影响动物实验的主要因素

影响动物实验结果的主要因素大鼠高脂血症2%胆固醇、0.35%胆酸钠、0.3%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油Western-typefood过咸饲料采血不同部位Western-typefoodWestern-typediet0.25%wt/wtcholesterol;16%wt/wtfatahigh-fatdiet

，nocholesterol;24%wt/wtfathigh-cholesteroldiet

，2%wt/wtChow4.5%fatbyweight,0.02%cholesterolWestern-typediet21%fatbyweight;0.15%byweightcholesterol;and19.5%byweightcaseinwithoutsodiumcholate科学研究的目标——提高实验的可重复性和可靠性控制影响实验动物生物反应变异性的因素降低系统误差避免偶然误差拒绝过失误差

apoE-/-

小鼠中有野生型小鼠的污染DNA材料丢失，DNA提取试剂错误，饥饿的动物控制变异 第Ⅱ次世界大战之后十年，对动物实验的精细、复杂提出了前所未有的要求实验动物的微小变化常会影响到实验结果季节,水迷宫:头或尾，水温悉生技术主要目标：减少固有疾病对动物的影响悉生原理：使啮齿类动物摆脱常见感染性疾病的影响其他环境因素对生物反应有深远的影响动物不太可能被标准化到研究者们所期望的程度筋疲力尽，完美很难近交系,个体间血液学常数也有差异

实验动物在从受精卵到死亡过程中的每一时间点上，其生物学反应都是遗传和环境多重因素作用的结果。列举出所有可能的影响因素，以最大限度地获得实验的可重复性和可靠性Ⅱ. 物理因素动物室内的所有因素，都对动物的生物学反应发挥重要的作用。A.设施将实验室和人员活动区域隔离开来；限制清洁区和污染区的交叉感染；墙壁、地板、天花板等为一体的，以防止污染。A. 设施1. 开放系统(OpenSystem)2. 屏障系统（BarrierSystem）3. 隔离系统（IsolationSystem）1. 开放系统（OpenSystem）①普通动物特点：无人兽共患病原体、动物烈性传染病病原体和体外寄生虫.②设施及用品

开放系统：有通风（15-20次），供暖降温（19-29℃），有空气压差，无空气过滤；垫料（高压）、笼具（蒸煮）、环境定期消毒③微生物监测：必需2. 屏障系统（BarrierSystem）屏障系统分10,000级到100,000级，是指每立方英尺空气中，尘埃粒子数少于10,000到100,000。屏障系统菌落数评定标准直径9-cm琼脂培养皿，暴露30min培养48h，菌落数应少于3。温度、湿度测定气流速度测定换气次数测定送风口或出风口的风速，然后参照风口面积和房间容积计算。动物室内空气压力梯度控制正压清洁走廊>动物室>亚清洁走廊压力梯度不少于20Pa负压污染动物实验设施(P1,P2,P3,P4)屏障内环境全部控制人员、动物、饲料、饮水、空气、垫料等CL和SPF动物

清洁动物：不带有人兽共患病原、烈性传染病原及动物传染病病原体。

无特定病原体动物：机体内无特定微生物和寄生虫存在的动物，但非特定的微生物和寄生虫容许存在。国家标准（一）动物实验区布局和流向（一）动物实验区布局和流向（一）动物实验区布局和流向（一）动物实验区布局和流向实验动物设施的维护空气过滤系统的维护过滤材料在工作时会沾染粉尘，逐渐造成堵塞，而影响设施内的空气质量三级过滤材料初效：2-3个月换1次，清洗,干燥可重复用；中效：3-18个月换1次,清洗,干燥可重复用；高效：1-3年换1次，一般不重复使用。材料更换次数取决于空气使用量和周围空气的质量。勤换初、中效，可减少高效的更换，因高效会造成设施不稳定。

FirstlyfromoutbredICRterminatedformycoplasmacontaminationSecondlyfromC57BL/6JterminatedwhenchimerasdiedatweaningofdiarrheaAthird,inisolationcages.SuccessfulMicrobiologicalFactors3. 隔离系统(隔离器)正压、负压系统都有无菌动物（germfreeanimalGF）：指用现有检测技术在动物体内外的任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫的动物。来源于剖腹产或无菌卵孵化，饲养于隔离系统中。悉生动物(gnotobioticanimalGN)：或称已知菌动物，广义上把无菌动物、已知菌动物、无特定病原体动物统称悉生动物；狭义上指已知菌动物。B.动物笼具系统

