CHRONO-LOG 560Ca 中文手册注册用

...wd......wd......wd...CHRONO-LOG560Ca全血血小板聚集分析系统操作手册仅供体外诊断使用用于检测全血或富血小板血浆的血小板聚集和ATP释放，另外可以检测钙离子流。目录总括与说明—————————————————————————————１血小板聚集实验的原理————————————————————————2光学聚集法――—－—－—－—－—－—－—－—－—－—－—－—3电阻法―――――――――――――――――――――――――――4荧光ＡＴＰ释放法――――――――――――――――――――――4系统特点——————————————————————————————5电阻法―――――――————————————————————5一般特点――――――――――――――――――――――――――5操作说明—————————————————————————————6电阻法――――――――――――――――――――――――――――6光学聚集法――――――――――――――――――――――――――9荧光法(ATP释放)――――――――――――――――――――――――11运行ＡＴＰ标准―――――――――――—————————————12结果―――――――――――――――――――――――――――――――13电阻法―――――――――――――――――――――――――――13光学聚集法――――――――――――――――――――――――――13荧光法(ATP释放)―――――――――――――――――――――――13结果的解释―――――――――――――――――――――――――――14筛选过程――――――――――――――――――――――――――――――16样本要求————————————————————————————16全面的过程――――――――――――――――――――――――——19离子钙，形状改变和在含发光物质的血小板中的聚集―――――――31药物干扰―――――――――――――――――――――――――――――――35不安全性―――――――――――――――――――――――――――――――35保养与服务―――――――――――――――――――――――――――――36电子探针组件――――――――――――――――――36光路与隔膜―――――――――――――――――――36自动定标过程――――――――――――――――――――――――――――37典型聚集释放曲线――――――――――――――――――――――――――附录Ａ总括与说明血管损伤后，血小板粘附于血管的损伤处，聚集、合成前列腺素，释放5-羟色氨、ADP、ATP。前列腺素的合成与释放产物会引起更进一步的聚集。同时血浆凝固开场、凝血酶产生、纤维蛋白形成和血小板栓子堵塞损伤的血管。由于细胞膜糖蛋白、细胞内储存颗粒、血小板酶、血浆凝血因子缺乏常引起过量出血，人临床表现为：鼻衄、损伤、擦伤失血过多。另外,外科手术的患者尽管经常存在血小板功能障碍,但直到出血不止、或术后出血不止才能发现．在1962年,Born描述了用ADP诱导的血小板聚集并改革用比浊计测量富血小板血浆的聚集过程.这种改变包括:预温37度,搅拌和用记录笔记录一定时间内透过光的变化.在1977年，Feinman设计了一台仪器,同时测量血小板聚集和ATP释放。这台仪器利用紫外光测量聚集,在聚集光路的右侧放置敏感的光度计，通过荧光的产生测量ATP的释放.在1980年，Cardinal和Flower设计了电阻法测量全血中的聚集,非常小的电流通过两个电极,当电极刚与血接触时,在其外表会附着一层血小板,当聚集剂参加后,更多的血小板会聚集在其外表,引起电阻增加。电阻法的测量和荧光的测量又构成了一台全血荧光聚集仪。在1984年，Wojenski和Sliver发现了一种快速的方法去进展常规实验室的操作。这种方法就是同时测量聚集和ATP的释放,用血量为5毫升,30分钟内完成检测。这种方法防止富血小板血浆的准备时间。在1985年Johnson创造了一种方法去检测洗涤血小板的钙流,这种方法有利于研究钙离子在血小板聚集中的作用。参考文献血小板聚集实验的原理众所周知，血小板必须在一系列条件和不同试剂存在的情况下才能发生聚集。“血小板聚集〞是一个术语，用来表示血小板与血小板之间的粘附。在全血或富血小板血浆中参加致聚剂，这种现象能被诱发。血小板的聚集有赖于钙离子、纤维蛋白原、单个或多个的血浆因子和致聚剂的存在。使用不同种类和浓度的致聚剂，血小板的聚集也有不同的变化。比方光学法，ADP、肾上腺素、胶原、和瑞斯托霉素被广泛应用于监测和提供最快速的基本诊断信息。这些试剂的选择有其理论依据：ADP和肾上腺素都包含在血小板的储存颗粒中，它们在原始血栓形成时释放出来并诱发进一步的血小板聚集。所以体外的血小板和致聚剂的反响被证明有助于确定出血性疾病的病因。另一方面，胶原虽然在血管的结缔组织中而不在血小板中。但血管损伤后它被认为是第一个聚集或凝固前因子。因此，胶原血小板的体外实验也是非常重要的。