酶的非水相催化

关于酶的非水相催化水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？？第2页,共77页，星期六，2024年，5月长期的观点认为:

有机溶剂是酶的变性剂、失活剂这一传统酶学思想的影响下，酶在有机介质中催化作用的研究此前几乎毫无进展。20世纪60年代发现有几种酶在有机溶剂中仍具有活性。1984年，

A.M.Klibanov在Science上发表“EnzymaticCatalysisinOrganicMediaat100℃”

，使原来认为生物催化必须在水溶液中进行的酶学概念发生了革命性的变化。第3页,共77页，星期六，2024年，5月一、酶非水相催化的概念和意义

酶在非水介质中的催化反应称为酶的非水相催化(enzymaticnon-aqueouscatalysis,enzymecatalysisinnon-aqueousphase)

是通过反应介质的改变，影响酶的表面结构和活性中心，从而改变酶的催化特性。第4页,共77页，星期六，2024年，5月意义：1.改变了有关酶催化反应的传统观念在传统概念中酶是催化水溶性底物的反应，在有机溶剂中不仅不能反应，还会引起酶蛋白的变性但实验证明，这种想法是片面的，在含微水（1%）的有机溶剂中，酶不仅能催化特殊的反应，而且稳定性会显著提高1984年，克利巴诺夫（Klibanov）第5页,共77页，星期六，2024年，5月意义：2.发展了酶学的理论体系

-----non-aqueousenzymology

3.扩展了酶的应用领域

多肽、酯类的合成，甾体转化，手性药物的拆分第6页,共77页，星期六，2024年，5月二、酶非水相催化的主要内容1.有机介质中的酶催化*酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。

适用于底物或产物为疏水性物质的酶催化作用。2.气相介质中的酶催化

适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。3.超临界介质中的酶催化

超临界流体是温度和压力超过某物质超临界点的流体。

4.离子液介质中的酶催化离子液（ionicliquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类。第7页,共77页，星期六，2024年，5月超临界流体的概念

指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力；然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍。超临界流体

第8页,共77页，星期六，2024年，5月超临界流体对多数酶都能适用，酶催化的酯化、转酯、醇解、水解、羟化和脱氢等反应都可在此体系中进行，但研究得最多的是水解酶的催化反应。这种溶剂体系最大的优点是无毒、低粘度、产物易于分离。

第9页,共77页，星期六，2024年，5月超临界流体的粘度介于气体与液体之间，其扩散性比一般溶剂高1-2个数量级。超临界气体在临界点附近的温度或压力有一点微小的变化都会导致底物和产物溶解度的极大变化，因而很容易调控超临界流体中酶催化反应的特性，如反应速率和选择性。第10页,共77页，星期六，2024年，5月

该体系的缺点是需要有能耐受几十个兆帕的高压容器，并且减压时易于使酶失活。此外，有些超临界流体如二氧化碳可能会与酶分子表面的活泼基团发生反应而引起酶活性的丧失。第11页,共77页，星期六，2024年，5月性质（1）超临界流体的P-V-T性质流体名称乙烷丙烷丁烷戊烷乙烯氨CO2二氧化硫水临界温度（℃）32.396.9150.0296.79.9132.431.1157.6374.3临界压力（Mpa）4.263.83.385.1211.287.387.8822.114.88临界密度(g/cm3)0.2200.2280.2320.2270.2360.4600.5250.3260.203第12页,共77页，星期六，2024年，5月（2）所谓超临界CO2是指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1℃，临界压力7.28Mpa)时的状态。该流体具有无毒、无臭、不燃等优点。第13页,共77页，星期六，2024年，5月三、酶非水相催化的主要特点1.酶的热稳定性提高3.水解酶可以在非水介质中

催化水解反应的逆反应2.酶的催化活性有所降低5.酶的底物特异性和选择性有所改变4.非极性底物或者产物的溶解度增加a.酶结构刚性增强，空间构象更加稳定b.水含量有限（酶分子的不可逆变性过程中，水是一个必要的参与者）第14页,共77页，星期六，2024年，5月

1、有机溶剂与微量水组成的微水介质体系2、水与亲水性有机溶剂组成的互溶体系3、水与疏水性有机溶剂的双液相体系四、有机溶剂反应体系不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。

