T-SPPHN 004-2024 瓜类蔬菜病毒病综合防控技术规程

ICS01.040.65CCSB15/19CodeofIntegralPreventionTechnologyoftheCucurbitsVegetableViralDiseases湖南省植物保护学会发布I本文件是根据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由湖南省植物保护学会提出。本文件由湖南省植物保护学会归口。本文件起草单位为湖南省植物保护研究所、广东省农业科学院植物保护研究所、全国农业技术推广服务中心\江苏省农业科学院植物保护研究所、沈阳农业大学、云南农业大学。本文件主要起草人：刘勇、张松柏、张德咏、史晓斌、张卓、何自福、佘小漫，汤亚飞、燕飞、李方方、刘慧、吴元华、李凡。2瓜类蔬菜病毒病综合防控技术规程本标准规定了瓜类蔬菜病毒病的术语和定义、发生流行规律、病害诊断、检测等技术要求。本标准适用于黄瓜、冬瓜、西葫芦、南瓜等瓜类蔬菜病毒病的综合防控。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4285农药安全使用标准GB8321农药合理使用准则GB16715.1瓜菜作物种子第1部分：瓜类NY/T393绿色食品农药使用准则3术语和定义GB/T35333和界定的以及下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本标准。3.1绿色防控技术Greencontroltechnology绿色防控是基于“预防为主、综合防治”的植保方针和“公共植保、绿色植保”的植保理念，以确保农业生产、农产品质量和农业生态环境安全为目标，以减少农药使用为目的，优先采取生态调控、生物防治、物理防治和科学用药等资源节约型、环境友好型技术来控制农作物病虫害的植物保护措施。3.2葫芦科蔬菜Cucurbitaceaevegetables瓜类蔬菜主要包括黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜等作物。3.3病毒病Viraldisease由植物病毒侵染引起的病害，具有寄生性、专一性或广谱性等。植物病原病毒一般活体寄生，但某些病毒亦可在发病植株残体中长期存活；病毒在植物体内进行核酸（RNA或DNA）复制,然后进行转录和外壳蛋白等翻译，组装成新病毒粒子，粒子在植物细胞间和维管束中迅速移动致使植物周身感染并发3病。4发生与流行规律瓜类蔬菜病毒病主要由小西葫芦黄花叶病毒（Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）等侵染引起。ZYMV和CMV均主要是由蚜虫传播为主。瓜类蔬菜病毒病的发生与蚜虫的发生密切相关。一般地，田间蚜虫发生早、种群量大，病毒病发生重；上一造或周边种植瓜类作物上病毒病发生重，下一造病毒病发生早且严重。在温室大棚内，常年温度较高，适合蚜虫生长繁殖，可导致瓜类蔬菜病毒病周年均有发生，且发生较重。在露地栽培的瓜类蔬菜，一般在4月初进行大田移栽、定植，由于温度较低，不适合蚜虫生长、繁殖，田间病毒病发生轻；5月底至6月初，田间开始出现病毒病植株；随着蚜虫种群不断增大、田间操作频繁，病毒病逐渐加重，并传播扩散。ZYMV和CMV也可以通过机械摩擦和种子带毒传播。田间整枝、打杈、搭架、施肥、除草、采果等农事活动，只要造成寄主微创口，即可导致病毒侵染与危害。