(AnimalCagingSystem)1.材质Materials2.大小Size3.样式Style4.垫料Bedding5.笼具位置Cageposition6.卫生条件Sanitarycondition1.材质锌缺乏研究时BODYWEIGHTOFRAT

[1g=0.035Oz.]MINIMUMFLOORAREAcm2(in2)

MINIMUMHEIGHT

cm(in)

for1-3rats

foranadditionalratmaleupto150gfemaleupto140g

900(140)

300(47)

18(7)

male150-250g

female140-170g

1200(186)

450(70)

20(8)

male250-450g

female170-310g

1500(233)

600(93)

22(9)

male450-900g

female310-615g

1800(279)

800(124)

26(10)

maleover900g

femaleover615g

1800(279)

1000(155)

30(12)2.型号

Weightofrat(g)Floorarea/rat(cm2)aUpto100110100~200148200~300187Over300258aHeightshouldbeatleast17.8cm每笼饲养密度标准：笼具容积能满足进行正常运动或行为模式。饲养密度影响代谢单笼饲养几周后:大鼠变得易怒，攻击性强肾上腺和甲状腺增大27℃下，苯丙胺的LD50

值单笼饲养小鼠:平均78.9mg/kg每笼10只小鼠:11.6mg/kgPrinciplesforGLP,single;Wholefamily,BWWalker256可移植性肿瘤，Wistar大鼠

不锻炼对照组

锻炼组肿瘤生长显著降低大鼠进行伸展和攀爬行为左图显示低顶笼盒无法满足大鼠完全伸直动作；而右图的高顶笼盒可以。(PhotoscourtesyofDarekFiga)瓜子可作为食物来源，或利用，或贮藏。(PhotocourtesyDarekFiga)大鼠在笼盒“阁楼”中展示攀爬行为。(PhotoandcagedesigncourtesyofDarekFiga)一旦大鼠从幼年时期就习惯于把人类的手当成中立的、无威胁的环境，那他或她一生都会很容易接受这些合适的操作。悬吊式可调平板式金属网底笼Theextentofmicro-andmacro-environmentaldifferencesisinfluencedbycagedesign.

3.样式a.隔离器Isolatorb.层流架laminarairflowrackc.生物安全柜BiosafetyCabinetd.独立通风笼具IndividuallyVentilatedCages,IVC

3.样式a.Isolatorbothpositivepressure

andnegativepressuremodelsforavarietyofapplications.

b.层流架Laminarairflowrack笼盒过滤帽对控制感染非常有效鼠源性呼吸道支原体病由氨导致Murinerespiratorymycoplasmosis(MRM)CleanBenchCLASSICLASSIICALSSIIIc.生物安全柜BiosafetyCabinet超净台正压空气过滤保护受试物不受污染人员环境不清楚对健康人群是否致病E.coli生物安全柜的空气流动一级生物安全柜负压污染空气过滤器:HighEfficiencyParticulateAirfilter,HEPAfilter受试物：不保护受感染人员:被保护环境:受保护负压A型B型:B1,B2,B3HEPAfilter受试物:

不会交叉感染人员:受保护环境:受保护二级生物安全柜负压HEPA过滤器受试物:

不被交叉感染人员:受保护环境:受保护30%废气回收二级A型生物安全柜负压HEPA过滤器受试物:

不受交叉感染人员:受保护环境:受保护70%废气排出二级B1型生物安全柜负压HEPA过滤器受试物:

不受交叉感染人员:受保护环境:受保护100%废气通过硬管排出二级B2型生物安全柜负压HEPA过滤器受试物:

不受交叉感染人员:受保护环境:受保护30%废气硬管排出二级B3型生物安全柜三级生物安全柜 通过与柜体联结的橡胶手套进行操作； 柜内保持至少120Pa的负压(0.50wg)； 供气通过HEPA抽入内； 外排的气流经过双层HEPA过滤或经HEPA后再经燃烧处理。d.独立通风笼具

IndividuallyVentilatedCages,IVC 20世纪80年代，意大利Thcniplast公司，在带空气过滤帽塑料盒的盒帽上方加了一个进风口，希望促进盒内的通风换气，从而出现了第一个独立通气笼盒。

内环境完全不含微粒子IVC

由笼盒、笼盖、料斗、水瓶固定器和过滤盖组成。笼盒由耐高温（至少150-160℃以上）的透明塑料材料制成.