第15页,共77页，星期六，2024年，5月五、水对有机介质中酶催化反应的影响水的重要性：水是酶分子的“润滑剂”。必需水：水是酶催化反应的必需条件，维持分子完整的空间构象所必需的最低水量称为“必需水”

（essentialwater)。各酶必需水含量不一，通常<1%，如猪胰脂肪酶（催化三丁酸甘油酯）为0.95％。提示：必需水在酶反应中并非直接参与者，只起维持酶活性构象作用。1.水对酶分子空间构象的影响第16页,共77页，星期六，2024年，5月水对有机介质中酶催化反应的影响有机介质中水含量与反应速率的关系最适水含量随着溶剂极性的增加而增加反应体系的最适水含量与酶的种类、有机溶剂的种类等变化而有所差别。2.水含量对酶催化反应速度的影响

猪胰脂肪酶催化三丁酸甘油酯与正庚醇转酯反应速率与水浓度的关系第17页,共77页，星期六，2024年，5月必需水维持酶的催化活性；无水条件下，酶分子表面的带电基团和极性基团会因相互作用而形成“锁定”的失活构象，即：有机溶剂的低介电常数往往会导致蛋白质带电基团之间更强的静电作用，使酶的“刚性”更强；

含水量过低时，酶构象过于“刚性”而影响或失去催化活性；含水量过高，酶结构的柔韧性过大，会引起酶结构改变而失活。酶活最大时——蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性（柔性）之间达到最佳平衡点。必需水对酶活的影响：第18页,共77页，星期六，2024年，5月ONHCOHNHO分子内氢键分子间氢键酶分子的结构特点：“刚性”“韧性”刚性：生物大分子结构的精确性柔性：生物大分子局部区域具有一定的可运动性。刚-柔并存第19页,共77页，星期六，2024年，5月六、有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响1.有机溶剂对酶结构与功能的影响1）对酶分子表面结构的影响2）对酶活性中心结合位点的影响：部分溶剂能渗入到酶分子的活性中心，与底物竞争活性中心的结合位点，降低底物的结合能力，从而影响催化能力第20页,共77页，星期六，2024年，5月2.有机溶剂对酶活性的影响有机溶剂的强弱可用极性系数lgP表示（P是指某种溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数）极性系数越大，表明极性越弱；反之极性系数越小，则极性越强。酶活性与lgP的相关性：lgP≤2极性溶剂中

酶活力较低lgP为2～4中等极性溶剂中

中等酶活力lgP＞4非极性溶剂中

高的酶活力第21页,共77页，星期六，2024年，5月3.有机溶剂对底物和产物分配的影响有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度一般选用2<=lgP<=5的有机溶剂作为有机介质适宜酶水有机溶剂第22页,共77页，星期六，2024年，5月七、非水介质中酶的性质

由于受到非水介质的影响，改变底物存在的状态及酶与底物相结合的自由能，从而影响到酶的一些主要性质。第23页,共77页，星期六，2024年，5月1.热力学稳定性

由于在微水状态构象的刚性，而且缺少在水中引起不可逆热失活的共价反应，因此酶在微水的有机溶剂中具有非常好的热稳定性。第24页,共77页，星期六，2024年，5月第25页,共77页，星期六，2024年，5月某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性

酶

介质条件

热稳定性猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯水，pH7.0T1/2<26hT1/2<2min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/2=1.5hT1/2<2min脂蛋白脂肪酶甲苯，90℃，400h活力剩余40％胰凝乳蛋白酶正辛烷，100℃水，pH8.0,55℃T1/2=80minT1/2=15min枯草杆菌蛋白酶正辛烷，110℃T1/2=80min核糖核酸酶壬烷，110℃，6h水，pH8.0,90℃活力剩余95％T1/2<10min酸性磷酸酶正十六烷，80℃水，70℃T1/2=8minT1/2=1min腺苷三磷酸酶(F1-ATPase)甲苯，70℃水，60℃T1/2>24hT1/2<10min限制性核酸内切酶

（HindⅢ）正庚烷，55℃，30d活力不降低β-葡萄糖苷酶2-丙醇，50℃，30h活力剩余80％溶菌酶环己烷，110℃水T1/2=140minT1/2=10min第26页,共77页，星期六，2024年，5月2.酶在有机介质中的底物特异性与选择性2.1底物专一性