其他试剂如凝血酶、瑞斯托霉素、钙离子载A23187、花生四烯酸、凝血因子VIII、血清胺也被用于血小板实验。血小板聚集实验是目前最有用的血小板功能体外诊断实验。它能提供其他技术不可能或很难得到的结果，帮助疾病的诊断以及治疗措施的合理选择。这项实验累积起来的经历描绘了先天和获得性血小板功能障碍的图谱。血小板聚集实验的临床意义是获得性或类似性质的血小板功能缺陷的检测和诊断。参加特定的聚集试剂后，血小板是否聚集是区别不同类型的血小板功能障碍的依据。如下表所示：血小板功能缺陷聚集的研究缺陷ADP诱导聚集胶原诱导聚集瑞氏托酶素诱导聚集血小板无力症减少减少正常血小板减少症正常〔1期〕减少正常假性血友病正常正常异常非类固醇抗炎药正常〔1期〕减少异常三种类型的聚集实验:PRP中的光学聚集法全血中的电阻法ATP释放〔荧光〕的检测光学聚集法血小板的体外聚集可以反映血小板在体内形成初始凝血块的能力。血浆悬液中的血小板通过相对低离心力的离心从经过抗凝处理的血液样本中别离。离心的产物称为富血小板血浆〔PRP〕。贫血小板血浆〔PPP〕的制备是通过血液样本的相对高速离心得到的。Born型聚集仪或光学聚集仪是一个带有一个〔或多个〕加热到37摄氏度样品室的固定波长的分光光度计。同时进展持续的样品搅拌，因为在血小板和血小板的接触是决定血小板体外聚集的必要因素。Chrono-log的样品室设计可以使一束红外线同时通过两个比色杯，一个盛有PRP〔样品〕另一个盛有PPP〔对照〕。硅photodiodes检测可以通过样品的光线：认为ＰＲＰ的透光率是０％或者说是０％聚集；认为ＰＰＰ的透光率是１００％或者说是１００％聚集。Photodiodes检测到的透光率的变化量转化为仪器的记录。双孔双红外线束的设计确保了重复性，并允许同时测量聚集和荧光。每个通道有一个别离的孔用于检测〔ＰＲＰ或洗脱的血小板；０％透光率〕和校正对照〔ＰＰＰ或缓冲液；１００％透光率〕样品。光学聚集量和持续测量的检测样本和对照样本的透光率变化是成比例的。揿下按钮设置好０％和１００％透光率的基线。高灵敏度的双孔双光束的检测系统，在检测样本和对照样本之间仅需３０＊１０９的差异数即可检测。如果样本缺乏以进展准确的检测，聚集输出量将在两条基线检测持续循环以警告操作者。当血小板对刺激物〔兴奋剂；聚集剂〕产生应答而发生变形时，其变大的体积使PRP的透光率降低：这将记录为样本的透光率相对于PPP降低。如果聚集剂的剂量足够大可以引起血小板之间的黏附而形成聚集，越来越多的光线可以通过PRP样本。透光随时间的改变被记录下来，其变化趋向于贫血小板血浆，即到达100%的透光率。体外聚集记录表达的含义：形状变化第一波聚集〔原始聚集〕，可能先背离PRP基线后再回到PRP基线。不可逆的第二波聚集，发生在血小板未知颗粒成分变为刺激物并引发额外的聚集。聚集曲线还可以说明：刺激物〔聚集百分比〕引起的透光率变化的最大值。聚集的范围或速率，每分钟的聚集百分比变化复合聚集剂和配剂常用于血小板刺激。不同的聚集剂刺激血小板聚集的不同途径。不同浓度的兴奋剂可以引出一系列曲线〔剂量应答曲线〕。这些检测组的应答模式与已建设好正常模式和异常模式做对比。普遍认为这些信息与血小板凝血功能成分有关。全血中的电阻法血小板的体外聚集可以反映血小板在体内形成初始凝血块的能力。在抗凝血液中检测血小板，无需从血液中的其他组分中进展血小板别离。由于不需要标本离心来得到光学上的透明细胞悬液，因而可以检测完整的血小板群体。减少检测过程的耗时；血液中有形成分对血小板的影响也能表现出来。全血血小板聚集仪，要求样本加热到37度。要准备可重复使用的搅拌子后一次性搅拌子。将搅拌子和样本一起放到检测杯中。阻抗法聚集与光学法不同。电极要放到检测杯中用于检测。电极有两金属线。仪器检测电极两个电线间的阻抗，而得到结果。在重要的平衡过程中，血小板以单层的形势在金属线暴露的局部，有一个稳定的阻抗值。这个阻抗值为0ohm时的值。当参加聚集试剂后，血小板聚集并包裹到金属线上。会增加电路中的阻抗值。电路中阻抗的变化用ohm显示。参加试剂后仪器通常运行4-6分钟。电阻法的结果通常以下面的方式表示；在测试过程中的ohm每分钟ohm的改变，即斜率。最大聚集率。阻抗的变化直接说明血小板聚集的数量。瑞斯脱酶素诱导的聚集全血阻抗法较敏感。ATP释放〔荧光〕的检测ATP的释放用的荧光检测方法。发光物的测量师是很简单的测量原理。但是大多数的可见光波长很并且很稳定，要求聚集检测过程中的检测杯的透光度要好。后来都用荧光来检测，防止了可见光的干扰。通过加CHRONO-LUME试剂增强光通道对荧光的敏感。CHRONO可同时检测血小板聚集和ATP的释放。光学法检测聚集通过光路的变化在纪录曲线的改变。阻抗法可测全血或PRP。系统特点电阻法电极探针：有２根精细的金属丝组成．探针有根足够长的电线，保证在水或生理盐水的清洗过程中能得到简单的清洁标本量：总计１ml，其中有450ul血．