T-JAASS 134-2024 甘薯中花青素含量的测定 液相色谱-串联质谱法

ICS67.050CCSX04JAASSDeterminationofanthocyanidinsinsweetpotato-liquidchromatography-tandemmassspecIT/JAASS134—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 5试剂与材料 6仪器与设备 27分析步骤 28结果计算 49精密度 410检出限、定量限 4附录A（资料性）6种花青素保留时间、母离子、子离子及离子对质谱参数 5附录B（资料性）6种花青素多反应监测（MRM）质量色谱图 6附录C（资料性）方法精密度 8附录D（资料性）6种花青素中英文名称和方法检出限、定量限 9T/JAASS134—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏徐淮地区徐州农业科学研究所提出。本文件由江苏省农学会归口。本文件起草单位：江苏徐淮地区徐州农业科学研究所。本文件主要起草人：王维、徐振、苏涵、张巧凤、侯会、耿晓月、董韦、赵凌霄、金夏红、曹清河。1T/JAASS134—2024甘薯中花青素含量的测定液相色谱-串联质谱法本文件规定了甘薯中矢车菊素、芍药素、天竺葵素、锦葵素、矮牵牛素、飞燕草素共6种花青素含量测定的液相色谱-串联质谱法的试剂与材料、仪器与设备、分析步骤、结果计算、精密度和检出限、定量限。本文件适用于甘薯薯块、叶片中花青素含量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T5009.1食品卫生检验方法理化部分总则GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T27404实验室质量控制规范食品理化检测3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理甘薯中花青素主要以花色苷的形式存在。试样经甲醇-水的盐酸溶液超声提取花色苷后，经沸水浴发生氯化，水解成带氯离子的花青素，用液相色谱-串联质谱法测定，以特征离子对和保留时间定性，外标法定量。5试剂与材料5.1试剂5.1.1甲酸（CH2O2，CAS号：64-18-6）：色谱纯。5.1.2甲醇（CH3OH，CAS号：67-56-1）：质谱级。5.1.3乙腈（C2H3N，CAS号：75-05-8）：质谱级。5.1.4盐酸（HCl，CAS号：7647-01-0）：优级纯。5.1.5除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水符合GB/T6682规定的一级水。5.2试剂配制5.2.1提取液：取50mL甲醇（5.1.2）、39.2mL水和10.8mL盐酸（5.1.4）混匀。5.2.210%的甲酸甲醇溶液（v/v）：取2mL甲酸（5.1.1）、18mL甲醇（5.1.2）混匀。5.2.30.5%的甲酸-水溶液（v/v）：取200mL水，加入1mL甲酸（5.1.1）。5.2.40.5%的甲酸-乙腈溶液（v/v）：取200mL乙腈（5.1.3），加入1mL甲酸（5.1.1）。5.3标准品2T/JAASS134—20245.3.1氯化天竺葵素（PelargonidinChloride）：CAS号134-04-3，纯度≥96%。5.3.2氯化矢车菊素（CyanidinChloride）：CAS号528-58-5，纯度≥96%。5.3.3氯化芍药素（PeonidinChloride）：CAS号134-01-0，纯度≥96%。5.3.4氯化锦葵素（MalvidinChloride）：CAS号643-84-5，纯度≥96%。5.3.5氯化矮牵牛素（PetunidinChloride）：CAS号1429-30-7，纯度≥96%。5.3.6氯化飞燕草素（DelphinidinChloride）：CAS号528-53-0，纯度≥96%。5.4标准溶液配制5.4.1单标储备溶液使用天平分别准确称取氯化天竺葵素、氯化矢车菊素、氯化芍药素、氯化锦葵素、氯化矮牵牛素、氯化飞燕草素标准品1mg（精确至0.01mg），用10%甲酸甲醇溶液（5.2.2）作为溶剂溶解，并定容至1mL，即为1mg/mL的单标储备液，-20℃环境条件下，贮存于密闭的棕色玻璃瓶中，保存有效期为3个月。5.4.2混合标准使用液5.4.2.1用10%的甲酸甲醇溶液（5.2.2）作为溶剂分别将单标储备液（5.4.1）浓度稀释成0.1mg/mL，放入1.5mL棕色进样瓶中，作为使用液。5.4.2.2将6种使用液混合配制，氯化矢车菊素、氯化芍药素使用液逐步稀释成0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L，氯化天竺葵素、氯化锦葵素、氯化矮牵牛素、氯化飞燕草素标品稀释成0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L，作为混合标准溶液。现配现用。5.5材料滤膜：0.22μm，有机相滤膜。6仪器与设备6.1液相色谱-三重四极杆质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ESI）。6.2分析天平：感量0.1mg。6.3高速离心机。6.4水浴锅：精度±2℃。6.5超声波清洗仪。6.6冻干机。6.7粉碎机。