优良菌种选育(原生质体融合)

原生质体融合自然突变选育：几率低诱变选育：缺陷性，可获得大量突变株杂交育种：也可获得多数重组子，须亲和性原生质体融合：融合子，个数少基因工程技术：定向培养

优良菌种选育——要点原生质体(Protoplast)

大多数微生物细胞具有细胞壁。采用一定技术去掉细胞壁，剩下的细胞部分称之为原生质体。任何形状的细胞去掉细胞壁后都呈球形。

原生质体融合从动植物细胞的研究发展起来，然后应用于真菌，放线菌，细菌微生物有性重组局限性大，自然杂交现象少借助原生质体融合技术实现遗传物质的交换原生质体融合的优越性打破属种的界限，扩大重组范围。受限制小，没有供体受体之分，有利于不同种属重组频率高，放线菌10-2～10-1，真菌10-3～10-2，细菌10-6～10-5遗传物质传递更充分应用于诱变：原生质体对理化因子敏感（温度，药物，紫外线），诱变率更高。原生质体制备原生质体纯化原生质体融合融合子检出融合子鉴定原生质体融合步骤超声波处理菌体释放原生质体酶解细胞壁释放原生质体微生物原生质体制备原生质体制备（酶法）微生物细胞壁组成不同，须采用不同的方法革兰氏阳性菌：甘氨酸，适当青霉素添加培养，溶菌酶（Lysozyme）革兰氏阴性菌：溶菌酶常用酶：溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶，在等渗溶液中制备，防止细胞破裂种类纤维素几丁质其它多糖疫霉属25065毛霉属0944酵母属0160镰刀菌属03929裂褶菌属0581鬼伞属03350真菌的细胞壁成分几丁质酶Chitinase纤维素酶Cellulase

酵母裂解酶Zymolyaseβ1,3葡聚糖酶

蜗牛酶

商品酶

Novozyme234来自Trichodermaharzianum

Lywallzyme广东微生物研究所溶壁酶

Glucuronidase葡聚糖苷酸酶

处理真菌用酶酶解时间：20min-7h左右，一般细菌酶解时间较短，真菌酶解时间较长。pH值：细菌如枯草芽孢杆菌最适pH7.5-8.5，低于pH7对原生质体的制备率影响较大。真菌如黄青霉菌最适pH为5.5，在pH值4.0-8.0范围内均可释放原生质体。预处理剂：青霉素，巯基乙醇，二硫苏糖醇渗透压稳定剂：KCl，NaCl，CaCl2，MgSO4，蔗糖，甘露糖，山梨醇。一般丝状真菌比较适宜以无机盐为稳压剂，酵母菌则使用糖醇做稳压剂比较好。原生质体释放有关的因素

菌体培养：液体培养,固体培养

收集菌体：过滤收集，离心收集,

洗涤菌体：等渗液冲洗，等渗液与酶液相同

酶解处理：保温酶解，离心去酶

过滤分离：过滤去掉未分解菌丝体

差速离心：收集大小密度均一的原生质体

低速离心弃沉淀物，高速离心弃上清液，得纯化原生质体。原生质体制备程序

菌株A菌株B

液体培养液体培养

收集菌体收集菌体

洗涤菌体洗涤菌体

酶解释放原生质体酶解释放原生质体

分离纯化原生质体分离纯化原生质体

AB原生质体等量混合

原生质体融合再生原生质体融合操作程序原生质体的融合方法

－16－原生质体融合方法自发融合诱导融合融合概率低，一般不推荐化学诱导融合电诱导融合激光诱导融合不需要仪器，操作简单，但PEG对细胞有毒性，原生质体融合率低无毒无害，直观操作，融合率较高，但需要在专门的电融合仪毒性小，损伤小，但由于其所需设备昂贵复杂，操作技术难度大，很难推广应用电诱导融合PEG结合高Ca2+、pH诱导法化学诱导融合原理：原生质体表面带有负电荷(-10mvto-30mv)，相互间有较强排斥作用，PEG是一种特殊脱水剂，可在原生质体膜间起中介作用，改变质膜流动性，降低原生质体质膜表面势能，加入Ca2+时，改变膜表面分子分布，造成接触处的质膜形成局部融合，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两原生质体全部融合聚乙二醇(PEG)的选择

分子量：一般以PEG1000-6000较为适用，不同种类微生物对PEG分子量的要求不尽相同放线菌适用分子量为1000-1500真菌一般采用4000-6000细菌用1500-6000浓度：PEG常用浓度为30%-50%，酵母菌常用浓度在20%-35%，真菌在30%左右，链霉菌适宜浓度为50%①亲本的遗传标记（营养缺陷型）：在基本培养基上选出融合子，使只有A+B+型融合子才可能再生出来，而同一种的融合子或未能融合的原生质体无法再生。