450ul生理盐水，100ulCHRONO-LUME试剂反响杯：普通塑料P/N367搅拌磁棒：Ｔeflon涂层P/N368P/N367搅拌磁棒：disposablesiliconizdedP/N370系统的一般特点搅拌速度:crystal控制前方面板,每个通道能在OFF到1200RPM之间以100RPM为一个单位调节误差+/-1.0%温度:加热模块37℃+/-0.2孵育位:36.5℃+/-1.0℃下,使用1ml反响杯,电气要求:115或230V标本收集标本要求〔全血〕样本采集完成，要求静脉取样的位置损伤面积要小并且没有郁积。常用的诱导剂除了肾上腺素.血液标本用3.2或3.8的柠檬酸钠1:9抗凝。1份抗凝剂9份全血。样本必须用含标准抗凝剂的真空无菌管收集。测试肾上腺素的血液标本抗凝剂要求：在每毫升1.5%的柠檬酸钠中加2U/ML的HEP混合做抗凝剂。取1份抗凝剂9份全血。样本收集不需要禁食，但不能做剧烈运动。不能吸烟。检测前10天或2周制止服用影响血小板功能药物。药物对血小板功能的影响在药物影响一章中有详细说明。样本收集完毕应该立即检测。三小时内必须检测完毕。样本应保存在室温。〔24℃标本要求〔富血小板血浆〕样本采集完成，要求静脉取样的位置损伤面积要小并且没有郁积。血液标本用3.2或3.8的柠檬酸钠1:9抗凝。1份抗凝剂9份全血。标本收集时为了不让血小板激活。用塑料试管或硅化的玻璃管。标本采集前，不能做剧烈运动。不能吸烟。检测前10天或2周制止服用影响血小板功能药物。药物对血小板功能的影响在药物影响一章中有详细说明。标本采集完30分钟就可以用于测试，2.5小时完成实验。样本应保存在室温。〔24℃血浆的准备用颠倒浑匀的方式混合标本，不要使劲摇晃。2、制备富血小板血浆：用100克的离心力15分钟，离心标本。用移液枪吸取PRP放到塑料试管中。试管上标明病人姓名、标本类型。3、制备贫血小板血浆：用2400克的离心力20分钟，离心标本。用移液枪吸取PRP放到塑料试管中。试管上标明病人姓名、标本类型。操作说明电阻聚集法可使用全血、稀释血、富血小板血浆、乏血小板血浆。标本收集参见本手册标本收集一章操作质控和血标本可以平行测定。以下过程采用的是单通道仪器。每个孵育孔内要放置一个干净的含1ml生理盐水的反响杯，以便干净的探针能接触到，不用时保持反响杯的温度。当孵育孔准备好时，放入新反响杯和搅拌磁棒。开场预热。注意：预热一个标本的同时测定另一个标本，将缩短实验时间。翻开开关，等待聚集仪温度显示到37℃放入5个P/N367反响杯至孵育孔中。每个反响杯都放入P/N370或者P/N368搅拌磁棒预热反响杯10分钟。吸取1ml标本到一个已经预热的反响杯中如果测定的是稀释血液，请准备大量的稀释血和无菌等张盐水。或者，在参加血之前，吸取所需的无菌等张盐水到反响杯里预热。总量要到达1ml.。警告：生理盐水稀释全血时，必须使用不含防腐剂的盐水。许多试剂纯的等张生理盐水和一些灌注液、浸液含有诸如苯甲醇之类的抑制血小板聚集和分泌的防腐剂。诊断用途的典型的稀释度为1：2〔1份血，1份盐水〕。其他用途的，血可能要稀释到1：10〔1份血，9份盐水〕。5〕选择Small/Large/Impedance滑动开关上的Impendance档。6〕预热孵育孔内的标本5分钟7〕翻开加热盖，放入含有标本和搅拌磁棒的反响杯。8〕选择需要的搅拌速度，建议1000或者1200rpm9〕将电极探针装配并连接好.560CA在预热孔的前面.而500CA在预热孔的左边.10〕用金属线将电极探针缠绕完整.将金属线放在探针的后面,将加热块的盖子关闭完全.11〕拿下记录笔.翻开记录仪12〕用“Zeroknob〞点，让红色的阻抗取图表中央点。顺时针旋转“Indepancezeroknob〞使红色的阻抗笔移动到右边。逆时针那么到左边。13)温电极，样本会减少其阻抗值让红色的阻抗笔向左移动。当红色的阻抗笔停顿向左移动时，证明电极何比色杯到达了需要的37℃外面。用“Impendancezeroknob〞从新复位。14〕用聚集仪上的“Impendancezeroknob〞将红色的阻抗笔调到最初的纪录。左边的10〔或90〕。15)仪器记录两分钟。以确认基线已经建设。如果曲线往左移动说明样本仍在预温。用“Impendancezeroknob〞根据需要从设置基线。注意：如果曲线往左边走，证明样本中有自发聚集产生。更换样本或检查自发聚集产生的原因。注意：如果曲线往左边走，证明样本中有自发聚集产生。更换样本或检查自发聚集产生的原因。16〕按住聚集仪上的定标按钮，仪器会自动产生标准20ohm的环形阻抗。让红色的阻抗笔往右移动。同时，另一个手用聚集仪上的“impendancegainknob〞在表格中的基线上标记50。这个步骤标定仪器在标准20ohm的阻抗下，记录笔移动40个小方格。顺时针旋转“impedanceknob〞将加快纪录笔的移动速度，逆时针将降低其移动速度。17〕翻开加热块盖，加CHRONO-PAR试剂到样本中。可用P/N388或353微量加样器。注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用microbore时，现在其中装满试剂，后排出试剂，重复操作2-3次。最后根据要求的试剂量排出多余的试剂。将需要的试剂留下。