7分析步骤7.1试样制备甘薯薯块或叶片样品用冻干机冻干后用粉碎机进行粉碎，过250μm筛后在-20℃环境条件下保存，备用。7.2提取准确称取100mg甘薯冻干粉末放入2mL离心管，加入提取液（5.2.1）1.5mL，振荡均匀，常温超声提取10min，8000r/min常温离心3min，保留沉淀，吸取上清液转移至10mL离心管，反复提取4次，总收集液定容至6mL。7.3水解将收集的上清液于沸水浴中水解1h，取出后自来水冲淋收集上清液的离心管，使溶液冷却至室温，用0.22μm有机相滤膜过滤待测。样品制备后，在4℃避光环境条件下，保存时间不超过3d。7.4液相色谱、质谱条件设置7.4.1.1液相色谱参考条件如下3T/JAASS134—2024a)色谱柱：C18柱，50mm×2.1mm×1.8µm，或性能相当者；b)流动相：A相为0.5%的甲酸-水溶液（5.2.3B相为0.5%的甲酸-乙腈溶液（5.2.4）。梯度洗脱条件应符合表1的规定；c)流速：0.2mL/min；d)柱温：40℃;e)进样量：0.5µL。表1流动相及其梯度条件（VA+VB）VB%0212789227.4.2质谱参考条件如下a)离子源类型：电喷雾离子源（ESI）；b)扫描方式：正离子模式；c)电喷雾电压：正离子5500V；d)离子源温度：550℃;e)雾化气压力：50psi；f)辅助加热气：60psi；g)气帘气：30psi；h)碰撞气：Medium；i)检测方式：多反应监测，每种花青素分别选择两个子离子。所有需要检测的子离子按照出峰顺序，分时段分别检测。每种花青素的保留时间、母离子、子离子及离子对质谱参数，相关示例见附录A。7.4.3定性及定量7.4.3.1保留时间被测试样中目标花青素色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对偏差应在±2.5%之内。7.4.3.2离子丰度在相同实验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，目标化合物选择的子离子均出现，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的离子丰度与质量浓度相当的基质标准溶液相比，其允许偏差符合表2规定的范围，则可判断样品中存在目标花青素。表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差>50%>20%至50%>10%至20%注：本方法的标准物质LC-MS多反应监测质量色谱图相关示例见附录B。7.4.3.3定量外标法定量。7.5试样溶液的测定将标准工作溶液和试样溶液依次放入液相色谱-质谱联用仪进样盘中，根据保留时间和离子丰度比定性，测得定量用二级离子的质量色谱图峰面积，待测样液中花青素的响应值应在仪器检测的定量测定线性范围之内，超过线性范围时应根据测定浓度进行适当倍数稀释后再进行分析。4T/JAASS134—20247.6稳定性试验按以上步骤对同一批次不同试样进行平行试验测定。7.7空白试验除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。8结果计算试样中各花青素含量以质量分数计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按公式（1）计算。.................................................................（1）式中：w——试样中各花青素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；p——待测液中各花青素的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；v——定容体积，单位为毫升（mLm——试样质量，单位为克（g）；计算结果取两次独立测定的算术平均值，保留两位有效数字。9精密度9.1按GB/T6379.1、GB/T6379.2的相关规定执行。9.2在重复性条件下，获得两次独立测试结果的绝对差值不得超过重复性限（r相关示例见附录C。9.3在再现性条件下，获得两次独立测试结果的绝对差值不得超过再现性限（R相关示例见附录C。10检出限、定量限10.1.1检出限、定量限的计算方法应符合GB/T5009.1及GB/T27404的规定。10.1.2本文件方法对各种花青素的定量限为0.44mg/kg～2.14mg/kg（相关示例见附录D）。5T/JAASS134—2024（资料性）6种花青素保留时间、母离子、子离子及离子对质谱参数6种花青素的保留时间、母离子、子离子及离子对质谱参数见表A.1。表A.16种花青素保留时间、母离子、子离子及离子对质谱参数1正2正3 正4正5Chloride）正6 正6T/JAASS134—20246种花青素多反应监测（MRM）质量色谱图2.0μg/mL氯化矢车菊素、氯化芍药素标准溶液色谱图见图B.1、图B.2。图B.12.0μg/mL氯化矢车菊素标准溶液色谱图图B.22.0μg/mL氯化芍药素标准溶液色谱图0.2μg/mL氯化天竺葵素、氯化锦葵素、氯化矮牵牛素、氯化飞燕草标准溶液色谱图见图B.3、图B.4、图B.5、图B.6。图B.30.2μg/mL氯化天竺葵素标准溶液色谱图图B.40.2μg/mL氯化锦葵素标准溶液色谱图图B.50.2μg/mL氯化矮牵牛素标准溶液色谱图7T/JAASS134—