微生物数量检验技术（药品生物检定课件）

微生物数量检查技术

药品微生物总数检查的要求知识点5环境、人员和取样的要求1.环境、人员和取样的要求1.1相关概念1.1.1微生物广泛存在于自然界中，药品在生产、运输和储存过程中很容易受其污染，导致药品变质，影响质量。1.1.2药品微生物总数检查是检测非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法，也是用于评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据。1.1.3药品微生物总数检查包括细菌数、霉数及酵母菌数的检查，是对单位质量、体积或面积的药品中所污染活菌数量的检查。

环境、人员和取样的要求1.1.4检查方法为平板菌落计数法和薄膜过滤法；检查的药品有口服液体制剂、酊剂、中药丸剂、栓剂、软膏剂、膜剂、散剂、鼻用制剂、洗剂、灌肠剂、部分特殊部位使用的片剂和含中药原粉、豆豉、神曲、动物组织的各种口服制剂。1.1.5对一般胶囊剂、颗粒剂、片剂等，《中国药典》不强制要求做微生物总数检查，由药品生产单位自行控制、抽查，结果必须符合规定。通过学习本项目中的基本理论知识并进行适当的实训操作能在以后的实际工作中正确进行药品中微生物总数的检查，并对检查结果做出合理判断。

环境、人员和取样的要求1.2任务描述微生物检测实训室要对一批口服制剂进行微生物总数的检查。要求检验人员根据供试品的特点制定检测方案，并做检验方法的验证试验，填写检验记录，根据检验结果判断药品的微生物总数是否符合《中国药典》的相关规定。环境、人员和取样的要求1.3检测环境及操作人员要求药品微生物总数检查应在环境洁净度B级下的局部洁净度A级的单向流空气区域内进行。单向流空气区域，工作台面及环境应定期按现行国家标准进行洁净度验证。检验人员在进入无菌环境前，应先做好个人卫生工作。先用肥皂或适宜消毒液洗手，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。检验人员在整个的检验过程中必须进行无菌操作。

环境、人员和取样的要求1.4供试品的取样要求1.4.1抽样

一般采用随机抽样方法，其抽样量应为检验用量(2个以上最小包装单位)的3～5倍量(以备复试或留样观察)。抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品。机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。凡能从药品、瓶口(外盖内侧及瓶口周围)外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。

环境、人员和取样的要求1.4.2检验量

所有剂型的检验量均需取自2个以上包装单位(中药蜜丸需取自4丸、膜剂取4片以上)。固体及半固体(黏稠性供试品)制剂检验量为10g，液体制剂检验量为10ml。膜剂除另有规定外，检验量为100cm2。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g或10ml用于阳性对照试验)。特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减，除另有规定外，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。

环境、人员和取样的要求1.4.3样品的保存

供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥致死、损伤或繁殖。供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品进行检查。

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供试液制备知识点2不同剂型药品供试液制备2.供试液的制备根据被检药品的理化特性与生物学特性，采取适宣的方法制备供试液。所用乳化剂、分散剂、中和剂或灭活剂及其用量应证明是有效的，并对微生物无毒性。供试液的制备若需用水溶加温时，温度不应超过45℃，时间不得超过30min。除另有规定外,常用的供试品制备方法如下。2.1一般供试品溶液的制备2.1.1.液体供试品

取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。

环境、人员和取样的要求2.1.2固体、半固体或黏稠液供试品

取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。2.2用特殊方法制备供试液的供试品2.2.1非水溶性供试品2.2.1.1软膏、乳膏剂

取供试品5g(或5ml)，加至含熔化的5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80的无菌混合物(熔化温度不超过45℃)的烧杯中，即先将烧杯中无菌助溶剂混合物溶化，待温度不超过45℃时，加入供试品，用无菌玻棒搅拌成团后，分次慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠一蛋白陈缓冲液至100，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。