ZYMV的寄主范围广，可侵染包括葫芦科在内的11个科植物，而CMV能够侵染包括葫芦科在内的85科365属1000多种单、双子叶植物，是分布最广和寄主最多的植物病毒之一，越冬寄主植物、病残体及带毒种子均可成为病毒病的初侵染源；田间田间管理粗放、瓜类蔬菜长势弱，病毒病发生重；此外，土壤瘠薄、黏重、板结、排水不良和偏施氮肥都会加重病情发展。5病害诊断5.1病害田间诊断瓜类蔬菜病毒病的危害症状主要为叶片花叶、黄化、泡状突起、皱缩、畸形等症状（见附录A图5.2生物学检测用于生物学检测病毒的常用鉴别寄主植物有普通烟、苋色藜、南瓜、西葫芦、黄瓜等。采用摩擦接种的方法,对疑似病毒病样进行接种检测。具体方法和检测结果见附录B图B1、图B2。5.3分子生物学检测EasyPurePlantRNAKit（北京全式金生物技术有限公司）试剂盒抽提瓜类蔬菜病叶组织的总RNA。以提取的总RNA为模板，用随机引物进行反转录，合成cDNA链，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物进行电泳，电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，通过凝胶成像仪观察结果并拍照记录。扩增片段与预期目标条带大小一致，则检测结果判定为阳性，即待检测病样中携带病毒（见附录B图B3）。6防治原则4本着“预防为主，综合防治”的指导思想，根据瓜类蔬菜病毒病和传毒媒介蚜虫的发生规律及危害特点，从保护生物多样性，优化生产环境，尽可能消灭和减少病毒来源，种植抗病优质品种，减少化学农药的使用角度开展综合防控，实现蔬菜生产安全、蔬菜生态环境安全和蔬菜产品质量安全。7防治方法7.1种苗防治7.1.1选种选用抗病、优质、适合当地栽培条件的各类符合国家种子质量的瓜类蔬菜品种。7.1.2种子消毒处理在瓜类蔬菜种子播种前，用50℃~55℃的热水浸种10～15min，随后用30℃温开水浸泡种子1～2h，搓去种子表面粘液；再用10%的磷酸三钠溶液浸种20min，捞出后用清水冲洗干净，然后催芽。7.1.3培育无病壮苗，防止苗期病虫害育苗前，彻底清除苗床枯枝残叶和杂草，施入充分腐熟的有机肥和少量无机肥，深耕土壤30cm左右，边耕边撒上生石灰和百菌清进行土壤消毒，并把土块敲碎整理成高畦，然后播种。苗床采用50目以上的银灰色防虫网进行覆盖，同时使用频振式杀虫灯诱虫、挂黄色粘虫板诱杀蚜虫和烟粉虱、蓝色粘虫板诱杀蓟马，预防苗期感染病毒病。加强育苗日常管理，及时拔除病苗、弱苗，从而培育出健康无病虫种苗。7.2农业防治7.2.1合理轮作倒茬合理轮作，实行2~3年以上轮作倒茬，有条件地区实行与水稻轮作，不要连续两年在同一块田种植瓜类蔬菜。7.2.2选种无毒种苗严格选用无病虫健康的壮苗移栽到大田。7.2.3田园卫生在定植前，结合整地，清除病残体，铲除田间及周边杂草，除去病虫中间寄主。在瓜类蔬菜生长期间，及时摘除病虫为害的叶片、果实或整株拔除，带出田外深埋或烧毁，以减少毒源和传播媒介昆虫。在进行整枝、打杈、农田除草或其他农作时，应减少对蔬菜植株的机械损伤，防止人为农事操作传播病毒病。7.2.4深耕耙耱，降低病虫基数通过深翻，可将土壤表面的蔬菜病残体、落叶埋至土壤深层使其腐烂，也可将病原及地下害虫翻至地表，破坏病原和害虫赖以生存的环境，从而降低土壤病虫基数；同时深翻还可以使土壤疏松，有利于植物根系发育，提高植物的抗逆性。57.2.5肥水管理科学肥水管理。