用微量加样器加样时，加样枪头必须到检测杯的底部，并且快速、完全的参加试剂，千万不要将试剂加到样本的上面，这样会使试剂、样本混合不均匀。移走加样枪时，按一下活塞，以阻止样本进入到microbore中。做每个试验都要更换microbore每天的试验完成后都要丢掉microbore。为了保护plunger更换一个干净的microbore。18〕关闭加热块盖子，仪器纪录反响时间内的曲线。1-6分钟。19〕试验完成，拿走纪录笔，关掉记录仪。20〕翻开加热块盖子，从样本中取走电极。如果用的是P/N370一次性搅拌子,扔掉检测杯和搅拌子,如果用的是P/N368可重复使用的搅拌子,用P/N362搅拌子磁棒回收,扔掉检测杯.用蒸馏水以搅拌的方式清洗电极.将电极上的聚集物取走.用生理盐水冲洗并用〞KIMPWIPES〞檫干电极,放到下一个样本中由于检测.注意:用注意:用KIMPWIPES檫干电极时,不能再电极上留下丝状物.如果不是连续检测样本,将电极放在有生理盐水的检测杯中,并将其放在预温孔备用.最后一个试验完成后,用流动水清洗电极,檫干并放在一个清洁\枯燥的检测杯中.如果没有纤维样物质.就没必要用含腐蚀剂的化学试剂来清洗电极.因为这些化学试剂会破坏电极外表的绝缘体,而导致电极不能做出基线.损坏的电极无法修理,必须从新更换.单通道500-CAP/N369电极。双通道560-CAP/N369电极.如果要对电极进展消毒,将家用消毒剂1:10倍稀释后,清洁10秒,然后用蒸馏水清洗干净即可.结果结果通常以试剂参加后在反响时间内的OHM的变化来表示或以测试过程中的最大聚集率表示.如果IMPEDANCEGAIN已经设置好．那么４０个小方格代表２０OHM．每个大方格是５个OHM每个小方格市０．５个OHM曲线反响局部的切线为斜率．与１分钟的反响建设一个三角形．其高为一分钟的聚集率．根据表格可以直接判断出结果和最恰当的OHM．光学法聚集用于血小板含量丰富血浆和洗涤血小板的检测．样本收集样本收集在样本收集中有详细描述．操作1)翻开聚集仪和记录仪电源，等待仪器温度上升到３７℃2)用Small/large/inpedance开关选择大／小反响位．小位置用P/N3１２５００ul检测杯．用P/N382insertassembly，将p/n382放到加热块中的样本检测孔．当用p/n3１２比色杯和p/n382检测时，必须将p/n３６５隔离物放到检测杯下面，使样本的体积增加２５０ul．注意：每个仪器都有其相匹配的p/n382．每个通道都有双样本模式．再insertassembly下面有仪器型号和通道数的明确标注．如果原始的insertassembly被更换，那么仪器通道与insertassembly必须有专业工程师从新配置．大位置用１mlp/n367比色杯／3)将选择好的检测放到预温孔，预热５分钟．4)加p/n3１３搅拌子〔可重复使用〕到p/n3１２检测杯5)加５００ul样本到p/n3１２检测杯．或加２５０ul样本到比底部有p/n3６５的p/n3１２检测杯．6)加５００ul参比到p/n3１２检测杯〔PPP或缓冲液〕7)翻开加热块盖子将样本放到PRP检测孔．将参比物放到PPP检测孔．8)关闭预热块盖子．9)选择需要的搅拌速度１０００—１２００rpm10)放下纪录笔。翻开纪录仪。11)按住“baseline〞钮。聚集仪上的〔lowerred〕笔会从纪录纸上的左边从１０到９０。自动设置１００％的基线。12)放开“baseline〞钮。聚集仪上的〔lowerred〕笔会从纪录纸上的右边从１０到９０。自动设置０％的基线。如果聚集仪上的笔〔lowerred〕在表格上的基线中来回移动，可能有以下几个原因。１、样本杯和参笔杯位置放错。２、样本中血小板的数量小于３０＊１０９／l3、检测杯没有放好。等待足够长的时间，确保０％的基线已经建设完成。注意:如果曲线往右移动，说明样本内有自身凝集，丢弃并更换样本，注意:如果曲线往右移动，说明样本内有自身凝集，丢弃并更换样本，调查发生自身凝集的原因。13)翻开加热块盖子，用p/n３８８或３５３微量加样枪参加CHRONO-PAR试剂。注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用microbore时，现在其中装满试剂，后排出试剂，重复操作2-3次。最后根据要求的试剂量排出多余的试剂。将需要的试剂留下。用微量加样器加样时，加样枪头必须到检测杯的底部，并且快速、完全的参加试剂，千万不要将试剂加到样本的上面，这样会使试剂、样本混合不均匀。移走加样枪时，按一下活塞，以阻止样本进入到microbore中。做每个试验都要更换microbore每天的试验完成后都要丢掉microbore。为了保护plunger更换一个干净的microbor14)关闭加热块盖子，仪器纪录反响时间内的曲线。1-6分钟。15)试验完成，拿走纪录笔，关掉记录仪。16)翻开加热块盖子，从样本中取走电极。如果用的是P/N３１３可重复使用的搅拌子,用P/N362搅拌子磁棒回收,扔掉检测杯.将参比留作下一个标本检测时用。或者仍掉结果：结果通常用聚集率和斜率表示在光学系统的自动设置表格中显示，１００％聚集等于８个大方格：那么：每个大方格表示的聚集率为１２．