融合子检出策略②原生质体灭活：

诱变形的遗传标记往往也会使一些优良性状丧失。

采用碘代乙酰胺和焦磷酸二乙酯分别灭活处理真菌原生质体，使处理后的原生质体失去再生能力，而又对遗传物质无损伤，当两种采用不同灭活剂处理的原生质体融合后，可以完成代谢互补，使融合子恢复再生能力。融合子检出策略③荧光染色：在获得原生质体后，分别用不同的荧光素染色亲本原生质体，随后融合，融合后于紫外光显微镜下挑取融合子。融合子发出两种亲本混有的颜色。融合子检出策略荧光染色对筛选出的融合子必须进行鉴定，以确定其融合子特性细胞结构水平:单核→双核，特殊结构形成遗传本质：特定基因序列的检出，PCR生长发育特性：个体形态特性融合子的鉴定菌体的生长时期：菌体旺盛生长期，对数生长期。菌体预处理：在棒壮杆菌处理时加入氨苄青霉素有利与原生质体释放，巴氏梭状芽孢杆菌培养时加1.5％乳糖可提高再生率渗透压稳定剂：Ca2+、Mg2+，蔗糖可保持原生质体稳定利于再生酶解条件：

时间：随酶解时间的增加原生质体的释放量增大

浓度：到达一定浓度后，原生质体的再生率下降

温度：菌体最适生长温度稍微偏下。影响原生质体活性的因素细菌易再生：可达90％甚至100％

放线菌：50％

丝状真菌“产黄青霉”：40~60％影响原生质体存活的遗传因素较低温度可以有效的保持原生质体的活性

细菌4℃48小时

放线菌4℃24小时

真菌0~4℃保存48小时原生质体贮存条件再生培养基：保护又支持营养的功能再生培养温度：找出菌种的最适生长温度。过高温度对原生质体再生有抑制作用，当再生温度略低于菌株培养温度时，有利于原生质体的再生。操作方式：涂布培养法，注意涂布时对原生质体有损固体培养：一般认为固体培养优于液体培养

原生质体再生培养注意事项用MgSO4、甘露醇、山梨糖、蔗糖为渗透剂，不同的微生物种类应选择不同的再生培养基。营养因子，酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖类原生质体保护剂扩张剂：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、明胶等对原生质体具有保护作用，同时起到原生质体扩张剂作用，刺激原生质体再生。加入再生细胞壁诱导物与前体物质：在培养基中加明胶、细胞壁残片甚至纤维素都有刺激原生质体再生的功能再生培养基固体培养：一般认为固体培养优于液体培养液体培养：液体培养时细胞壁可溶性物质很容易扩散（如酵母在液体再生液中很难再生）固体培养基限制有效分子的扩散。但先在液体培养基中预培养2~3小时有利于提高再生率。培养方法对原生质体再生的影响３.原生质体融合技术

在微生物育种中的应用选育高产优质菌株 酿酒酵母——葡萄糖→酿酒 糖化酵母——淀粉和糊精→葡萄糖 ↓原生质体融合

融合子——淀粉和糊精→葡萄糖→酿酒选育高产优质菌株地衣芽孢杆菌——蛋白酶，容易被噬菌体感染

抗噬菌体菌株——抗噬菌体↓原生质体融合融合子——蛋白酶+抗噬菌体产生新的产物

代谢途径融合，方向改变

庆丰霉素产生菌

井冈霉素产生菌

↓

融合子

聚醚类抗生素+环状多肽类1．多细胞菌体的单细胞化作用

2．真菌双核体单核化作用

3．菌体脱壁再生优良菌株原生质体

4．原生质体转化《原生质的其他用途》1．多细胞菌体的单细胞化作用

许多真菌营养体是多细胞的，当进行诱变处理时，首先应进行单细胞化，采用脱壁形成的原生质体，可以用于诱变处理。2．真菌双核体单核化作用

许多高等单子菌的次生菌丝是双核体，通过原生质体释放再生过程可以单核化，可以用于诱变处理。脱壁再生的菌株具有很大的差异性，从生长速度、代谢活性上面都表现出差异，通过原生质体释放再生出来的某些菌种可提高产量。

原因 1.突变率提高

2.对菌体细胞刺激作用3菌体脱壁再生筛选优良菌株

原生质体更易吸收外源DNA完成转化过程，原生质体作为“感受态”细胞与待转化DNA混合在一定浓度CaCl2作用下进行转化。4原生质体转化1970用硝酸钠诱导植物原生质体融合1972用硝酸钠进行了烟草种间原生质体融合1972以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成1974发现PEG是一种良好的融合剂用于原生质体融合1976以曲霉，青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成1976巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功1977链霉菌原生质融合并获融合重组子1978用PEG+高pH-C