环境、人员和取样的要求2.2.1.2油剂

取供试品10m，加入无菌聚山梨酯805-8m1，摇匀，再加入稀释剂至100m，作为1:10供试液。2.2.1.3栓剂

称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45℃水溶保温10min，使熔化，加入无菌聚山梨酯805～8ml，振摇使之乳化，再加稀释剂(稀释剂和山梨酯80总量为100ml)，摇匀，作为1：10供试液。2.2.1.4膏剂

取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见《中国药典》部附录ⅪH“无菌检查法”)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氧化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5-10min，萃取，待油水明显分层，取其水层作为1:10供试液。

环境、人员和取样的要求2.2.2.非水溶性膜剂供试品

一般取样为100cm2，置灭菌锥形瓶中，加入适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，于45℃水浴中保温，浸泡，振摇，以供试品浸液作为1:10供试液。中药膜剂取100cm2，剪碎，加适量的pH7.0无菌氧化钠-蛋白胨缓冲液(通常1cm2加1ml或2ml)，浸泡，振摇，以供试品浸液作为1:10供试液。2.2.3肠溶及结肠溶制剂供试品

取供试品10g，肠溶制剂加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，结肠溶制剂加pH7.6无菌磷酸盐缓冲液至100ml，均置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10供试液。

环境、人员和取样的要求2.2.4气雾剂、喷雾剂

供试品取规定量供试品，置冰箱冰冻室(-20℃以下)内约lh。取出，迅速消毒供试品容器的开启部位周围，用无菌钢锥在容器上钻一小孔，在室温轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的稀释剂(若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80)中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1:10的供试液。2.2.5茶剂供试品

取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇2～3min，以灭菌纱布过滤(如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1:10加稀释剂浸泡30min)。以上供试品如吸水膨胀，或黏度过高，可增加稀释剂的量，制成1:20～1:100供试液。

环境、人员和取样的要求2.2.6贴膏剂供试品

取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料(如无菌纱布)覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂(如聚山梨酯80或卵磷脂)的稀释剂中，用力振荡至少30min，或放置于均质仪均质10min，或以其他方法制备成供试液。2.3具抑菌活性的供试品当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下：2.3.1稀释法

取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时，1ml供试液可等量分注多个平皿。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。

环境、人员和取样的要求2.3.2离心沉淀法

此方法用于去除供试液中的沉淀物，对于抑菌活性较强的供试品，如供试液中有不溶颗粒、沉淀，取供试液，先以500r/min，离心3min，取上清液进行试验。2.3.3薄膜过滤法

见“灭菌药物的无菌检验”中的“薄膜过滤法”。本法适用于含有各种抑菌、抗菌、防腐等成分的供试品。2.3.4中和法

凡含汞、砷或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性，制成供试液。

环境、人员和取样的要求2.4供试液的稀释(10倍递增稀释法)2.4.1取2～3支灭菌试管，分别加入9mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂(此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量。切勿在酒精灯火焰的正上方操作，以免火焰将供试液中的菌细胞杀灭)。加稀释剂后，试管塞应立即塞上。

环境、人员和取样的要求2.4.2另取1支1ml灭菌吸管吸1:10均匀供试液1ml，加入装有9mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂的试管中，混匀，即得1:100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1：103等适宜稀释级。每递增1稀释级，必须另换一支吸管。稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处(勿接触液面)缓慢地放出全部供试液(吸管内应无黏附或残留液体)，然后将吸管放入消毒液缸内。

环境、人员和取样的要求微生物数量检查技术

培养基制备及其适用性检查知识点3药品微生物总数检查用培养基种类及制备步骤3药品微生物总数检查用培养基种类及制备步骤3.1培养基的种类3.1.1营养琼脂培养基配方(每升)：

蛋白胨10g牛肉膏粉3g氯化钠5g琼脂15g最终pH7.3±0.2

药品微生物总数检查用培养基种类及制备步骤3.1.2玫瑰红钠琼脂培养基配方(每升)：

胨5g葡萄糖10g磷酸二氢钾1g硫酸镁0.5g玫瑰红钠0.0133g琼脂14g最终pH6.0±0.2

药品微生物总数检查用培养基种类及制备步骤3.1.3酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(每升)：胨10g酵母膏粉5g葡萄糖20g琼脂14g最终pH6.0±0.2

