细菌内毒素测定技术（药品生物检定课件）

知识点1：细菌内毒素及鲎试剂一、细菌内毒素与鲎试剂细菌内毒素检查技术近30年来发展起来一种新技术，他是用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，除另有规定外，以凝胶法结果为准。知识点1：细菌内毒素及鲎试剂（一）发展简介

1956年JohnsHophins大学动物学家Frederik.Bang发现革兰阴性细菌的粗制品能使鲎的血细胞凝聚。1963～1964年Jack.Levin和Bang对细菌引起鲎血凝聚进行研究，用内毒素和鲎血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种酶反应。多位学者对鲎血细胞溶解物（LAL）进行研究，阐释了凝聚机制。知识点1：细菌内毒素及鲎试剂鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成。鲎试剂的种类：依据鲎的种类分：美洲鲎试剂（LAL）中国鲎试剂（TAL）圆尾鲎试剂（CAL）知识点1：细菌内毒素及鲎试剂

（

二）鲎试剂反应原理

鲎试剂反应原理鲎的血变形细胞中含有两种物质，即高分子量凝固酶原和凝固蛋白原。前者经内毒素激化转化成为具有活性的凝固酶，通过凝固酶的酶解作用将凝固蛋白原转变为凝固蛋白，凝固蛋白又通过交联酶作用互相聚合而形成牢固的凝胶。知识点1：细菌内毒素及鲎试剂凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理知识点1：细菌内毒素及鲎试剂二、细菌内毒素标准品细菌内毒素国家标准品（RSE）RSE系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素。用于标定细菌内毒素工作标准品的效价和标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度。细菌内毒素工作标准品（CSE）CSE系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其质量的相当效价。每1ng工作标准品效价应不小于2EU不大于50EU。细菌内毒素工作标准品用于鲎试剂灵敏度复核、干扰试验和设置的各种阳性对照。知识点1：细菌内毒素及鲎试剂三、细菌内毒素检查用水（BET）BET是细菌内毒素检查法专用水。凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度法测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素含量应小于0.005EU/ml。

知识点2：细菌内毒素检查前准备工作一、器具试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。

知识点2：细菌内毒素检查前准备工作一、器具试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。

知识点2：细菌内毒素检查前准备工作二、细菌内毒素检查用水（BET水的要求）：凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。

知识点2：细菌内毒素检查前准备工作

三、供试品溶液的制备

某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH在6.0—8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。知识点2：细菌内毒素检查前准备工作

四、内毒素限值的确定细菌内毒素的量值和细菌内毒素的限值（L）为保证用药安全，给每一种药物规定了相应的限值（L），只要低于该限值，按照规定给药途径即为安全。1EU与1个内毒素国际单位(IU)相当。知识点2：细菌内毒素检查前准备工作

药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按下式确定：

L=K/M

式中，L为供试品的细菌内毒素限值；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量。知识点2：细菌内毒素检查前准备工作哺乳动物对细菌内毒素有一定的耐受能力，因此不必要求药物绝对不含内毒素，只要不超过一定限度就不会引起热原反应。为保证用药安全，给每一种药物规定了相应的限值(L)，只要低于该限值，按照规定给药途径即为安全。内毒素检查的目的就是确定药品内毒素值是否低于限值。限值的确定有两种方式，即从药典中查询和根据公式计算。各国药典规定做细菌内毒素检查项的品种都可在药典正文中查到相应的限值。知识点2：细菌内毒素检查前准备工作五、最大有效稀释倍数的确定（MVD）

最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1一MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用下式来确定MVD：

MVD=cL/λ

式中：L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度；

λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度，或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。知识点2：细菌内毒素检查前准备工作【例】最小有效稀释浓度(MVC)的计算设鲎试剂的灵敏度为0.25EU/ml，即λ=0.25EU/ml，枸橼酸的内毒素限值L为0.51U/mg（IU与EU等同），计算其最小有效稀释浓度(MVC)。解：由于枸橼酸为固体，则MVD取1，可以通过c=λ/L确定最小有效稀释浓度，即MVC=0.25/0.5=0.5mg/ml.

