发酵工程制药实验链霉菌发酵

2灰色链霉菌的活化一、试验目的一、试验目的学习制备高氏一号斜面培育基的方法以及斜面接种技术。二、试验原理二、试验原理高氏一号斜面培育基是一种合成培育基，用于培育放线菌。三、试验试剂与仪器三、试验试剂与仪器菌种：灰色链霉菌；0.01g，琼脂20g，水1000毫升，PH7.2—7.4〔配制时留意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再参加到以上培育基中；器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。四、试验环节四、试验环节高氏一号培育基的制备〔1〕按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。趁热分装于18mL×180mL8mL为宜。〔3〕分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。斜面接种无菌室内，超净工作台或试验台酒精灯火焰旁进展。左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培育基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等半晌。左手将试管菌种放下，拿起斜面培育基。在火焰旁用右手小指和手掌边沿拔下棉壁。灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。接种完毕，接种环上的余菌必需灼烧灭菌后才能放下。285～6d观测结果。试验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备一、试验目的一、试验目的学习制备摇瓶种子培育基的方法以及种子扩大培育技术。二、试验原理二、试验原理枯燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后培育,最终获得肯定数量和质量的纯种过程。其目的一方面是出于接种量的需要与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。种子扩培的一般过程是：斜面菌种→一级种子培育〔摇瓶〕→二级种子培育(种子罐)→发酵性、接种量的影响。摇瓶培育技术问世于本世纪30年月，由于其简便、有用，广泛用于微生物菌种筛选、的优化。在摇瓶培育过程中振荡的目的在于改善活细胞的氧气和养分物的供给或许是格外显著的，且各自存在一最适浓度。三、试验试剂与仪器三、试验试剂与仪器菌种：灰色链霉菌〔由试验二活化得到；20g40g5g5g3g0.25g，0.2g4g1000mL、pH7.2-7.4。器材：天平、500mL250mL三角瓶、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。四、试验环节四、试验环节摇瓶种子培育基的制备取干净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培育基30-50ml，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮纸包0.1MPa45-60min。接种将活化的菌种斜面，在无菌的条件下，注入10mL无菌水，震荡成孢子悬浮液〔孢子浓度约为8104个/m。待发酵培育基灭菌后冷却到28℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶2mL，标好记号。培育与观测28℃、200r/min24h，观测菌丝体形态及浓度。试验4 灰色链霉菌摇瓶发酵一、试验目的学习和把握摇瓶发酵培育的原理和方法。二、试验原理或者抑制结核杆菌生长的作用。N－甲基-L-葡萄糖胺构成的糖苷，其构造式如下。链霉素中链霉糖局部的醛基被复原成伯醇基后，就素的硫酸盐。277天。待斜面长满孢子后，制成悬浮液接入装有培育基的摇瓶中，于27℃下培育45～48小时待菌丝生长旺盛后，取假设干个摇瓶，合并其中的培育液将其接种于种子罐内已灭菌的培育基中，通入无菌空气搅拌，在罐温2762～63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培育基中，通入无菌空气，搅拌培育，在罐温为27℃下，发酵约7～8天。②提取精制，发酵液经酸化、过滤，除去菌丝及固体物，然后中和，通过弱酸型阳离子互直接做成水针剂。三、试验试剂与仪器三、试验试剂与仪器菌种：灰色链霉菌摇瓶种子〔由试验三获得〕160g5g〔单独灭菌MgSO40.5gNa2HPO41.6g、玉米浆25~35、FeS4和MnS4各20mg/，消泡剂0.31000m，pH7.。仪器：500m1三角烧瓶、旋转式摇床等。四、试验环节四、试验环节摇瓶发酵培育基的制备取干净三角烧瓶，250ml30ml8层纱布包扎瓶口，再加牛皮纸11520min。接种30℃时，按接种量8%~10%进展接种。培育与观测32℃、100r/min旋转式摇床培育36h~40h，发酵过程中，补加灭菌尿素以增长氮源，维pH值。