药品微生物总数检查用培养基种类及制备步骤3.2培养基制备及注意事项3.2.1培养基配方的选定同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外．一般均应尽量收集有关资料．加以比较核对．再依据自己的使用目的加以选用，记录其来源。3.2.2培养基的制备记录每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源．和各种成份的牌号。最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。

药品微生物总数检查用培养基种类及制备步骤3.2.3培养基的制备记录每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源．和各种成份的牌号。最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。3.2.4培养基成分的称取培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱．最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后．还应进行一次检查。

药品微生物总数检查用培养基种类及制备步骤3.2.5培养基各成份的混合和溶化培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢锅加热溶化．也可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动，以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化．迄至煮沸。如为琼脂培养基，应先用一部分水将琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。

药品微生物总数检查用培养基种类及制备步骤3.2.6培养塞pH的初步调整培养基各成分完全溶解后，应进行pH的初步调正，因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，例如，牛肉浸液约可降低pH0.2.而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终pH，保证培养基的质量。pH调正后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。药品微生物总数检查用培养基种类及制备步骤3.2.7培养基的过滤澄清液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应拆叠成折扇成漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷却至55-60℃的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入1-2个鸡蛋的蛋白．强力振摇3-5分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121℃加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。

若能自行沉淀者，亦可静置冰箱中1-2日、吸取其上清液即可。药品微生物总数检查用培养基种类及制备步骤3.2.8培养基的分装培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。

药品微生物总数检查用培养基种类及制备步骤微生物数量检查技术

培养基制备及其适用性检查技能点1玫瑰红钠琼脂培养基制备操作规程1玫瑰红钠琼脂培养基1.1用途供药品和生物制品中霉菌和酵母菌的计数、分离和培养用(《中华人民共和国药典》2010年版)。

玫瑰红钠琼脂培养基制备操作规程1.2原理胨提供碳源和氮源;葡萄糖提供能源;磷酸二氢钾为缓冲剂;硫酸镁提供必须的微量元素;玫瑰红钠作为选择性抑菌剂可抑制细菌的生长，并可减缓某些霉菌因生长过快而导致菌落漫延生长;琼脂是培养基的凝固剂。1.3配方蛋白胨10g牛肉膏粉3g氯化钠5g

琼脂15g最终pH7.3±0.2

玫瑰红钠琼脂培养基制备操作规程1.4使用方法(计数用法)1.4.1称取本品30.5g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌20min。1.4.2检样的稀释处理取2～3支灭菌试管，分别加入9mpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂(此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量。切勿在酒精灯火焰的正上方操作，以免火焰将供试液中的菌细胞杀灭)。加稀释剂后，试管塞应立即塞上。

玫瑰红钠琼脂培养基制备操作规程1.4.3根据对样品污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2～3个平皿。

1.4.4

将凉至45℃左右的培养基约15mL注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于20—25℃温箱中培养72h，对于菌落微小点计困难的平板可延续培养到4—5d再进行观察计数。

玫瑰红钠琼脂培养基制备操作规程1.5计数、报告1.5.1计数一般情况下，玫瑰红钠平板计点霉菌或酵母菌数，如在该平板上生长的细菌菌落数多于营养琼脂平板上生长的菌落数时，则应同时点计细菌数，并将该菌数作为供试品的细菌数报告。固体供试品在平板上点计霉菌落数，液体供试品则需在玫瑰红钠琼脂平板上点计玫瑰红钠琼脂霉菌与酵母菌菌数;含蜂蜜及王浆的合剂需以玫瑰红钠平板的霉菌菌落数加上酵母膏粉胨葡萄糖琼脂平板的酵母菌菌落数作为供试品的霉菌、酵母菌总数。1.5.2报告通常选择菌落数在30～100之间的稀释级的平板计数，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。玫瑰红钠琼脂培养基制备操作规程1.5.3质量控制本品倾注平皿后呈玫瑰红色，下列菌株接种后20—25℃培养72h生长情况如下表。玫瑰红钠琼脂培养基制备操作规程菌名菌号生长状况菌落特征黑曲霉