笼架、机箱与集中供风设备IVC配套设施

(1)IVC系统安装的房间必须符合普通环境标准。

(2)房间配有功率适当的、能调控温湿度的空调设备。

(3)设施应有换气装置和供系统使用的排气管道。

(4)配备“万级”专用超净工作台及喷雾专用喷枪。对IVC装置的评价

a.更加适宜应用于动物实验规模较小，非常年连续使用的设施，及具有生物或化学有害物质的试验。

b.对于动物实验规模较大，又基本上处于常年连续使用的单位，选用屏障系统设施更加经济，更易于保证环境条件的可靠性，稳定性。污染使用前消毒化学物质污染,系统地检测防腐剂,油漆雪松，软木，诱导肝微粒体酶醛和木质素，可能会致癌毒物和核放射性实验尽量减少动物与排泄物的直接接触4.垫料Bedding通风、温度、光强度笼盒编号笼盒标签打耳号

5.笼具位置笼标签和个体识别联合使用6.卫生条件不清洁环境可导致肝微粒体酶活性下降除臭剂笼架具、水瓶和水嘴82℃物理消毒C. 饲料和饮水1.动物饲料成分纯度2.饲料污染3.饲料形状4.饲料贮存5.饮水1. 动物饲料成分纯度 ⑴天然组分饲料

由小麦、玉米、黄豆、鱼和肉制品组成 ⑵半纯化饲料

纯化学物质和天然成分组合而成 ⑶纯化或化学纯饲料

纯化学物质，包括氨基酸和碳水化合物营养需求蛋白质 必需AA含量决定蛋白质量Arginine,Histidine,Tyrosine,Isoleucine,Leucine,Lysine,Methionine,Phenylalanine糖类必需脂肪酸矿物质维生素脂溶性维生素,水溶性维生素水⑴ 天然成分饲料不同批次之间差异大维生素、矿物质、蛋白质各成分组成详细信息不确定NIH小鼠生产群高压消毒饲料公开配方Ingredient(g/kg)AmountFishmeal90Soybeanmeal50Cornmeal20Groundwheat365Groundcorn210Groundoats100Wheatmiddlings100Brewers’driedyeast10Soybeanoil15Salt5Dicalciumphosphate15vitamin稀释于20g饲料中AtherogenicDietDietComponents5kg.10kg.DairyButter922.5g.1845g.CornOil100ml.200ml.Sucrose2500g.5000g.Cellulose(Alphacel)203.5g.407g.Casein-Vit.Free1000g.2000g.Cholesterol48g.96g.SodiumCholate(CholicAcid)25g.50g.Ain76MineralMix250g.500g.Ain76VitaminMix50g.100g.DL-Methionine15g.30g.DL-a-Tocopherol6.5g.13g.CholineChloride(0.5gr./ml.)100ml.200ml.DistilledWater+/-175ml.+/-350ml.Equipment:Microwaveovenorhotplate

Largemixer

Measuringcups

Beakers

Dehydrator⑵ 半纯化饲料满足小鼠要求的纯化饲料配方举例Ingredient(%)AIN-76(1977)Casein(commercial)20.0Casein(purified)---DL-Methionine0.3Cornstarch15.0Sucrose50.0Glucose---5.0Fat5.0Cellulose(Alphacel)3.5MineralMix1.0VitaminMix0.2⑶纯化或化学纯饲料2. 饲料污染物有毒化合物杀虫剂，抗生素，铅毒性研究病原微生物3. 饲料颗粒形状颗粒饲料常见，方便日常使用粉料半湿或凝胶状粉料组分和50%(v/v)水，加1%琼脂方便加入受试物或其它添加剂,浪费少,适口性强液体饲料低抗原饲料4. 饲料贮存如温度、湿度、压力、辐射,Barrierfacilities饲料消毒方法FoodSterilizationMethods热消毒80℃快热烘干消毒，用于普通动物高压蒸汽消毒,CLandSPFGNGF维生素和蛋白营养水平降低放射消毒,用于SPFGNGF动物60Co辐照消毒γ射线消毒饲料的选择依据研究目标免疫学，无抗原饲料；研究龋齿，高糖饲料重金属，致癌性研究天然成分饲料经济，动物爱吃局限：成分含量不可控，改变困难，Ca的含量纯化饲料昂贵：短期使用，各成分含量精确骨质疏松研究5.饮用水质量（1）高压蒸汽灭菌法