知识点：鲎试剂灵敏度复核试验一、鲎试剂及鲎试剂灵敏度鲎血含铜蓝蛋白，呈蓝色。鲎试剂由鲎血制备而成，是从鲎血的变形细胞裂解物中提取制备而来。鲎试剂根据鲎的种类不同科分为美洲鲎试剂、中国鲎试剂、圆尾鲎试剂；根据鲎试剂和细菌内毒素反应的专一性不同，可分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。

知识点：鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂的规格指每支鲎试剂的装量，一般来说，规格是多少，就用多少细菌内毒素检查用水复溶试剂使用。在细菌内毒素检查的规定条件下使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。知识点：鲎试剂灵敏度复核试验

二、鲎试剂灵敏度的复核在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。知识点：鲎试剂灵敏度复核试验

（一）稀释标准内毒素根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作用细菌内毒素检查用水溶解，制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管，另外2管阴性对照（共18管）。37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是否变形和滑落判断试验结果。注意保温和拿取试管的过程应避免受到振动造成假阴性结果。知识点：鲎试剂灵敏度复核试验（二）结果判断：

若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。结果计算：

反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc=lg-1（∑X/4）

式中X为反应终点浓度的对数值。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。知识点：鲎试剂灵敏度复核试验当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于内毒素检查。但是注意要以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

知识点：干扰试验一、干扰试验是为了确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为产品能否用细菌内毒素检查法提供依据，并且验证供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时，供试品是否存在干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。

知识点：干扰试验用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品按下表制备溶液A、B、C和D。同时制备2支供试品阴性对照和2支阴性对照。二、凝胶法干扰实验溶液的制备知识点：干扰试验三、结果判断：

当供试品阴性对照和水阴性对照都为阴性，并且细菌内毒素检查用水溶解的内毒素系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。知识点：干扰试验

分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）Es=lg-1(ΣXs/4)Et=lg-1(ΣXt/4)知识点：干扰试验

当Es在0.5λ和2λ（包括0.5λ和2λ）之间、Et在0.5Es至2Es(包括0.5Es和2Es）之间时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。三、光度测定法干扰试验选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表制备溶液A、B、C和D。编号内毒素浓度被加入内毒素的溶液平行管数A无供试品溶液至少2B标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为λm）供试品溶液至少2C至少3个浓度（最低一点设定为λ）检查用水每一浓度至少2D无检查用水至少2A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。D为阴性对照。

知识点：干扰试验二、计算

按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒紊含量Ct计算该试验条件下的回收率（R）。

知识点：干扰试验三、结果判断：当内毒素的回收率在50％～200％之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。反之，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素，并重复干扰试验。

技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程一、灵敏度复核的操作

1．

取分装有0.1ml鲎试剂溶液的l0mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程

2、将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。

3、将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是否变形和滑落判断试验结果。注意保温和拿取试管的过程应避免受到振动造成假阴性结果。

技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程3、结果判断：

若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。4、结果计算：

反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc=lg-1（∑X/4）

式中X为反应终点浓度的对数值。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程

若结果不是最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0.

25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性时,本批鲎试剂不能使用须查找原因，可能是灵敏度表示错误，或是内毒素效价表示不准确,或者操作失误,应重试。

知识点：

凝胶半定量试验

一、方法

本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表1制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5—2λ之间，试验有效。

表1凝胶半定量试验溶液的制备A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品系列稀释液。B：供试品阳性对照。（为确证不存在干扰作用）C：标准内毒素系列。（为确证本次试验的操作和环境都符合要求。）D：阴性对照。

知识点：

凝胶半定量试验

二、计算

系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度，计算公式为:

知识点：

凝胶半定量试验三、结果判断：1、如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。2、如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。知识点：

凝胶半定量试验

3、如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。4、若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不符合规定。

知识点：光度测定法

一、方法光度测定法分为浊度法和显色基质法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。

知识点：光度测定法

光度测定试验需在特定的仪器中进行，温度一般为37℃±1℃。

供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等参照所用仪器和试剂的有关说明进行。

为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验。

知识点：光度测定法

二、标准曲线的可靠性试验用标准内毒素制成溶液，制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。根据线性回归分析，标准曲线的相关系数的绝对值应大于或等于0.980，试验方为有效。否则须重新试验。知识点：光度测定法三、检查法按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。试验必须符合以下三个条件方为有效：1、系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求2、用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50%～200％的范围内；3、溶液D的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。知识点：光度测定法

四、结果判断

若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后小于规定的