CMCC(F)98003良好菌丝白色孢子黑色，底部玫瑰红色白色念珠菌CMCC(B)98001良好

菌落表面呈奶油色大肠埃希氏菌CMCC(B)44102被抑制——微生物数量检查技术

培养基制备及其适用性检查技能点2培养基适用性检查2培养基适用性检查培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节。计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。培养基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价检验用培养基是否符合检验要求。

培养基适用性检查

2.1培养基适用性检查适用范围2010版《中国药典》规定微生物限度检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。2.2微生物限度检查用培养基质量控制的一般原则2.2.1不同处方培养基的替代使用不能通过培养基使用性检查试验简单确定。2.2.2.培养基适用性检查不能取代供应商或其他法定标准对培养基的有效期、保存条件、制备方法等的更严格的规定。2.2.3.如果没有特殊规定，培养基配制采用蒸馏水或纯化水均可，但应采用一定措施加以检测控制，如蒸馏水应核实PH是否为5~7；采用离子交换法制备的纯化水，电阻值应不小于2MΩ等。

培养基适用性检查

2.2.4尽量临用现配。培养基灭菌后在能取出的前提下，尽快取出，切忌在高压锅内过夜存留；固体培养基灭菌或融化后，融化状态放置不得超过8h；一般预制培养基可置洁净环境2~25℃保存，但不应超过20天；固体琼脂培养基熔化再使用应不超过一次。2.2.5干粉培养基或培养基原料变质不应再用；预制培养基储存过程中发现浑浊、变色、长菌、严重脱水等变化不应再用。2.3对照培养基对照培养基应通过严格的质量研究和控制，具备性能稳定、质量优异的特点。对照培养基作为一种标准试剂，应具备可靠的来源和保障。

培养基适用性检查

2.4培养基适用性检查指标及常用方法2.4.1检测指标：促生长能力、指示能力、抑制能力。2.4.2常用方法：直接接种法、浇碟法、表面接种法（涂布法）。2.4.3液体培养基通常采用直接接种法测定上述3种指标，接种时应注意接种量不得超过培养基体积的10%。固体培养基采用浇碟法和表面接种法测定上述指标。采用浇碟法考察固体培养基时，为了保证取样的平行性，平行测定两皿求平均数；采用表面接种法考察固体培养基时，表面接种菌液不多于0.2ml/皿，尽量控制在0.1ml/皿，保证取样的平行性，平行测定两皿观察结果。

培养基适用性检查

2.5计数培养基的适用性检查微生物限度检查中计数用培养基3种，营养琼脂、玫瑰红钠营养琼脂和酵母浸出粉葡萄糖琼脂。2.5.1计数培养基适用性检查试验菌株：

大肠埃希菌［CMCC(B)44102］金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］

枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］

白色念珠菌［CMCC(F)98001］

黑曲霉菌［CMCC(F)98003］

菌株培养基菌液制备同微生物限度检查方法验证

培养基适用性检查

2.5.2实验操作2.5.2.1培养基制备按规定程序新鲜配置营养琼脂（被检培养基和对照培养基）、玫瑰红钠营养琼脂（被检培养基和对照培养基）以及酵母浸出粉葡萄糖琼脂（被检培养基和对照培养基），灭菌后备用。2.5.2.2营养琼培养基取7个无菌平皿，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌50~100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照营养琼培养基，混匀，凝固后于30~35℃倒置培养48h,计数；被检培养基同法操作。

培养基适用性检查

2.5.2.3玫瑰红钠营养琼脂取5个无菌平皿，分别接种白色念球菌、黑曲霉菌各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌50~100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照玫瑰红钠营养琼脂，混匀，凝固后倒置培养72h,计数；被检培养基同法操作。2.5.2.4酵母浸出粉葡萄糖琼脂

