第十章 转基因动物技术教学课件

第十章转基因动物技术

第一节转基因动物一、概述转基因动物（transgenicanimal）是指用人工方法将外源基因导人或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。转基因动物技术是在动物整体水平研究目的基因的生物技术，其特点是“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”。

自1981年，美国的Brinster和Palmiter获得世界上第一只转基因动物—“巨鼠”以来，国内外对转基因动植物的研究方兴未艾。到目前，我国也已获得了转基因鼠、转基因鱼、转基因猪、转基因羊、转基因鸡等多种转基因动物。

6只体型较原小鼠大一倍左右大鼠生长激素基因小鼠（lit/lit）的金属硫蛋白的基因（MT）MTrGH基因显微注射法小鼠受精卵植入假孕鼠的子宫21只小鼠，7中带外源基因著名的转基因超级小鼠或巨鼠实验转基因动物的基本原理是将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植人受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基因培育优良的动物品种。

二、转基因动物的基本原理转基因技术中所用的外源基因是由顺式作用元件和结构基因组成的完整基因（即完整的转录单位）。由于哺乳类动物之间基因的同源性较高，为了检测方便，有时需引人报告基因(reportergene)或报告序列(reportersequence)。顺式作用元件主要选用有较高表达活性的强启动子（有时包括增强子),或者直接选用目的基因的天然启动子序列。

三、转基因动物的基本方法1.显微注射法（microifljection）

显微注射是目前最常用的转基因方法之一，其基本原理是用显微注射针将外源基因直接注入实验动物受精卵的原核，使外源基因整合到实验动物基因组中，从而得到转基因动物。优点是：导入基因的速度快且操作简单，对DNA大小无限制（最大已达250kb）。

转基因动物的一般实验程序克隆DNA供体母鼠酶解、分离、纯化、定量注射激素（PMS，HCG），与公鼠交配目的基因DNA片段鼠受精卵显微注射注射DNA的受精卵输卵管或子宫移卵假孕母鼠冻存的胚鼠组织取出鼠胚胎胎鼠组织制备DNA娩出幼鼠传代转基因鼠冻存幼鼠血液制备转基因鼠的DNA、蛋白质表达水平检测外源基因的整合检测确定转基因鼠幼鼠尾巴2.胚胎干细胞法（embryonicstemcells，ES细胞）胚胎干细胞是从着床前的动物胚胎中分离获得的一种多功能胚胎干细胞。由于它注射入动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合，因此，可将其作为一种载体，把外源基因导入个体，获得转基因动物。ES细胞可通过磷酸钙-DNA共沉淀法、逆转录病毒感染或电穿孔等方法转染，然后进行筛选和克隆。

将外源基因与逆转录病毒载体在体外构建成重组逆转录病毒载体，然后将其转染包装细胞，这时，既可以收获重组病毒颗粒，用于早期胚胎的转染，又可以将胚胎直接加入包装细胞培养物中共培养进行转染。转染后的胚胎可移植给假孕动物完成发育过程。

3.逆转录病毒感染法

通过DNA与精子共育法、电穿孔导入法和脂质体转染法获得吸附有外源DNA的精子，然后利用其进行受精，将外源DNA导入卵细胞中，经过胚胎的发育，获得整合有外源DNA的转基因个体。4.精子载体法5.转基因动物中外源DNA的检测染色体和基因水平Southern杂交、FISH、PCR等转录水平Northern杂交、RT-PCR等蛋白质水平Westernblot四、转基因动物的应用

①对基因组织或阶段特异表达的研究；②通过研究转入外源基因后的新表型，可以发现基因的新功能；③导入外源基因后，由于基因的随机插入，可能会导致内源基因的突变，对这些突变表型进行分析，可以发现新的基因；④可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究；⑤建立研究外源基因表达、调控的动物模型；⑥对遗传性疾病的研究；⑦建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据；⑧动物新品种的培育；⑨基因产品的制备；⑩在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。五、已建立的人类遗传病的转基因动物模型

疾病转移基因多发性家族性淀粉状蛋白神经病变突变的fransthyretin基因自毁容貌综合症突变的HGPRT基因唐氏综合症Cu/Zn-SOD酶基因老年痴呆症-淀粉状蛋白体基因成骨不全症突变的

1胶原蛋白前体基因肺气肿突变的人PiZ

1-抗凝乳蛋白酶基因原发性高血压小鼠Ren-2肾上腺素基因II型糖尿病胰岛淀粉状多肽基因镰刀型细胞贫血症人

和

a珠蛋白基因，人

2和珠蛋白基因

地中海贫血症人珠蛋白基因卡波齐肉瘤HIVtat基因第二节基因打靶基因打靶（genetargeting）是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活动内研究此基因的功能。若定向敲除某个基因，称为基因敲除（geneknockout）；若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入（geneknock-in）。目前这种技术主要在小鼠ES细胞中进行。一、基因打靶的必备条件