５％每个小方格表示的聚集率为１．２５％根据纪录的表格可直接确定结果并报告出完整的报告。再取曲线速度最快的点作出切线，就可以得到斜率，根据１分钟的反响建设一个三角形。三角形的高即为１分钟内血小板的聚集率的改变。用斜率的形势表现出来每个大方格每分钟的聚集率为１２．５％每个小方格每分钟的聚集率为１．２５％发光物的检测〔ATP释放反响〕可用于全血、稀释血浆、PRP和洗涤血小板的检测。翻开光电倍增管的电源时，只要关掉加热快的盖子，发光的强度就能被检测出来。除非参加CHRONO-LUME试剂光的信号不会改变。在运行实验前应运行标准。发光物的检测过程与前面的光学法聚集和阻抗法聚集一样，除了下面几项例外：检测前加试剂时，加样要块。样本检测前有以下几个步骤：阻抗法加全血或稀释血浆９００ul到P/N３６７检测杯。后加１００ul试剂。阻抗法作PRP或洗涤血小板时，加９５０UL到P/N３６７检测杯，后加５０ULCHRONO-LUME试剂。光学法聚集做PRP或洗涤血小板时，加４７５ul到P/N３１２，后加２５ulCHRONO-LUME试剂光学法聚集，在P/N３１２检测杯下面放一个P/N３６５的橡皮垫，做PRP或洗涤血小板时，加２３８ul样本，后加１２ulCHRONO-LUME试剂做ATP试验前，必须先做标准。ATP标准的定标使发光物的检测以nm的形式报告。ATP标准的运行：将P/N３６７检测杯放到预温孔。加P/N３７０一次性搅拌子或P/N３６８可回收的搅拌子到检测杯。预温检测杯１０分钟或更长。加１毫升样本到预温好的检测杯。做ATP标准的样本要做如下处理：全血，９００ul或稀释好的全血。PRP或洗涤血小板，如果用稀释样本检测，要大量稀释血浆。将稀释需要的无菌的等渗的盐水参加到比色杯中，后按需要参加预温好的全血体积。使总体积到达１毫升。注意：当用生理盐水稀释全血时，用不含防腐剂的盐水，许多含渗盐水的试剂、冲洗剂中都有防腐剂。他会影响血小版的聚集。注意：当用生理盐水稀释全血时，用不含防腐剂的盐水，许多含渗盐水的试剂、冲洗剂中都有防腐剂。他会影响血小版的聚集。诊断用时，可将血液１：２稀释〔１全血＋１盐水〕，也可以将血液进展１：１０稀释〔１全血＋９盐水〕1)将样本在预温孔预温５分钟。2)通过旋转Rotarygain开关使荧光强度减少到最小。3)翻开加热块盖子，将含样本的检测杯放到样本孔。4)关上加热块盖子。5)样本预温５分钟。6)放下纪录笔，翻开纪录仪．7)上面记录荧光物强度的绿色的笔将会移动到右边１０／９０处．8)加CHRONO-LUME试剂到样本中．9)让纪录表格运行２分钟．10)翻开加热块盖子，用P/N３８８微量加样枪参加５ulCHRONO-LUMEATP标准到样本中，参加的ATP浓度为２nm．11)关闭加热块盖子，直到有荧光反响峰值．逆时针旋转LuminescenceGain开关来增加荧光强度，接着，继续以逐步增强的方式来增大LuminescenceGain,直到发光曲线到达图表中５０％点．纪录下LuminescenceGain值．表格能描述在２nmATP存在情况下，也能通过表格的描述计算聚集反响中ATP的释放．注意：加注意：加ATP标准物后，关闭加热孔盖子、旋转LuminescenceGain动作一定要迅速。如果动作慢会丧失反响的最顶峰。12)一旦，反响的最顶峰到达并被记录。拿起记录笔关掉记录仪。13)翻开加热孔盖。如果搅拌子是重复使用的。用P/N３６２搅拌磁棒回收，丢掉比色杯。吸收峰为２nmATP的值，用mm或小方格表示，这个值用于计算聚集过程中样本的吸收与标准的对比，从而得到ATP释放的绝对值。ATP释放的测量加2nmATP标准到样本后，计算公式简化为test=［样本吸收峰〔mm或小方格〕／标准物吸收峰〔mm或小方格〕］×２nm结果结果的计算：阻抗法通常以试剂参加后在反响时间内的OHM的变化来表示如果IMPEDANCEGAIN已经设置好．那么４个大方格代表２０OHM．每个大方格是５个OHM每个小方格市０．５个OHM曲线反响局部的切线为斜率．与１分钟的反响建设一个三角形．其高为一分钟的聚集率．根据表格可以直接判断出结果和最恰当的OHM。光学法光学法聚集以反响时间内的聚集率表示．０％的基线与１００％的基线间确认为１００％的聚集率．当用表格纪录时，PRP的基线基本上再１０而PPP的基线在９０．它们之间有８０个小方格．因此每个小方格的表示１００％／８０即１．２５％．荧光法〔ATP释放〕荧光法以MM活小方格来记录．加2nmATP标准到样本后，计算公式简化为test=［样本吸收峰〔mm或小方格〕／标准物吸收峰〔mm或小方格〕］×２nm结果解释全血和PRP的聚集和ATP释放反映曲线可作如下解释：与不受药物干扰的正常质控的直接对比。与被公认和确定的正常值对比。用“rulesofthumb〞对比凝血酶的聚集与ATP的释放。对比ATP的释放和胶原、AA的聚集。