取3个无菌平皿，分别接种白色念球菌2皿，每皿接种1ml菌液（含菌50~100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照酵母浸出粉葡萄糖琼脂，混匀，凝固后倒置培养72h,计数；被检培养基同法操作。

培养基适用性检查

2.5.2.4结果判断若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。

培养基适用性检查

2.6控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配置的培养基均应检查。检查项目包括培养基的促生长能力、指示和抑制特性能力。2.6.1计数培养基适用性检查试验菌株。

大肠埃希菌［CMCC(B)44102］

金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］

铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］

乙型副伤寒沙门菌［CMCC(B)50094］

白色念珠菌［CMCC(F)98001］

枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］

菌株培养基菌液制备同微生物限度检查方法验证。

培养基适用性检查

2.6.2各种培养基需要测试的能力及判断指标2.6.2.1液体培养基促生长能力检查：取不大于100cfu的试验菌株分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最短培养基时间下培养。增菌培养基多为澄清液体培养基，与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊。2.6.2.2固体培养基促生长能力检查：取试验菌液0.1ml（含菌数50~100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最短培养基时间下培养。与对照培养基比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。培养基适用性检查

2.6.2.3液体培养基指示能力检查：取不大于100cfu的试验菌株分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最短培养基时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基中试验菌应生长情况/指示剂反应等应与对照培养基一致。2.6.2.4固体培养基指示能力检查：取试验菌液0.1ml（含菌数50~100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最短培养基时间下培养。被检培养基上试验菌的菌落形态特征、菌落颜色及指示剂反应情况应与对照培养基一致。培养基适用性检查

2.6.2.5培养基抑制能力检查：取不大于100cfu的试验菌株分别接种于液体被检培养基和对照培养基，取试验菌0.1ml液（不大于100cfu）分别涂布于固体被检培养基和对照培养基，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最长培养基时间下培养。试验菌应不得生长。培养基适用性检查微生物数量检查技术

计数方法的验证技能点3更年宁微生物总数检查方法验证3更年宁微生物总数检查方法验证3.1实训目的了解供试品特性及其微生物总数限度标准。熟悉微生物总数检查方法验证用菌液的制备方法。掌握方法验证的操作步骤并能对验证结果做出准确判断。3.2实训要求严格遵守实训室管理规章制度。按照实训计划进行操作。认真分析和讨论实训中出现的问题。尊重实训结果的科学性。完成实训任务,达到实训目的。

更年宁微生物总数检查方法验证3.3实训内容3.3.1实验环境无菌室、超净工作台。3.3.2设备、仪器仪器、试剂、菌种及培养基设备恒温培养箱30～35℃、生化培养箱23～28℃、匀浆杯。仪器菌落计数器、锥形瓶(250～300ml,500ml,1000ml)、培养皿(直径

9cm)、带塞试管(18mmx180mm,28mm×198mm)、吸管(1ml分度0.01,10ml分度0.1)。玻璃器皿均于高压蒸汽121℃灭菌30min,烘干。用具白金耳、酒精灯、灭菌剪刀和镊子、试管架、火柴、记号笔、白瓷盆、实验记录纸

更年宁微生物总数检查方法验证3.3.3试剂0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、靛基质试液3.3.4验证用菌种及培养基大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌、黑曲霉菌;营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖增菌液、乳糖胆盐发酵培养基、MUG培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基

更年宁微生物总数检查方法验证3.4实验步骤3.4.1菌液制备取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物2～3白金耳加入9ml0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-3～10-7约为50～100cfu/ml,做活菌计数用。取经25℃培养18～24h的白色念珠菌液体培养物2～3白金耳加入9m10.9%

