(高清版)GBT 40225-2021 肌动蛋白抗体的检测 免疫印迹法

ICSCCS07.080A40肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40225—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。本文件起草单位：中国测试技术研究院、成都正能生物技术有限责任公司、深圳市第二人民医院、甘肃中商食品质量检验检测有限公司、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司、上海市计量测试技术研究院。1GB/T40225—2021肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法本文件描述了肌动蛋白抗体的免疫印迹检测方法。本文件适用于基于免疫印迹法原理的肌动蛋白抗体的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法注1:目前发现肌动蛋白至少存在6种异构体形式，主要分布在心肌、骨骼横纹肌和平滑肌组织中，调控细胞的收缩注2:肌动蛋白分子质量为45ku±3ku(1u≈1Da),具有高度保守性，在细胞中的表达相对稳定，因此它常被用作校正系统的内参。3.2疫球蛋白的总称。下列缩略语适用于本文件。APS:过硫酸铵(ammoniumperoxodisulphate)BCA:二喹啉甲酸(bicinchoninicacid)ECL:化学发光试剂(electrogeneratedchemiluminescence)HRP:辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)NP-40:乙基苯基聚乙二醇(NonidetP40)PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline)PBST:磷酸盐吐温缓冲液(phosphatebuffersalinewithTween)PMSF:苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride)PVDF:聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride)GB/T40225—2021SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)TBS:Tris缓冲盐溶液(tris-bufferedsaline)TBST:Tris缓冲盐吐温溶液(tris-bufferedsalinewithTween)TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)免疫印迹法，又称蛋白质印迹。其基本原理是通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳区分待测样品不同的蛋白质进行检测，通过分析特异性反应的位置和强度获得特定蛋白质在所分析的细胞或(和)组织中表达情况的信息。免疫印迹试验通常由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质的印迹和检测两个部分组成。6试剂和材料6.1硝酸纤维膜或PVDF膜。6.3HRP标记二抗抗体：HRP标记的羊抗鼠IgG或HRP标记的羊抗兔IgG。6.4NP-40裂解液。6.6BCA蛋白测定试剂盒。6.7ECL发光液。6.10Tween-20。6.12聚丙烯酰胺凝胶储液：30%丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺凝胶储液，按照A.1配制。6.13浓缩胶缓冲液(0.5mol/LTris·HCl,pH=6.8),按照A.2配制。6.14分离胶缓冲液(1.5mol/LTris·HCl,pH=8.8),按照A.3配制。6.211×PBS缓冲液(0.01mol/L磷酸6.265%浓缩胶，按照A.15配制。6.2712%分离胶，按照A.16配制。6.28丽春红染色液。23GB/T40225—20216.29显影液。6.30定影液。6.31电泳蛋白Marker:10ku～170ku。7.5化学发光仪。8样品8.1自制的肌动蛋白抗体建议按照预估效价调整适当稀释梯度进行预试验。8.2肌动蛋白抗体产品，首次使用时可按照产品说明书进行稀释或选择适当稀释梯度进行预试验，待9.1.2抗体稀释比例和抗原上样量可根据实际试验情况和肌动蛋白抗体效价进行适当调整。9.2.1当经过处理后的细胞到达处理时间或者细胞密度达到80%～95%时，收集细胞。