MRM）。7.4.2.6实验中所用的气体均为高纯氮气。7.4.2.7多反应监测的母离子、子离子、碰撞电压、锥孔电压参见附录A。7.5液相色谱-串联质谱仪测定根据样液中待测组分的含量，选定浓度相近的基质标准溶液或者依据曲线调整样品稀释倍数，将制备好的基质标准溶液及样液等体积注入LC-MS/MS中测定。4T/STIC130021—20247.5.1定性测定按照上述条件测定试样及标准工作液，试样中待测组分的保留时间与基质标准校准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度相近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2多反应监测（MRM）监测时定量定性离子对相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度%>5020～5010～20≤10允许的相对偏差%±20±25±30±507.5.2定量测定7.5.2.1标准曲线的制作：以标准工作溶液的浓度为横坐标，以试样前后两次进样的标准系列工作溶液平均响应值（峰面积）为纵坐标，绘制标准曲线。7.5.2.2试样溶液的测定：将试样溶液按仪器参考条件进行测定，得到样品溶液中对应组分的色谱峰面积，根据标准曲线得到待测组分的浓度。2'-岩藻糖基乳糖及乳糖-N-新四糖多反应监测（MRM）色谱图参见附录B。8分析结果的表述试样中2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的含量按公式（1）计算：式中：X—试样中待测组分含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；c—由标准曲线得到的待测试样溶液中待测组分的浓度，单位为微克每毫升(μg/mLV—定容体积，单位为毫升（mL）；f—稀释因子，液体试样f为50，固体试样10-1—单位换算系数；m3—取样质量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。9精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。10检出限与定量限本方法对2'-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的检出限为3mg/100g，定