氯化钠溶液中,10倍稀释至10-3～10-7约为50～100cfu/ml,做活菌计数备用。取经培养1周的黑曲霉斜面培养物,加0.9%氯化钠溶液3ml,洗下霉菌孢

子,取0.1ml加入9ml0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-3～10-7约为50～100cfu/ml,做活菌计数备用。更年宁微生物总数检查方法验证3.4.2操作方法供试液制备取本品10g置匀浆杯中，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、靛基质试液100ml,以4000r/min开机2min,即为1:10的供试液。验证方法采用常规法。验证试验分4组,至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。菌液组:分别取上述5种菌液1ml,注入平皿中,倾注培养基,待凝后,置规定温度培养24～72h,观察结果并计数。供试品对照组:取1：10供试液1m注入平皿中,倾注培养基,待凝后,置规定温度培养24～72h,观察结果并计数。

更年宁微生物总数检查方法验证试验组:取供试液1ml按供试品对照组同法操作,同时每个平皿加入50～100cfu相应试验菌1ml,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24～72h,观察结果并计数。稀释剂对照组:取相应的稀释剂1ml注入每个平皿中,并加入50~100cfu相应

试验菌1ml,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24～72h,观察结果并计数。3.5注意事项检验全过程要严格遵守无菌操作。吸取供试液时要先摇匀。供试液从制备到加入培养基不能超过1小时。更年宁微生物总数检查方法验证微生物数量检查技术

计数方法的验证知识点4计数方法的验证步骤4计数方法的验证步骤4.1验证目的为了使微生物学检验方法的结果准确可靠，需要对每个品种的具体检验方法进行验证。

计数方法的验证步骤4.2验证的影响因素：药品本身的抑菌性药品中防腐剂的抑菌性培养基的促菌生长能力培养条件（温度、湿度及需氧或厌氧）过滤系统的材质计数方法的验证步骤4.3验证用菌试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌(

Eerhenichin

co)；金黄色葡萄球菌(

Staphylococcus

aureus)；乙型副伤寒沙门菌(

Salmonella

paratyphi

B)；枯草芽泡杆菌(

Bocillus

subtilis)；白色念珠菌(

Candida

albicans)；黑曲霉(

Spergillus

niger)。

计数方法的验证步骤4.4菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1m含菌数为50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5-7天，加入3～5ml含0.05%(m/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2h内使用；若保存在2～8℃，可在24h内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存期内使用。计数方法的验证步骤4.5验证方法验证试验分4组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组对照组和试验组的菌回收率。4.5.1试验组

取最低稀释级的供试液，按每1ml供试液加入50～100cfu试验菌，按菌落计数方法定其菌数。平皿法计数时，取试验菌液、供试液各1m分别注入平皿中，立即倾注球脂培养基：薄膜过滤法计数时，取供试液2ml过滤，冲洗液冲洗，并在最后一次的冲洗液中加入试验菌。4.5.2菌液组取上述试验菌液，测定其加入的试验菌菌数。4.5.3供试品对照组取最低稀释级的供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

计数方法的验证步骤4.5.4稀释剂对照组为考察供试液制备过程中对微生物影响的程度，可用相应的稀液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml含50～100cfu，按供试品组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。4.6回收率计算计数方法的验证步骤4.7结果判定在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。若试验组的菌数回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。计数方法的验证步骤4.7结果判定若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。计数方法的验证步骤微生物数量检查技术知识点5供试品微生物总数的检查方法一、操作过程（一）抽样量和检验量检验量即一次试验所用的供试品量。一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100㎝2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。一般应随机抽取不少于检验用量的3倍量供试品。微生物总数检查（二）供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。微生物总数检查1.液体供试品取供试品10ml,加稀释剂至100ml中混匀，作为1:10供试液。水溶性液体制剂可用混合的供试品原液直接作为供试液。2.固体、半固体或黏稠性供试品一般取供试品10g加稀释剂至100ml中，用匀浆仪或其它适宜的方法，混匀后，作为1:10供试液。微生物总数检查3.特殊供试液制备（1）非水溶性供试品方法1取供试品5g（或5ml），加至含溶化的5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20的供试液。方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1:10的供试液。微生物总数检查（2）非水溶性膜剂供试品