能耗高,效率低、水瓶结碱、不能去除化学污染（2）反渗透净化法反渗透净化法是利用反渗透＋过滤＋紫外线杀菌的原理，将自来水中的离子和微生物去除的净水方法。能够去除微生物污染和化学污染、生产效率高、成本低，但除菌效果不易确实，同时还导致水中矿物质元素的缺乏。（3）超滤净化法超滤净化法是利用孔径≤0.2μm的中空纤维将原水中的杂质和微生物滤除。去除微生物污染、效率高、成本低，但除菌效果很难确定。（4）化学消毒法化学消毒法针对反渗透和超滤净化法除菌效果不确实的问题，可通过在出水末端加装酸化（盐酸）或碱化（次氯酸钠）装置使出水的pH达到2.3～2.5（过酸可对动物的增重、饮食和网状细胞的清除率带来不利影响）或8.7左右（碱化水对动物有无毒性作用尚需要研究），以确保净水器的净化效果。pH2.5～3.0or8.7D.运输体重饲料和饮水恢复期间隔运输箱E.环境1.温度和湿度适宜范围DefinedRanges

温度19~29℃.相对湿度30%-70%环尾病‘Ringtail’condition通常认为与高温低湿有关2. 通风：10-15次每小时供应新风、稀释污染物、控制送排风应急电源3. 光照对许多生理特点有深远影响鸡;家兔每24-hr内光照时间,明-暗循环

最常使用12:12到14:10hours.最佳光照强度300lux:离地面1.0m的位置4. 噪音人耳160db,造成耳机械性损伤140db,耳痛长时间100db，内耳紊乱孕豚鼠动物室不超过85db5.空气压力梯度

不少于20Pa

Ⅲ. 化学因素A.气体污染物B.杀虫剂C. 药物D.清洁剂和除臭剂E.化学消毒剂A. 气态污染物贮存的化学试剂有机溶剂,丙酮，氯仿醚肾中毒二氧化碳和氨气是动物室主要废气人，氨浓度最高25ppm，8hr每天,5天每周鼠盒，大于25ppm普遍，过滤帽常超700ppmMRM.B. 杀虫剂引起药物代谢改变氯丹,第一个有文献记载的肝药酶可以被卤代烃类杀虫剂激活，而被有机磷酸酯类抑制C. 药物药物的毒性：诱发龋齿模型，抗生素治疗活性成分的特点溶媒给药途径和部位给药频率剂量标准剂量戊巴比妥睡眠时间：明-暗周期饲料或饮水中添加化合物限制饮食pair-feeding食粪症,引起药物多次暴露E. 化学消毒剂过氧乙酸，有效杀菌、真菌、病毒，是致癌物质和癌诱导剂消毒剂82℃可有效清除普通啮齿类病原体清洁剂、除臭剂，有芳香气味的易挥发的成分，改变肝药酶D. 清洁剂和除臭剂

国家标准分级等级种类饲养条件四级无菌动物GermfreeanimalGF隔离系统Isolationsystem四级悉生动物GnotobioticsanimalGN隔离系统Isolationsystem三级无特定病原体动物SpecificpathogenfreeanimalSPF屏障系统Barriersystem二级清洁动物CleananimalCL屏障系统Barriersystem一级普通动物ConventionalanimalCV开放系统OpensystemⅢ.微生物因素无菌动物（germfreeanimalGF）：指用现有检测技术在动物体内外的任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫的动物。来源于剖腹产或无菌卵孵化，饲养于隔离系统中。悉生动物(gnotobioticanimalGN)：或称已知菌动物，广义上把无菌动物、已知菌动物、无特定病原体动物统称悉生动物；狭义上指已知菌动物。无特定病原体动物（specificpathogenfree，SPF）:主要指不携带潜在感染、条件致病和对实验干扰大的病原。来源于剖腹产动物。清洁动物（cleananimal,CL）:除普通动物应排除的病原外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原。来源于SPF动物或剖腹产动物。普通动物（conventionalanimalCV）：不携带人兽共患病病原和动物烈性传染病病原的实验动物。