控制化学肥料的使用，在增施腐熟有机肥的基础上，按氮、磷、钾等养分进行科学配方施肥，促进植物健壮成长，增加其对病虫害的抵抗力；叶面喷施钙肥、硅肥等微量元素或在作物的不同生育期喷施300倍光合细菌菌剂，以诱导植物对病毒病的抗性，减少化学农药的使用次数和用量，降低农药对环境的污染。科学管水，避免串灌、漫灌、减缓病虫传播蔓延。7.3物理防治7.3.1灯光诱杀采用频振式杀虫灯或太阳能杀虫灯等诱杀传毒媒介昆虫，主要是利用媒介昆虫的趋光、趋波、趋性信息素的特性。将光的波段、波的频率设定在特定的范围内，近距离用光，远距离用波，加上媒介昆虫本身产生的性信息引诱成虫扑灯，灯外配以频振高压电网，害虫触电死亡，达到诱杀成虫的目的。一般每30亩安装1盏灯，安装时灯底部距离地面1.20m，于蔬菜生长季节开始使用。7.3.2防虫网防治传毒媒介昆虫在瓜类蔬菜育苗或田间种植时，用40目以上的防虫网，可防止媒介昆虫本身对瓜类蔬菜作物的危害，同时防止其传播病毒。7.3.3色板诱杀利用蚜虫、粉虱、蓟马等成虫对黄色或蓝色有较强趋性的特性，在田间放置30cm×40cm的黄色粘虫板或蓝色粘虫板350-400块/hm2，将粘虫板呈棋盘式均匀插置田间，粘虫板底部高出植株顶端10-20cm，粘虫板满昆虫后及时更换。7.4生物防治7.4.1保护天敌保护田间有益昆虫，利用生物多样性控制传毒媒介昆虫。7.4.2田间释放天敌控制传毒媒介昆虫田间释放瓢虫、草蛉等捕食性天敌和丽蚜小蜂等寄生性天敌，防治蚜虫、蓟马、烟粉虱等传毒媒介7.5药剂防治在黄瓜、节瓜等定植后（1~3）d，将25%噻虫嗪水分散粒剂稀释至1000~1500倍，按每株50mL灌根处理，对传毒媒介蓟马和粉虱进行预防。在上述各种措施应用的前提下，田间病毒病及其传播媒介蚜虫、蓟马或粉虱等传毒媒介昆虫仍有较重的发生和危害时，及时采用药剂防治传毒媒介昆虫，以切断病毒病的传播途径。根据田间虫情，当田间有虫株率达到5%（蚜虫）或10%（蓟马、粉虱）时开始用药，选用高效、低毒、低残留、环境友好的药剂，优先采用植物源农药和生物农药,农药应交替使用，相同有效成分农药不得连续施用2次及以上。农药使用应符合国家绿色食品农药使用准则和国家农药管理条例。防治蚜虫、蓟马和粉虱等传毒媒介昆虫的常用药剂及用法见附录C。8加强病虫测报，实行统防统治采用定点系统调查和普查相结合方法，监测田间瓜类蔬菜病毒病及传毒媒介昆虫发生情况，结合气象因素，进行预测预报。当病虫害达到影响经济阀值时，当地农业主管部门应组织种植户对整片瓜类蔬菜作物病毒病及其传播媒介昆虫开展统防统治。9建立防控档案每次防治前,对田间瓜类蔬菜病毒病发生、前茬作物、防治等信息进行调查与登记，具体调查内容见附录D。附录A（资料性附录）瓜类蔬菜病毒病主要症状瓜类蔬菜病毒病症状主要为叶片花叶、黄化、泡状突起、皱缩、畸形等，见图A1。花叶泡状突起黄化皱缩图A1瓜类蔬菜感染病毒病的主要症状8（规范性附录）病毒生物学检测和分子生物学检测B.1病毒生物学检测B.1.1病毒摩擦接种方法将少许感染病毒的病叶放于消毒的研钵中，加入适量接种缓冲液，充分研磨；将金刚砂（400~500目）均匀撒到待接种的叶片表面,在营养钵内插上标签，注明处理及接种时间；左手食指和中指托住叶片，用无菌棉签蘸取少许研磨的病叶汁液，在待接种叶片上沿一个方向轻轻均匀地涂擦，一般从叶基到叶尖方向；用清水冲洗接过种的叶片，将植株放于网温室。用缓冲液接种植株作为阴性对照。