取供试品100cm2，剪碎，加100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，浸泡，振摇，作为1:10的供试液。3.特殊供试液制备方法微生物总数检查（3）肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。微生物总数检查（4）气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。

用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1:10的供试液。微生物总数检查（5）贴剂供试品

取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。

用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。

然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，或以其他方法制备成供试液。微生物总数检查（6）具抑菌活性的供试品

当供试品有抑菌活性时，应消除其抑菌活性后，再依法检查。常用的方法有：培养基稀释法离心沉淀集菌薄膜过滤法中和法微生物总数检查培养基稀释法：取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、真菌及酵母菌的菌数时取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。

每1ml供试液所注的平皿中生长数之和即为lml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。

离心沉淀法：取一定量的供试液,500r/min离心，不超过3分钟，取全部上清液用于细菌检查。

薄膜过滤法：适用于各种抑菌、抗菌、防腐等成分的供试品。取规定量的供试液，摇匀，以无菌操住加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45μm±0.02μm微孔滤膜的过滤器内,减压抽干后，用冲洗液冲洗滤膜3次，每次50-100ml，取出滤膜备检。

中和法：凡含求、砷成防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宣的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液培养基中。

微生物总数检查（三）计数检查

平皿法

薄膜过滤法微生物总数检查1.平皿法采用倾注平皿计数法(1)稀释（10倍递增稀释法）(2)注平板、倒培养基：细菌计数用营养琼脂培养基霉菌及酵母菌计数用玫瑰红钠琼脂培养基；

酵母菌计数用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基

（3）阴性对照试验:稀释液1ml（4）培养:营养琼脂培养基放入30～35℃培养箱中培养3天，玫瑰红钠琼脂培养基和酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基放入23～28℃培养箱中培养5天。微生物总数检查2.薄膜过滤法

取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2

供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。

每种培养基至少制备一张滤膜。阴性对照试验：稀释液1ml

微生物总数检查二、结果判断（一）计数细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。微生物总数检查（二）菌数报告规则细菌、酵母菌选取平均菌落数小于300cfu。霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。微生物总数检查三、相关要求1.药物在检验前，应保持包装的原有状态，不得开启，防止再污染。药物需放置于阴凉干燥处，防止微生物污染，以免影响检验结果。凡已将原包装启开者，应另行取样。2.供试品检验全过程必须符合无菌技术要求，使用灭菌用具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不能用口吹吸。微生物总数检查3.供试品从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。否则可能导致微生物繁殖或死亡而影响计数结果。4.供试品稀释及注皿时应取均匀的供试液，以免造成实验误差。微生物总数检查微生物数量检查技术

供试品微生物总数的检查方法技能点4平皿倾注法接种操作规范4平皿倾注法接种操作规范4.1实训目的学会用平皿法检查口服制剂微生物总数。学会菌落计数方法和报告规则，能规范操作，规范填写实验记录和书写实验报告。4.2实训原理非规定灭菌药剂一般不要求绝对无菌，但必须控制微生物的数量在一定的范围内，并保证不含有特定的控制（致病）菌。2015年版《中国药典》规定采用平皿法和薄膜过滤法进行药品的细菌、真菌及酵母菌计数检查。本实验以葡萄糖酸钙口服液为材料进行平皿法计数。

平皿倾注法接种操作规范4.3实训要求严格遵守实训室管理规章制度。按照实训计划进行操作。认真分析和讨论实训中出现的问题。尊重实训结果的科学性。完成实训任务,达到实训目的。

平皿倾注法接种操作规范4.4实训内容4.4.1实验环境无菌室、超净工作台。4.4.2设备、仪器仪器、试剂、菌种及培养基设备恒温培养箱30～35℃、生化培养箱23～28℃、匀浆杯。仪器菌落计数器、锥形瓶(250～300ml,500ml,1000ml)、培养皿(直径

9cm)