酶具有区分两个结构相似的不同底物的能力，取决于底物疏水性能的差异。ie.胰凝乳蛋白酶在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。N-乙酰-L-丝氨酸乙酯N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯疏水作用

水、辛烷第27页,共77页，星期六，2024年，5月2.2对映体选择性对映体选择性：酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力。也叫立体异构专一性。立体选择系数KLD：表示对映体选择性的大小Km：米氏常数Kcat：酶的转换数2.酶在有机介质中的底物特异性与选择性第28页,共77页，星期六，2024年，5月2.2对映体选择性立体选择系数越偏离1，酶催化的对映体选择性越强。酶在水溶液中催化的对映体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中对映体选择性较差。所以，增加水含量能提高对映体选择性。第29页,共77页，星期六，2024年，5月2.2对映体选择性意义：手性药物的合成例如，某些蛋白酶在水溶液中对L-氨基酸起作用，而在有机介质中可用D-氨基酸为底物合成手性药物。第30页,共77页，星期六，2024年，5月2.3区域选择性

1，4-二丁酰基-2-辛基苯乙腈甲苯酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性（regioselectivity），即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。第31页,共77页，星期六，2024年，5月2.4键选择性键选择性：同一个底物分子中有两种以上化学键可与酶反应，酶对其中一种优先反应。例：6-氨基-1-己醇的选择性酰基化6-氨基-1-己醇第32页,共77页，星期六，2024年，5月3.分子记忆

对配体的记忆功能分子记忆根据分子识别理论，酶与配体的诱导、相互作用改变酶的构象，能够获得与配体类似物结合能力的酶，这种由配体诱导产生酶记忆的方法，称为分子记忆（molecularmemory)第33页,共77页，星期六，2024年，5月有机相生物印迹酶

枯草杆菌蛋白酶溶液

含N-Ac-Tyr-NH2

冻干除去抑制剂枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶溶液

不含N-Ac-Tyr-NH2

冻干枯草杆菌蛋白酶在辛烷中催化酯化反应的速度比较：反应（1）中得到的酶比反应（2）中得到的酶高100倍在水溶液中其活性

：相同（1）（2）第34页,共77页，星期六，2024年，5月＋酶蛋白抑制剂冻干除去抑制剂有机溶剂水溶液枯草杆菌蛋白酶的分子记忆第35页,共77页，星期六，2024年，5月分子印迹技术原理：

竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。分子记忆:酶蛋白分子在有机相中具有对配体的“记忆”功能。第36页,共77页，星期六，2024年，5月4．pH记忆pH记忆：有机溶剂中的酶能够保持它冷冻干燥前或吸附到载体上之前所在缓冲液中的pH。因为酶在冻干或吸附到载体之前，先置于一定pH值的缓冲液中，缓冲液的pH值决定了酶分子活性中心基团的解离状态。酶在有机介质中催化的最适pH通常与在水溶液中催化的最适pH相同或接近第37页,共77页，星期六，2024年，5月八、有机介质中酶催化反应的影响因素及其控制1、酶的种类及浓度

不是所有的酶都能在有机溶剂中催化反应的。

已报道的酶类有：脂肪酶、蛋白酶、过氧化氢酶、醛缩酶、多酚氧化酶、醇脱氢酶ATP酶、细胞色素氧化酶、胆固醇氧化酶等。第38页,共77页，星期六，2024年，5月2.有机溶剂的选择有机溶剂的极性：疏水性参数lgPlgP↓，疏水性↓，极性↑；有机溶剂越容易抢夺结合水、破坏水化层lgP↑，极性↓；疏水性底物难溶于有机溶剂，反应难以进行一般选择2≤lgP≤5的有机溶剂第39页,共77页，星期六，2024年，5月3.水含量的控制最适水含量——通过实验确定水含量对PSL(假单胞菌脂肪酶)催化酯合成速率的影响：