发表的聚集范围和ATP的释放范围如下；正常试剂浓度阻抗值〔OHM〕全血中ATPnmPRP(%)凝血酶1u/ml——>0.5----胶原2Ug/ml21±3*6分钟时1.1±0.3*>60花生四稀酸0.5Mm11±3*6分钟时1.0±0.2*>60Ris1.0Mg/ml1,3>5四分钟时并且或者lag小于70秒--->60ADP5Um29±4*六分钟时0.3±0.2*>60聚集反响对花生四稀酸〔AA〕无响应，说明聚集反响受环氧化物的抑制。反响在无聚集或正常范围内来回摆动证明在监测前有用药史。有些血拴或心血管疾病对血小板的聚集反响与环氧化物受到抑制类似。血小板活化时，膜磷脂代谢释放AA。AA通过环氧化酶代谢血栓烷合成酶生成血栓烷A2。只有在环氧化酶作用下，才能生成血栓烷A2，阿斯匹林及同类药物抑制血小板聚集和ATP的释放。当血小板储藏池有缺陷时，有血栓烷A2生成，所以有聚集反响，但是没有ATP的释放。ADP诱导的全血聚集要求ADP的浓度(20Um)较PRP诱导聚集时要高.原因可能是红细胞能吸收局部ADP.对凝血酶的释放响应与血栓烷无关,对胶原的聚集、释放反响局部依赖于血栓烷。AA的聚集和释放完全依赖于血栓烷。因此，“rulesofthumb〞规那么描述为：1)对凝血酶的释放反响缺乏或减少可能是储藏池的缺乏或是释放反响的缺陷。2)胶原的释放较凝血酶的释放要减少一半。说明血栓烷合成酶有减少。3)对AA没有聚集也没有释放那么确定血栓烷合成酶有损坏。4)对AA只有聚集没有释放，可能是由于储藏池的减少或分泌的缺陷。VWD是血浆VWF因子缺乏引起的血小板黏附反响的缺陷。在VWF和GPIb受体存在下，Ris能诱导血小板黏附，当血小板对Ris的聚集没有响应时，提示为VWD疾病或GPIb受体缺乏。然而，两相的间隔时间的延长说明标本不正常。可用0.3ng/ml的Ris来区别。血小板数量过多，并且聚集曲线异常，当服用ASA、ibuprofen或同类药物后，Ris的聚集会消失。因为，VWF和Fg受体会有到第二相聚集。对Ris无聚集可能是GPIb受体缺乏。用正常血浆或高浓度的VWF能纠正聚集反响。说明，是VWD而不是BSS.异常的GPIIB-IIIA能使除了Ris外所有的诱导剂结果异常。异常结果：服用阿斯匹林后试剂浓度阻抗值〔OHM〕全血中ATPnmPRP(%)凝血酶1u/ml——0．3±0.1----胶原2Ug/ml14±4*6分钟时0．3±0.1*<30花生四稀酸0.5Mm<0。5<0。1<20Ris1.25Mg/ml12±3*<0。1<30ADP5Um28±5*六分钟时<0。1>60先天性确实血栓烷合成酶异常结果与其很相似。严重的VWD试剂浓度阻抗值〔OHM〕全血中ATPnmPRP(%)胶原2Ug/ml18．56分钟时1．360花生四稀酸0.5Mm13六分钟时1．360Ris1.25Mg/ml<1<0。1<1。0ADP5Um2150．460在BernardSoulierSyndrome其结果类似。血小板功能不全试剂浓度阻抗值〔OHM〕全血中ATPnmPRP(%)胶原2Ug/ml106分钟时0.48花生四稀酸0.5Mm<0。56分钟时0.38Ris1.25Mg/ml7.56分钟时<0.170ADP5Um2<0.56分钟时<0.1<0.1血小板储藏池缺陷试剂浓度阻抗值〔OHM〕全血中ATPnmPRP(%)凝血酶1u/ml——<0.180胶原2Ug/ml206分钟时<0.170花生四稀酸1Mm126分钟时<0.170血小板释放反响的缺乏，聚集反响的结果与其很相似。确认:为了确认疾病，必须作特殊的实验。质控：好的实验室必须做正常质控。阳性质控收集服用ASA的病人和诊断为VWD的病人。过程有如下三个过程血的快速检测ASA、,布洛芬摄取和VWD疾病的过程。评价血小板功能的过程。检查钙离子、血小板形态和聚集功能的过程。筛选过程推断筛选过程用于全血中阿斯匹林、布洛芬摄取和VWD确实快速确诊。阿斯匹林、布洛芬和同类药物抑制血小板的环氧化物酶。在环氧化物酶作用下，可以生成TXA2，能引起聚集反响。聚集反响对花生四稀酸〔AA〕无响应说明有阿斯匹林、布洛芬和同类药物的摄取。VWD是血浆VWF因子缺乏引起的血小板黏附反响的缺陷。在VWF和GPIb受体存在下，Ris能诱导血小板黏附，当血小板对Ris的聚集没有响应时，提示为VWD疾病或GPIb受体缺乏。样本要求〔全血〕样本采集完成，要求静脉取样的位置损伤面积要小并且没有郁积。常用的诱导剂除了肾上腺素.血液标本用3.2或3.8的柠檬酸钠1:9抗凝。1份抗凝剂9份全血。样本必须用含标准抗凝剂的真空无菌管收集。测试肾上腺素的血液标本抗凝剂要求：在每毫升1.5%的柠檬酸钠中加2U/ML的HEP混合做抗凝剂。取1份抗凝剂9份全血。样本收集不需要禁食，但不能做剧烈运动。不能吸烟。检测前10天或2周制止服用影响血小板功能药物。药物对血小板功能的影响在药物影响一章中有详细说明。样本收集完毕应该立即检测。三小时内必须检测完毕。样本应保存在室温。〔24℃在聚集实验中，P/N365像披垫能被用到。将其放在P/N312检测杯中。具体过程如下：取下像披垫上白色不干胶纸。不要用手接触到其外表。将像披垫放到PRP管的底部。有胶的一面与试管底部相连。并确认以粘贴好。将管子放到检测孔，按常规操作。实验完毕，那走试管。