从二氧化碳培养箱中取出细胞培养瓶，置于冰上，用移液器吸出培养液。在培养瓶中加入4℃冰箱预冷30min后的1×PBS,缓慢平动培养瓶，使缓冲液充分洗涤细胞表面，倒掉PBS,重复操作2次～3次；在最后一次洗9.2.2向培养瓶中加入4℃冰箱预冷30min后的NP-40裂解液(每75cm²培养瓶约加1mL),放置在冰上裂解20min。然后用细胞刮子沿着瓶壁刮细胞。吸出刮好的细胞裂解液置于15mL离心管中(置9.2.3重复步骤9.2.2,尽可能将多的细胞裂解液收集到15mL的离心管中，插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2s～3s,重复3次。如仍有细胞碎片或沉淀，宜4℃,10000r/min,9.2.4取出少量细胞裂解液测定蛋白浓度(可用BCA蛋白测定试剂盒测定),其余细胞裂解液可分装4GB/T40225—2021液浓度为1mg/mL。分子质量为45ku±3ku,可选择8%～12%浓度的分离胶，本文件给出了12%分离胶的配制，见A.16。蛋白质分子质量范围/ku8注：来源参考：AbcamR。9.4.3抗原上样前需与2×上样缓冲液等体积混匀，95℃变性5min。用2×上样缓冲液稀释抗原内参至10ng/μL,95℃变性5min。变性后的抗原和抗原内参按照规定上样量上样。抗原可参考5μg、议在邻近的齿孔加入5μL电泳蛋白Marker。9.4.4将电泳槽连接电源进行电泳，注意正负极的区分。电压调至80V～120V,分离胶电泳时间为9.5.1电泳结束后比照Marker的大小，选择包含抗原内参凝胶部分，轻轻切下后将凝胶取出，放置于4℃冰箱预冷30min的1×转移缓冲液中。9.5.2按照即将切下的目的胶块的大小来剪相应大小的硝酸纤维膜或PVDF膜，剪下后在左上角剪小角以区分正反面，后将其浸泡于甲醇中活化约1min;之后取出放到配制好的1×转移缓冲液中平衡超置1块海绵、3层～5层滤纸，用玻璃棒轻轻赶走气泡后，放上已平衡好的硝酸纤维膜或PVDF膜9.5.4转膜槽中倒入4℃冰箱预冷30min的1×转膜液，加入冰块，盖上转膜盖。然后将转膜槽放置9.5.5转膜结束后，确认Marker是否转移成功。将硝酸纤维素膜或PVDF膜浸没在丽春红染色液中，摇动5min～10min或更长时间；取出印迹膜，用蒸馏水或1×PBS当溶液漂洗2次～3次，可出现清晰5将印迹膜轻轻取出后，放置于封闭缓冲液中，室温条件下摇床2h或者置于4℃冰箱中封闭8h~将待测样品抗肌动蛋白抗体与封闭缓冲液按照1:2500,1:5000,1:10000,1:20000,1:40000比例混合。将印迹膜置于10mL该混合液中，避免产生气泡，室温条件下轻轻摇动2h或者4℃冰箱孵育8h～12h。将HRP标记的二抗与封闭缓冲液按照1:5000比例混合。将印迹膜置于10mL该混合液中，室步骤与9.6.3相同。待测样品应在45ku±3ku位置出现肉眼可见的相应大小条带。也可使用图像处理软件做条带灰45ku±3ku大小条带，每个稀释梯度条带大小一致，条带信号从1:2500至1:40000逐渐减弱。抗体1:40000稀释比应有明显阳性信号。图谱见附录B。为1:10000进行测试。待测样品中均应出现45ku±3ku大小条带，每个上样量条带大小一致，条带信号从5μg总蛋白/泳道至60μg总蛋白/泳道逐渐增强。抗体检测5μg总蛋白/泳道的上样量应有明显阳性信号。图谱见附录B。分别用NIH3T3细胞(小鼠细胞)、C6细胞(大鼠细胞)、COS7细胞(猴细胞)、CHO-K1细胞(仓鼠细胞)代替HeLa细胞(人细胞)样品进行测试，待测样品稀释成1:10000后进行测试。各细胞样品均6GB/T40225—2021将抗体原液放于密闭的、内壁硅化处理的聚丙烯管中，置于37℃±0.5℃二氧化碳培养箱进行热处理7d。对照抗体置于-20℃存放7d。两组样本处理后在室温进行目测及采用分光光度法测定吸光度OD₆00,目测没有显著沉淀，吸光度偏差小于10%视为无质量变化。免疫印迹检测不同物种细胞应在45ku±3ku位置观察到单一目的条带，且可与肌动蛋白标准物质或商品化的肌动蛋白在同一位置检测出条带。应定期对相关检测仪器进行检定或校准。肌动蛋白抗体检测涉及的相关试剂需从具备专业资质并经过验证核实的供应商处采购，且具备检检测涉及的细胞应按照国家相关指导性文件要求使用和管理。细胞房应按照国家相关文件要求建设和管理。a)产品名称；b)抗体总量；c)抗体分子质量；f)抗体保存条件及期限。7GB/T40225—2021(规范性)A.1聚丙烯酰胺凝胶储液Acr(丙烯酰胺)Bis(甲叉双丙烯酰胺)加蒸馏水定容至将上述各成分充分溶解于80存30d～60d。