在最适含水量时酶催化反应的速率最大。第40页,共77页，星期六，2024年，5月4.温度的控制最适温度有机介质的最适温度高于水中的最适温度（水含量变小，热稳定增强）通过实验确定温度↑，立体选择性↓第41页,共77页，星期六，2024年，5月5.pH值的控制pH印记现象酶在冷冻干燥过程中，pH状态发生变化。因此，要加冷冻干燥保护剂可在有机介质中加入有机相缓冲液调节反应时的pH值第42页,共77页，星期六，2024年，5月Klibanov：酶在有机溶剂中活力低的原因及其解决原因说明解决办法扩散限制不少学者认为如此增加搅拌速率；减小酶颗粒尺寸封闭活性中心酶活有一定程度下降采用结晶酶替代构象改变冻干及脱水过程造成使用冻干保护剂底物脱离溶剂束缚能力差对疏水性底物尤其显著选择合适溶剂过渡态不稳定过渡态暴露于溶剂选择合适溶剂构象柔性降低无水溶剂尤为严重使水活度最适化亚最适pH值降低至少99%的酶活力从酶最适pH的水溶液中脱水；使用有机相缓冲液第43页,共77页，星期六，2024年，5月九、有机介质中酶催化反应及应用1、酶催化反应的类型合成反应（水解反应的逆反应）转移反应（酯与有机酸）醇解反应氨解反应异构反应氧化还原反应裂合反应第44页,共77页，星期六，2024年，5月（1）合成反应水解酶在有机介质中能催化水解的逆反应，即合成反应（why？）例：假单胞菌脂肪酶第45页,共77页，星期六，2024年，5月（1）合成反应蛋白酶在有机介质中能催化多肽的合成第46页,共77页，星期六，2024年，5月（2）转移反应酯交换反应（转酯反应）例：猪胰脂肪酶对外消旋体的拆分：第47页,共77页，星期六，2024年，5月（3）醇解反应醇解反应：酰卤、酸酐、酯等被醇分解，生成酯和其他化合物的反应例：假单胞脂肪酶催化酸酐醇解生成二酸单酯化合物第48页,共77页，星期六，2024年，5月（4）氨解反应脂肪酶催化酯类转变成胺类第49页,共77页，星期六，2024年，5月（5）异构反应D-ACL（D-3-amino-2-

-caprolactam）的异构化第50页,共77页，星期六，2024年，5月（6）氧化还原反应羰基的还原反应第51页,共77页，星期六，2024年，5月（7）裂合反应/加成反应羰基的加成反应第52页,共77页，星期六，2024年，5月2、应用实例

酶

催化反应

应用

脂肪酶

肽合成

青霉素G前体肽合成

酯合成

醇与有机酸合成酯类

转酯

各种酯类生产

聚合

二酯的选择性聚合

酰基化

甘醇的酰基化蛋白酶

肽合成

合成多肽

酰基化

糖类酰基化羟基化酶

氧化

甾体转化过氧化物酶

聚合

酚类、胺类化合物的聚合多酚氧化酶

氧化

芳香化合物的羟基化

胆固醇氧化酶

氧化

胆固醇测定醇脱氢酶

酯化

有机硅醇的酯化第53页,共77页，星期六，2024年，5月酶非水相催化的应用手性技术领域手性药物拆分手性聚合物制备功能性聚合物制备可降解高分子光电功能材料其他应用食品添加剂生产甾体药物转化生物柴油的生产第54页,共77页，星期六，2024年，5月脂肪酶的非水相生物催化短链脂肪酸酯短链脂肪酸酯，是一大类十分重要的香味剂，具有多种天然水果的香味。中国，短链脂肪酸酯每年的产量为几千吨，己酸乙酯和丁酸乙酯，在国内酿造业的需求分别是3000t/at/a，1000t/a。食品中常用的乙酸乙酯（白酒、白兰地，还常用于冰激凌、糖果、面包等食品中），3000t/a。我国在食品、饮料和医药工业中每年使用价值上亿元的芳香酯。缺点：国际上化学法生产丁酸乙酯产品价格仅为2-5美元/kg，生物催化法价格180美元/kg。第55页,共77页，星期六，2024年，5月微生物脂肪酶根霉属是微生物是脂肪酶的重要生产菌，分离得到超过30种脂肪酶，已被制成商品化酶制剂，德列马根霉、华根霉、米根霉、无根根霉、黑根霉、日本根霉、雪白根霉。不同来源的脂肪酶在选择性上有所不同，来自根霉的脂肪酶大多具有高度的1、3位置专一性。应用：芳香酯、生物柴油、手性化合物