五、思考题五、思考题观测菌丝形态，用试纸测发酵液的pH值，并补加灭菌尿素。试举例说明摇瓶培育技术的应用。试验5 灰色链霉菌发酵产物活性测定一、试验目的一、试验目的学习和把握抗生素抑菌性能的测定方法。二、试验原理二、试验原理效价，其最小效价单元就叫做“单位”(U)“国际单位”(IU)。通常各种抗生素的单位，是依据国家抗生素标准品测定出来的，是衡量药物有效成份的一种尺度。(活性局部)作为衡量的标准，因此，效价的凹凸是衡量抗生素养量的相对标准。以其有效局部的肯定重量〔多为1μg〕作为一个单位，如链霉素、土霉素、红霉素等均以纯1μg作为一个单位。少数抗生素则以其某一特定的盐的1μg或肯定重量作为一个单1000单位/mg798单位/mg，金霉素和四环素均以其盐1μg1单位，青霉素则以国际标准品青霉素G0.6μg1单位。抗生素的效价常承受微生物学方法测定的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法cylinderplatemetho。管碟法是依据抗生素在琼脂平板培育基中的集中渗透作用〔内径6.00.lm，外径8.00.lm，高100.lm，管内放人标准品和检品的溶液，经16~18比例〔2:1或4:1〕的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再依据抗生素浓度对数和4个小钢管，管内分别放入检品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。更能拟定抗生素的医疗价值；并且使用范围广，较纯的精制品、纯度较差的制品药物效价测定的最根本方法。三、试验试剂与仪器三、试验试剂与仪器测定用指示菌：枯草芽孢杆菌[CCMCC(B) 63 501]仪器：分光光度计、离心机、培育箱、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、牛津小杯〔不锈钢小管，内径6.00.lm，外径8.00.lm，高100.lm、培育皿等。培育基传代用培育基〔用于枯草芽孢杆菌菌传代和保藏：蛋白胨10，牛肉膏5.0g18g1000mL，pH7.2-7.5。生物测定用培育基〔培育基I〕蛋白胨5g，牛肉浸出粉3g，琼脂15~20g，磷酸氢二钾3g，蒸馏水1000mL，除琼脂外混合上述成分调整PH值使比最终的pH值略高0.2-0.4，加人琼脂加热溶化后滤过，调整pH值使灭菌后为7.8 8.0，在115℃，灭菌30分钟。试剂〔1〕标准链霉素〔标准品理论计算值为798.3u/m：0.6~1.6单位/mL〔2〕0.85%NaCl溶液〔生理盐水〕100mL。〔3〕1%pH7.85.59g0.41g，加水使溶解成1000ml，即得。四、试验环节四、试验环节1枯草芽孢杆菌菌悬液的制备将枯草芽孢杆菌接种于养分琼脂培育基斜面，在35~37℃培育7天，用革兰氏染色85%6530分钟，备用。2上层培育基的预备将已灭菌的生物测定用培育基100mL，溶化后放入50℃恒温水浴中，待温度平衡后，参加枯草芽孢杆菌菌悬液5mL，充分摇匀，备用。平板的制作5020mL，水平放置，待凝固后用大口移液管吸入上层培育基5m，将培育皿来回倾侧〔要快速均匀分布，凝固后备用，双碟不得少于4个。放置小钢管得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。放置之后，不能随便移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开头滴加抗生素溶液。滴加抗生素溶液滴加抗生素要依据SH→TH→SL→TL〔二剂量法，S代表标准品，T代表供试品，H代表高浓度，L代表低浓度〕的挨次滴加，在一双碟对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度2的剂距为2:1或4:1。液面应当与小钢管管口齐平，液面反光呈黑色〔抗生素液体参加量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量也有差异〕假设抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片留神吸去多余局部。双碟中菌株的培育14~16h。时间太短会导致抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生不均匀〔过于接近热源，会导致同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。所以把双碟放入培育箱时，要与箱壁保持肯定的距离，双碟叠放也不能超过3个。培育中，箱门不得随便启动，以免影响温度。应常常留意温度，防止意外过冷过热。抑菌圈测量试验结果中抑菌圈直径不应当过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培育基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18～2