将像披垫与测试杯别离，保持粘胶外表的干净。像披垫可重复使用。如果粘胶外表干净并且枯燥。可以重复使用20次。如果像披垫掉在检测孔里。A用长针从检测孔的边缘将像披垫翻起。B将针沿边缘刺到像披垫中。将其取出。检测准备对于双通道模式的560ca，CHRONO-PARR花生四烯酸和瑞斯西丁素检测可以平行进展。下面的程序采取单通道系统。一个孵育孔用来装盛有1ml生理盐水的清洁的比色杯，当清洁的探针组件不用时可以放置于此杯中以保持温度。新的比色杯和搅拌棒置于空出的孵育孔以确保提供预温的比色杯。要指出的是当一个样本预温时另一个样本正在进展检测，因此缩短了检测运行的时间。1.00将2个P/N367比色杯放入孵育孔。1.01在每个比色杯中参加一个P/N370搅拌棒。1.02将比色杯预温10分钟或稍长1.03用1ml生理盐水稀释1ml加了柠檬酸盐的血液。1.04调整小/大/电阻滑片至电阻位。注意：生理盐水稀释血液时，使用不含防腐剂的盐。许多等渗盐溶液及一些冲洗和浸泡溶液含有如苯甲基乙醇等防腐剂，会抑制聚集和分泌。检测程序1.00吸取1ml稀释血液参加预温的比色杯。1.01预温孔预温样品5分钟。1.02翻开加热区盖，将已预温的盛有有搅拌棒和稀释好的加了柠檬酸盐的血液的比色杯放入已记录样品信息的孔。1.03调整STIRRER搅拌速度到10〔1000rpm〕。1.04电极探针组件插入位于加热孔一边的接口——一已标记的电极接收器。1.05将电极探针组件稳稳插入样本孔中的比色杯中，电极探针组件上的弹簧勾固定在比色杯里并朝向反面。1.06将电极探针组件的连接线卷起塞在探针的后面。盖紧加热区盖子。1.07将记录笔调低并旋至制表档。1.08用聚集仪上的零电阻旋钮将下面的红色电阻笔置于表格的中点。顺时针旋转向右，逆时针旋转向左。变温的电极探针组件和样本会降低电阻，显示为下面的红色电阻笔向左移动。当左移停顿时说明电极探针组件和比色杯到达了期望值37℃1.09用聚集仪上的零电阻旋钮将下面的红色笔的初始位置置于左手10〔或90〕标记处。1.10运行表格2分钟以确保基线稳定。如果曲线一直偏左那么说明样本仍在加温。必要时经常用零电阻旋钮重置曲线。注意：如果曲线右偏说明样本产生了自发聚集。丢弃并重加样本或研究自发聚集的原因。1.11按住聚集仪上的校准钮，使记录笔向右偏。在电路中参加20欧姆的标准电阻，使记录笔向右移动。1.12同时用另一只手调动聚集仪上的电阻增加旋钮使记录笔的移动从基线调整到表格的50标记处。顺时针旋转电阻增加旋钮记录笔增加右移，逆时针旋转减小右移。1.13翻开加热区盖并用CHRONOLOGP/N移液器参加10ulCHRONO-PARR花生四烯酸试剂。注意：由于检测仅需要微小的试剂体积，因此应先润洗枪头，排除气泡并防止参加过量的试剂。所以，用试剂反复吸打2－3次；使枪头湿润并排除气泡。然后，擦干枪头外部的试剂。微量移液器的枪头一定要插入比色杯的底部将试剂推入样本。不要在比色杯液面上注入试剂，因为试剂会黏附在比色杯壁上而不能与样本混匀。保持活塞压低以防止血液回流。每个检测更换一个枪头。每天检测完毕后丢弃废枪头并加一个干净枪头以保护活塞。1.14关闭加热区盖并运行电阻曲线6分钟。1.15设置检测时间完毕后抬高记录笔并关闭表格档。1.16翻开加热区盖并将电极探针组件从样本中移开。丢弃比色杯和P/N370一次性搅拌棒。在盛有蒸馏水的烧杯中搅动以清洗电极组件。从电极组件上洗掉红细胞和聚集物。灰色/白色血小板聚集通常被血液着色而肉眼可见。再用同样的搅动方式，用生理盐水清理电极探针组件。最后用KimwipesR刷擦干电极探针组件并插入下一个待测样本。注意：为防止电极探针组件沾染纤维，推荐使用KimwipesR刷。如果在检测样本间存在检测间隔，将电极探针组件放入一个预温孔预温的盛有生理盐水的比色杯中。检测完成后，清洗最后一个样本。用蒸馏水冲洗，枯燥后置于一个干净的比色杯中。由于不产生纤维，因此不需要用化学腐蚀剂清理电极探针组件。化学腐蚀剂会破坏电极探针组件的绝缘性而无法设置电阻基线。化学腐蚀的电极探针组件无法修复，只能更换。560－ca配用一对P/N369电极探针组件。如果觉得有必要净化电极探针组件，将其浸入1：10稀释的普通漂白剂中大约10秒，用蒸馏水冲净漂白剂。1.17结果通常为从参加试剂开场在给定的时间间隔里聚集的欧姆数或者式聚集的最大欧姆数。如果使用推荐的设置得到的电阻那么20欧姆即为4个大方格：每个大方格为5欧姆每个小方格为0.5欧姆结果直接检查图标记录并报告最近欧姆值。1.18柠檬酸盐稀释血液参加10ulCHRONO-PARR利托菌素试剂〔终浓度为1.25mg/ml〕，盛入另一个比色杯进展重复试验。注意从参加利托菌素试剂到产生应答和电阻变化的时间约为4分钟。结果结果解释典型的结果如上，“阿司匹林类〞原因破坏血栓素合成而导致花生四烯酸聚集失败。阿司匹林，布洛芬和非类固醇抗炎症药物抑制血小板环氧合酶。环氧合酶活性是花生四烯酸转变为血栓素A2的要素。血栓素A2的产生引起聚集。因此花生四烯酸聚集失败可能是由阿司匹林，布洛芬或类似药物的吸收引起。冯威勒不兰特病是特征是血小板黏附所需的血浆多因子缺乏〔vWF〕。