第56页,共77页，星期六，2024年，5月脂肪酶产生菌筛选：三丁酸甘油酯或吐温-80为底物的透明圈法；在橄榄油琼脂平板加入罗丹明B的荧光圈法。如Torres等人以三丁酸甘油酯平板为初筛、在异辛烷中催化合成油酸丙酯的能力为复筛。从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株华根霉，全细胞脂肪酶在庚烷中催化合成己酸乙酯的转化率较高，并适用于催化其他短链芳香酯的合成。第57页,共77页，星期六，2024年，5月

生产工艺碳源：葡萄糖常对产酶有抑制作用，常用脂肪酸和脂类物质，除了作为碳源外，还可作为产脂肪酶的诱导剂。少根根霉产脂肪酶受玉米油诱导。氮源：米根霉脂肪酶，蛋白胨适用于胞外酶的产生，胰蛋白胨有利于胞内酶的产生。发酵条件：除了pH、温度，氧起到重要的作用，氧传递速率比溶解氧影响更大。在菌体量相同的情况下，改善通风、增强搅拌等提高氧传递速率，提高酶活。正己烷反应体系，极性中等，转化率最高。第58页,共77页，星期六，2024年，5月2.1手性药物的拆分手性（chirality)化合物是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物。目前世界上化学合成药物中的40%左右属于手性药物。第59页,共77页，星期六，2024年，5月手性药物拆分手性（chirality）化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物。

手性药物：含单一对映体或两种异构体的药物。第60页,共77页，星期六，2024年，5月光学活性物质：能使平面偏振光旋转的化合物为光学活性物质。手性：一个具有光学活性的有机物不能与它的镜像重合。对映异构体：两个互为镜像但不能重合的对映体称为对映异构体，它们旋光能力相同，但方向相反。外消旋体：等量对映异构体的混合物没有光学活性，成为外消旋体。外消旋体拆分：即利用拆分技术将外消旋体的两个对映体分开。通过外消旋体的拆分可得纯的光绪活性物质。第61页,共77页，星期六，2024年，5月药物立体异构药效的显著差异的根本原因是生物体的对称性破缺。人体内的几乎所有生物大分子，也就是药物作用的一般靶点，基本都是具有手性的。因此，一对几何上对称的景象异构进入人体以后，因被机体作为完全不同的物质处理，而具有显著的药效差异。某些药物的一种对映体有显著治疗作用，而另一种对映体几乎无作用。第62页,共77页，星期六，2024年，5月手性药物两种对映体的药效差异一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效一种有显著疗效，另一种有毒副作用两种对映体的药效相反两种对映体具有各自不同的药效两种消旋体的作用具有互补性第63页,共77页，星期六，2024年，5月生物催化反应第64页,共77页，星期六，2024年，5月手性药物两种对映体的药理作用第65页,共77页，星期六，2024年，5月沙利度胺（Thalidomide）--------天使还是魔鬼？俗名“反应停”，早期作为怀孕妇女的止呕药使用R-(+)-沙利度胺为镇静止呕药

S-(-)-沙利度胺有致畸作用

50年代末，在欧洲出现数千例短肢畸胎新生儿，一度震惊全世界第66页,共77页，星期六，2024年，5月手性药物两种对映体的药理作用

药物名称有效对映体的作用另一种对映体的作用普萘洛尔（Propranolol）萘普生（Neproxen）青霉素胺（Penicillamine）羟基苯哌嗪(Dropropizine)反应停（Thalidomide）酮基布洛芬（Ketoprofen）喘速宁（Trtoquinol）乙胺丁醇（Ethambutol）萘必洛尔（Kebivolol）S构型，治疗心脏病,β-受体阻断剂S构型，消炎、解热、镇痛S构型，抗关节炎S构型，镇咳S构型，镇静剂S构型，消炎S构型，扩张支气管S,S构型，抗结核病右旋体，治疗高血压,β-受体阻断剂R构型，钠通道阻滞剂R构型，疗效很弱R构型，突变剂R构型，有神经毒性R构型，致畸胎R构型，防治牙周病R构型，抑制血小板凝集R,R构型，致失明左旋体，舒张血管1992年，美国FDA明确要求对于具有手性特性的化学药物，都必需说明其两个对映体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况。第67页,共77页，星期六，2024年，5月

20世纪90年代后，许多国家规定，凡结构中具有不对称因素的药物，即“手性药物”，必须拆分其相应的立体异构体，并分别研究其药理、毒理和药物代谢性质。对已上市的消旋体药物，要重新评价其光学异构体