A.2浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTrisbase(Tris碱)加HCl调pH至6.8加蒸馏水定容至mL蒸馏水，加蒸馏水定容至100mL,过滤后置于棕色瓶中，4℃可贮Tris·HCl,pH=6.8pH=6.8将上述Trisbase充分溶解于80储存于4℃。Trisbase(Tris碱)加HCl调pH至8.8加蒸馏水定容至将上述Trisbase充分溶解于80储存于4℃。mL蒸馏水，加6mol/L盐酸调pH至6.8,加蒸馏水定容至100mL,Tris·HCl,pH=8.8pH=8.8mL蒸馏水，加6mol/L盐酸调pH至8.8,加蒸馏水定容至100mL,A.4上样缓冲液0.5mol/LTris·HClpH6.85mLgGlycerol(甘油)2mL0.4mLBromophenolBlue(BPB,溴酚蓝)mg加蒸馏水定容至mL将上述0.5mol/LTris·HCI、SDS及适量加蒸馏水(控制三者总体积≤8mL),搅拌充分溶解；再加入β-ME、BPB,搅拌充分溶解，加蒸馏水定容至10mL,储存于4℃。A.510×电泳缓冲液Trisbase(Tris碱)Glycine(甘氨酸)GB/T40225—2021加蒸馏水定容至1000mL将上述Trisbase、Glycine、SDS充分溶解于800mL蒸馏水，加蒸馏水定容至1000mL,储存于室温。A.610×转移缓冲液Trisbase(Tris碱)Glycine(甘氨酸)加蒸馏水定容至注：10×转移缓冲液不含甲醇，稀释成1×转移缓冲液后，加入甲醇溶液使甲醇终浓度为20%。将上述Trisbase、Glycine、SDS充分溶解于800mL蒸馏水，加蒸馏水定容至1000mL,储存于室温。A.71×电泳缓冲液10×电泳缓冲液100mL加蒸馏水定容至1000mL将上述100mL10×电泳缓冲液用蒸馏水稀释并定容至1000mL,充分混匀，储存于4℃。A.81×转移缓冲液10×转移缓冲液Methonol(甲醇)加蒸馏水定容至注：甲醇现用现加。将上述100mL10×转移缓冲液和600mL蒸馏水混合，再加入200mL甲醇，加蒸馏水定容至1000mL,储存于4℃。A.910×PBS缓冲液(0.1mol/L磷酸盐缓冲液),pH=7.4磷酸二氢钾(KH₂PO₄)磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)氯化钠(NaCl)氯化钾(KCl)加蒸馏水至加HCl调节pH至7.4,加蒸馏水定容至将上述成分充分溶解于800mL蒸馏水，加6mol/L盐酸调节pH到7.4,加蒸馏水定容至1000mL,储存于室温。A.101×PBS缓冲液(0.01mol/L磷酸盐缓冲液),pH=7.4方法一：将A.9中100mL10×PBS缓冲液用蒸馏水稀释并定容至1000mL,充分混匀，储存于4℃。方法二：按照如下配方，将各成分充分溶解于800mL蒸馏水，加6mol/L盐酸调节pH到7.4,加蒸馏水定容至1000mL,高温高压灭菌≥20min(可选做),储存于室温或4℃。磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.24g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.44g89氯化钠(NaCl)氯化钾(KCl)加蒸馏水至加HCl调节pH至7.4,加蒸馏水定容至GB/T40225—2021gmLmLA.1110×TBS缓冲液(0.1mol/LTris盐缓冲液),pH=7.4Tris-base(Tris氯化钠(NaCl)氯化钾(KCl)加蒸馏水至800mL加HCl调节pH至7.4,加蒸馏水定容至将上述成分充分溶解于800mL蒸馏水，加6mol/L盐酸调节pH到7.4,加蒸馏水定容至1000mL,储存于室温。A.121×TBS缓冲液(0.01mol/LTris盐缓冲液),pH=7.4方法一：将A.11中100mL10×TBS缓冲液用蒸馏水稀释并定容至1000mL,充分混匀，储存于方法二：按照如下配方，将各成分充分溶解于800mL蒸馏水，加6mol/L盐酸调节pH到7.4,加蒸馏水定容至1000mL,高温高压灭菌≥20min(可选做),储存于室温或4℃:氯化钠(NaCl)8g氯化钾(KCl)0.2g加蒸馏水至加HCl调节pH至7.4,加蒸馏水定容至A.13洗膜缓冲液：即TBST或PBST,含0.1%Tween-20的1×TBS或PBS缓冲液Tween20加蒸馏水定容至mLmL称取上述Tween-20,100mL10×TBS或10×PBS缓冲液，加蒸馏水混匀、稀释并定容至1000mL,储存于室温或4℃。A.14封闭缓冲液：即含5%脱脂奶粉的TBST或PBST脱脂牛奶5g洗膜缓冲液100mL封闭缓冲液现用现配