基于梅花鹿感染布鲁氏菌的检测技术

1基于梅花鹿感染布鲁氏菌的检测技术本标准规定了诊断梅花鹿感染布病所用的常规分离鉴定、qPCR检测方法及血样ELISA检测技术的LY/T2017养鹿场良好管理规范NY5027无公害食品畜禽饮用水水质4缩略语Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreactioqPCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-timepolymeras25.3精液采样器。5.4高速台式冷冻离心机，可控温至4℃,离心速度可达12000g以上。5.6涡旋震荡仪。5.7无菌注射器或EP管。5.10恒温水浴锅：0℃~1005.12高压灭菌锅。5.14洗板机。5.15恒温培养箱。5.16酶标仪。3导致仔鹿很难成活。在分娩的流产物和奶液中含有大a）采血：从病鹿颈静脉采集约5mL血液，或从母鹿采集5mb）收集：将采集的血液放入无菌试管中。c)离心：将试管放入离心机，以2000转/分对于采集的鹿的组织样品及疑似感染病料按以下方法处理并接种于培养基,样品采集按照GB/Tb）病料采集：增加病料采集的种类，这可能包括血液、尿液、粪便、组织切片等，每种病料都应d)标记和记录：详细记录样本的采集时间、地点、动物标识和采集者信息，并在样本容器上进行e)运输：样本应在适宜的条件下运输至实验室，以保持b)细菌的分离：取5g组织剪成小块,加入10mL无菌PBS缓冲液进行研磨后,取200μL接种于选择光泽，半透明。从上面看，菌落微隆起，灰d）染色观察：用移液器吸取结晶紫稀释染液（制），e)观察和记录：在培养过程中，定期观察样本的生长情4f)后续分析：根据培养结果，进行进一步的分析和检测，如PCR、ELISA、9.1主要试剂灭菌双蒸水或去离子水，细菌基因组提取试剂盒，qPCR扩增预混液，引物（上下游引物浓度分别为12.5μmol/L，探针浓度为1μmol），可以采用引物BrqPCR-F/BrqPCR-R、探针BrqPCRprBrqPCR-FBrqPCR-RATCGTTTCCGGGTAAAGCGTCGC9.2操作步骤1-2µLBrqPCR-F1µLBrqPCR-R1µL2.5µL3µL3µL5µL9.2.2每次进行qPCR反应时应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照是以扩增），程中，同时对HIbuffer缓冲液进行提取后的DNA。9.2.4质控标准如果阳性对照扩增曲线有明显对数扩增曲线，且Ct值≤25，阴性对照扩增曲线无Ct值显示，说明质59.2.5结果判定），加入工作浓度的HRP标记兔抗鹿IgG抗体，100µL封口膜，甩掉孔内液体，每孔加300µL洗涤液，洗涤3次，每次1min，最后一次拍干。加入TMB底物溶液，100µL/孔，37℃避光孵育10min。6P（标准阳性血清）/N（标准阴性血清）≥4或PCX-NCX>0.15，NCX≤0.3说明质控合格。其中NCX（标准阳性血清的平均）=[NC1A(450)+NC2A(450)]/2；PCX（标准阴性血清的平均）=[PC1A(450)+PC2A(450)计算S/P：S/P=（样本OD450平均值-NCX）/（PCX-NCX）若S/P＞0.29，判为布鲁氏菌抗体阳性，若S/7A.1基础培养基琼脂15g～20g；蛋白胨10g；氯化钠加水1000mL上述成分混合，加热使琼脂溶化，然后调pH至7.8，再将培养基分装三角瓶中，然后置20磅(1磅≈0.00689MPa)高压灭菌A.2血清葡萄糖培养基A.3选择培养基在1000mL血清葡萄糖培养基中加入下列成分，即为选择若培养羊种布鲁氏菌，需1000ml血清葡萄糖培养基中加入8A液和B液充分混合后即为储备液。储备液应在密封瓶中4℃避光保存，可使用3个月。9引物BrZL-F/MSZL-R（25pmol/µL）、胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒、pMD-19T质粒、感受态上游引物BrZL-F：5'-TGGCTCGGTTGC下游引物BrZL-R：5'-CGCGCTTGCCTT用胶回收试剂盒回收PCR产物，与pMD-19T克隆载体连接，布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12~16h。筛选出C.5.2根据扩增情况从中选取5~6个点制作适合标准曲线要求的标准超声波细胞破碎仪，恒温摇床，制冰机，紫外可见分光光度引物（25pmol/µL）,BamHI限制性内切酶，XhoI限制性内切基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），His标签蛋白纯化试剂盒，LB培养基，一次性针头滤器（孔径D.3序列合成及表达载体的构建D.4.1取A.3中的菌液，以1:100的00r/min震荡培养至菌液OD600值0.6～0.8，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，诱导培养5h。/min离心10min，弃上清。D.4.4用15mLpH7.4PBS重悬沉淀，充分吹散混匀，将离心管置于碎冰中，再放到超声波细胞破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序，超声破碎30D.4.7纯化后的蛋白溶液，用0.45µm一次性针头滤器过滤除菌。D.4.8用紫外可见分光光度计测定蛋白的浓度，蛋白浓度达到0.D.4.9用高效液相色谱法进一步纯化并分析蛋白纯度，纯度达到90%以上符合要求。Na2CO3NaHCO3200mL将Na2CO3和NaHCO3加入去离子水中，完全溶解后，用0.45μm一次性针头滤器过滤除菌，室温保