微生物等级动物的选择： 一般而言，普通动物用于研究所获得的实验结果的反应性差，故主要用于生物医学示教或为某项研究进行探索方法的预试验。 清洁动物是目前国内科研工作主要要求的标准实验动物，适用于大多数科研实验。 无特定病原体动物是理想的健康动物，用它来研究，可排除疾病或病原的干扰，适用于所有科研实验、生物制品生产及检定，是国际公认的标准实验动物。涉及具有国际交流意义的重大课题，最好选用无特定病原体动物。

在精确试验中，鉴于动物体内外的寄生虫与微生物会干扰试验的结果，最好选择无菌动物或悉生动物，至少也应使用SPF级动物。 此外，还应考虑所选用的动物类别或级别要与实验条件、实验技术、方法及试剂等相匹配。 避免高、精、尖仪器、技术、试剂与低品质、低反应性、非标准化动物匹配；防止低性能方法、设施与高级别、高反应性动物匹配，造成不必要的资源浪费。

CV动物反应性差，主要用于生物医学示教或预试验。CL动物国际上认为仅适合短期或部分科研实验；我国认为适用于大多数科研实验，可用于生物医学研究的各领域。SPF动物适用于所有科研实验，是目前国际标准级别的实验动物。GN或GF动物，用于特定精确实验。各种动物国家标准分级物种分级小鼠、大鼠CL、SPF、GF地鼠、豚鼠、兔CV、CL、SPF、GF犬、猴CV、SPF支原体（Mycoplasma）主要有肺支原体、溶神经支原体和关节炎支原体。易感动物为大鼠和小鼠。其中肺支原体对大、小鼠危害最大。产生大鼠“歪头病”、小鼠回旋症、大鼠关节炎。实验动物细菌对实验的干扰支气管败血性波氏杆菌（B.brochiseptica）豚鼠和家兔敏感，侵害部位为呼吸器官。对环境抵抗力较强，可在异种动物间传染，传播性强。可形成隐性感染。巴氏杆菌(Pasteurella)实验动物主要是多杀巴斯德菌和嗜肺巴斯德菌。多杀巴斯德杆菌对兔和小鼠有较强的致病作用，主要侵袭鼻粘膜。嗜肺巴氏杆菌在大、小鼠呼吸道、生殖道带菌率较高。潜在感染的病毒对实验的干扰小鼠肝炎病毒属冠状病毒科，单链RNA。对理化因子敏感。只感染小鼠，传染性高，不感染人。应激条件下，引起致死性肝炎、脑炎、肠炎改变机体各种免疫应答参数：降低血清免疫球蛋白水平；影响吞噬细胞数目。改变酶系统：增高或降低一些肝脏的酶活性。对裸鼠产生进行性消耗综合症。MouseHepatitisVirus(MHV)感染临床症狀常出现于未离乳小鼠裸鼠會出現“wastingsyndrome”,下痢.改变

Microphage的吞噬活性减缓肝脏的再生增加动物对某些病原的感受性,如Kvirus,Leukovirus

等MHVNormalFoster,HL,Small,JD,Fox,JG.1982.TheMouseinBiomedicalResearch.P.164,175,180.AcademiaPress.USA.仙台病毒属副粘病毒科，单链RNA。饲养条件恶化、气温骤变或呼吸道细菌感染，可致急性爆发。是大、小鼠常感染病毒之一，偶尔引起人呼吸道感染。影响免疫应答：抑制大鼠淋巴细胞对绵羊红细胞的抗体应答。减弱植物血凝素、刀豆素对淋巴细胞的促有丝分裂。干扰致瘤作用：感染后的组织学改变酷似浸润性肺癌；感染可移植肿瘤，改变肿瘤细胞表面抗原和致瘤性。影响生殖：妊娠4-5天感染，胚胎被吸收；11-12天感染，妊娠期延长，新生鼠死亡率升高。呼肠病毒III型

属呼肠病毒科，双链RNA。对热和消毒剂抵抗性强。宿主广泛。动物可见脂肪性下痢，表现为肝炎、脑炎、胰腺炎。小鼠巨细胞病毒

属疱疹病毒科，线状双