B.1.2病毒分离与纯化采用上述摩擦接种方法，将汁液中病毒接种于枯斑寄主上；待寄主表现单斑后(图B1A)，将单个枯斑切下，用接种缓冲液研磨，再接种枯斑寄主；第二次出现单斑后，再次切取单个枯斑,接种于枯斑寄主；第三次出现枯斑，切取单个枯斑，接种于系统寄主，出现系统症状(图B1B)，取叶片进行检测。B.1.3病毒的保存将经过三次单斑分离和纯化的毒原，接种到系统寄主上，待其出现系统症状后，取发病叶片，采用冷冻干燥的方法处理，写明标签，置于-80℃冰箱中长期保存。B.1.4病毒致病力测定将经分离纯化的病毒分离物分别接种到寄主植物敏感品种上，测定其致病力的强弱(见图B2)。AB图B1ZYMV分离物接种枯斑寄主和系统寄主的症状A.苋色藜上枯斑；B.普通烟上系统花叶AB图B2ZYMV分离物接种南瓜和西葫芦的症状A.南瓜上泡状花叶；B.西葫芦上系统花叶B.2病毒分子生物学检测B.2.1模板RNA的制备EasyPurePlantRNAKit购自北京全式金生物技术有限公司。应用该试剂盒提取瓜类蔬菜叶片组织的总RNA，具体步骤参考试剂盒操作手册。B.2.2RT-PCR扩增（1）反转录反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，以提取的总RNA为模板，随机引物进行反转录，合成cDNA。具体反应体系及步骤如下：第一步配制反应混合液（表B1）表B1反应混合液TotalRNA1μL（50ng～5μg）OligodTPrimer（50μM）dNTPMixture(10mMeach)ddH2O7μL总体积10μL第二步：反应混合液孵育将上述反应混合液65℃孵育5min,冰上迅速冷却。第三步：配制反转录反应液（表B2）表B2反转录反应液反应混合液5×PrimeScriptIIBuffer4μLRNaseInhibitor(40U/μL)0.5μLPrimeScriptIIRTase(200U/μL)ddH2O4.5μL总体积20μL第四步：反转录反应将反转录反应液在42℃处理1h后，95℃处理3min终止反应。反转录反应液保存于-20℃。（2）反应引物ZYMV的特异性RT-PCR引物见表B3。表B3ZYMV的特异性RT-PCR引物病毒名称引物序列（5ˊ→3ˊ)片段长度ZYMVCPF1：GTACAACACACGAGCGTCTC511bp430bpCPR：AGTGTGCCGTTCAGTGTCTTCGCPF2：GATGGGAGTTGTAATGAATGG（3）反应体系ZYMV的特异性RT-PCR反应体系见表B4表B4ZYMV特异性RT-PCR反应体系试剂体积PremixExTaqVersion2.0CPF1（10μM）CPF2（10μM）CPR（10μM）cDNA(反转录反应液10倍稀释液)ddH2O总体积25（4）反应程序94℃预变性4min，之后94℃变性30sec，退火温度62℃30sec，72℃延伸45sec，28个循环，72℃延伸10min。B.2.3琼脂糖凝胶电泳取扩增产物8μL，加入到1.5%琼脂糖凝胶（100mL1.5%琼脂糖凝胶含有5µLDNAgreen）的点样孔内。电泳缓冲液1×TAE，120V，电泳30min。B.2.4检测结果判定电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，通过凝胶成像仪观察结果并拍照记录，扩增片段与预期目标条带大小一致，则结果判定为阳性，如图B.4中第1、2、3、5、6、7泳道对应的瓜类蔬菜样品中携带ZYMV；未扩增出预期大小条带，则结果判定为阴性，如图B.4第4泳道对应的瓜类蔬菜样品中不含有ZYMV；若阳性对照未扩增出预期大小片