1.胚胎干细胞

ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团，即小鼠受精卵发育第4、5大的胚泡细胞。ES细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。ES细胞体外贴壁生长时的形态特征是：核大，胞浆少，细胞排列紧密，呈集落样生长。2.打靶载体打靶载体含有两种筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV－tk阴性筛选标志,通过正负选择，可以大大地提高外源基因在染色体特异位点的整合细胞筛选的阳性率。（1）neo阳性筛选标志：将neo基因插入用于打靶的外源DNA中。当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，neo基因也被插入到染色体，因此，发生同源重组的ES细胞能在含G418的培养基中生长。（2）HSV-tk阴性筛选标志：HSV-tk是来源于单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)基因，它编码TK，ＴＫ除可以催化脱氧胸苷

变成脱氧胸苷酸外，还可以催化一些单核苷类似物磷酸化，这些磷酸化后的核苷类似物对哺乳细胞有很强毒性。

将HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列中，当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，载体部分（含HSV-tk基因）是不能被整合到染色体中的，转化细胞能够在含G418和单核苷酸类似物ganciclovir的培养基上生长。如果细胞能在G418培养基上生长,但不能在含单核苷酸类似物的培养基上生长，说明载体部分亦重组到染色体中。二、基因敲除的基本程序

打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞将基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种同源基因片段线性质粒载体重组质粒neotkEs细胞外源基因G418GCVG418+GCV生长死亡生长载体整合三、基因打靶在医学中的应用1.基因打靶与遗传病遗传病是直接由遗传物质发生改变所造成的，如基因突变或染色体畸变等。基因打靶技术最大的优势是能修饰和改造动物基因组结构并在动物的整体水平得以表现和遗传。通过基因打靶途径建立基因缺陷型的遗传小鼠模型（基因敲除小鼠），是研究疾病的发生机制、分子基础及诊断的主要动物模型。2.基因打靶与肿瘤的研究利用基因敲除或敲入小鼠模型，可研究肿瘤相关基因在什么情况下可导致组织细胞恶性生长，从而研究肿瘤的发生、转移及转归的分子机制。3.基因打靶与生物制药国外有家制药公司利用基因打靶技术将小鼠的免疫球蛋白基因从其基因组中除掉，然后将人的免疫球蛋白基因敲入到小鼠的基因组中，这种带有人免疫球蛋白基因的小鼠可以产生人源性抗体。人源性抗体将成为治疗多种疾病的有效药物，其社会和经济价值是无法估量的。四、基因打靶的应用举例基因敲出为了研究MHCI分子的功能，有人构建了含有10kb2微球蛋白基因序列的载体，并将Neo抗性基因插入第二个内含子中，将它转移到ES细胞中与内源2微球蛋白基因发生同源重组，通过正-负筛选法得到了转基因的ES细胞，鼠内源的2微球蛋白基因的功能被破坏，在得到的转基因纯合鼠完全缺失了MHCI，但其发育与野生型无区别，由此证明，MHCI在发育过程中毫无作用，但转基因纯合鼠缺少CD8+T细胞，因此对病毒感染的抵抗力非常低，表明细胞免疫出现缺陷。基因敲入

乳腺生物反应器:动物乳房是一种高度分化的专门化腺体，合成蛋白质的能力非常强，特别是一些经过人类长期遗传改良，专门用来产奶的乳用动物品种，合成蛋白质的能力十分惊人。一头优良的乳牛，在305天的产奶期内可以生产牛奶10000kg，在高峰期每天可以产出牛奶100kg以上。动物

年产奶/kg

蛋白含量，%

年产纯蛋白量/kg

外源基因年表达量Kg花奶牛100003.131020（2g/L）奶水牛50004.321510奶山羊20003.16212(6g/L)奶绵羊5006.8347.5(15g/L)

猪8005.947.20.8(1g/L)兔510.40.50.25（10g/L）表一、动物产奶量及奶中蛋白质含量动物G0出生G1出生G2出生G3出生10Kg100Kg牛93255783278山羊51831444470绵羊51831445770

猪41526372637兔17142034——表二、建立动物乳腺生物反应器生产畜群的时间（月）表三、已建立的人类遗传病的转基因动物模型

疾病

转移基因多发性家族性淀粉状蛋白神经病变突变的fransthyretin基因自毁容貌综合症突变的HGPRT基因唐氏综合症Cu/Zn-SOD酶基因老年痴呆症-淀粉状蛋白体基因成骨不全症突变的

1胶原蛋白前体基因肺气肿突变的人PiZ

1-抗凝乳蛋白酶基因原发性高血压小鼠Ren-2肾上腺素基因II型糖尿病胰岛淀粉状多肽基因镰刀型细胞贫血症人

和

a珠蛋白基因,人

2和珠蛋白基因

地中海贫血症人珠蛋白基因卡波齐肉瘤HIVtat基因乙肝（HBV）广州空军医院全军肝病中心转基因工程研究室丙肝（HCV）HCV结构基因(2001,上海二医大)

我国政府和科学界对转基因动物的研究和应用十分重视。在国家“七五”技术攻关计划中首先设立了“动物个体表达系统研究”的课题，启动了转基因动物的研究。在农业部的“七五”生物技术重点项目中，又设立了“动物转基因技术研究”的课题。1987年，当首期"863"计划生物技术领域研究项目开始实施时，把“猪的基因工程育种”列为重要项目之一，一直坚持到20世纪末。在“九五”期间，“863"生物技术研究计划又把“动物乳腺生物反应器研究”增