抗生素利托菌素导致在vWF和GPI受体存在的血小板黏附。因此，利托菌素聚集失败可能是冯威勒不兰特病或GPI受体缺乏〔伯－苏病〕引起。利托菌素无应答可能是冯威勒不兰特病。在一些情况下，延长的时间仅比试异常。利托菌素过度应答在II型或冯威勒不兰特病中在，可以用终浓度为.3mg/ml的利托菌素确证检测。定性异常，异常聚集曲线和不聚集通常为阿司匹林，布洛芬或类似药物的吸收引起。利托菌素无聚集可能是由于伯－苏病人的GPI受体缺乏引起的。重复实验中参加正常血浆或一定浓度的vWF可以校正冯威勒不兰特病的结果，而伯－苏病人的结果无法校正。确认最终的诊断要由专门检测确认。全面的过程推断用于诊断血小板功能障碍和VWD。包括血小板膜、磷脂、分泌机制、血栓烷综合酶和血桨中因子的缺乏。要发现上面的异常。必须要做凝血酶对ATP的释放反响，胶原、ADP、AA、Ris的聚集和对ATP的释放.样本要求〔全血〕样本采集完成，要求静脉取样的位置损伤面积要小并且没有郁积。常用的诱导剂除了肾上腺素.血液标本用3.2或3.8的柠檬酸钠1:9抗凝。1份抗凝剂9份全血。样本必须用含标准抗凝剂的真空无菌管收集。测试肾上腺素的血液标本抗凝剂要求：在每毫升1.5%的柠檬酸钠中加2U/ML的HEP混合做抗凝剂。取1份抗凝剂9份全血。样本收集不需要禁食，但不能做剧烈运动。不能吸烟。检测前10天或2周制止服用影响血小板功能药物。药物对血小板功能的影响在药物影响一章中有详细说明。样本收集完毕应该立即检测。三小时内必须检测完毕。样本应保存在室温。〔24℃试验准备：在单通道的500-ca上，值控和标本要依次运行。在双通道的560-ca上，值控和标本可平行运行。下面是单通道的运行过程。一个预热孔放好装有1毫升生理盐水的检测杯。当预热孔到达温度时，放好新的检测杯和搅拌子。当运行一个样本时，可提前预温另一个标本。这样会节省检测时间。1.00将5个P/N367检测杯到预温孔1.01在每个杯子中参加一个P/N370搅拌子1.02预温检测杯10分钟或更长。1.03将标本用生理盐水做1：1稀释。1.04选择Small/Large/Impedance滑动开关上的Impendance档。警告：生理盐水稀释全血时，必须使用不含防腐剂的盐水。许多试剂纯的等张生理盐水和一些灌注液、浸液含有诸如苯甲醇之类的抑制血小板聚集和分泌的防腐剂。测试过程运行ATP标准1.00加900ul稀释好的样本到预温好的检测杯中。1.01在预温孔预温样本5分钟。1.02旋转Rotary开关，减少Luminescencegain的值到最小。1.03设置搅拌速度为10〔1000rpm〕1.04翻开加热块盖子，将含样本的检测杯放到样本检测孔。1.05加100ulCHRONO-LUME试剂到样本1.06关闭加热块盖子1.07放下纪录笔，翻开纪录仪开关1.08上面的绿笔，记录发光物，并且快速的移动到右边10/90标记出1.09允许纪录仪运行2分钟10翻开加热块盖子，并加5ulCHRONO-LUMEATP标准到样本。ATP标准浓度为2nm注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用microbore时，现在其中装满试剂，后排出试剂，重复操作2-3次。最后根据要求的试剂量排出多余的试剂。将需要的试剂留下。用微量加样器加样时，加样枪头必须到检测杯的底部，并且快速、完全的参加试剂，千万不要将试剂加到样本的上面，这样会使试剂、样本混合不均匀。移走加样枪时，按一下活塞，以阻止样本进入到microbore中。做每个试验都要更换microbore每天的试验完成后都要丢掉microbore。为了保护plunger更换一个干净的microbore。11关闭加热块盖子，直到有荧光反响峰值．逆时针旋转LuminescenceGain开关来增加荧光强度，接着，继续以逐步增强的方式来增大LuminescenceGain,直到发光曲线到达图表中５０％点．纪录下LuminescenceGain值．注意：加注意：加ATP标准物后，关闭加热孔盖子、旋转LuminescenceGain动作一定要迅速。如果动作慢会丧失反响的最顶峰。1.12一旦反响的最顶峰到达并被记录。拿起记录笔关掉记录仪。1.13翻开加热孔盖丢掉比色杯。1.14吸收峰用mm或小方格表示，这个值用于计算ATP释放的值。凝血酶1.00加900ul稀释好的样本到预温好的检测杯中。1.01在预温孔预温样本5分钟。1.02设置搅拌速度为10〔1000rpm〕1.03翻开加热块盖子，将含样本的检测杯放到样本检测孔。1.04加100ulCHRONO-LUME试剂到样本1.05关闭加热块盖子1.06放下纪录笔，翻开纪录仪开关1.07上面的绿笔，记录发光物，并且快速的移动到右边10/90标记出1.08允许纪录仪运行2分钟1.9翻开加热块盖子，并加100ulCHRONO-PAR凝血酶试剂到样本。凝血酶试剂标准浓度为1u/ml10关闭加热块盖子，观察发光物的变化直到有峰值出现，并且以到达一个平台期，有开场下降。11当反响的峰值被记录，拿下记录笔，关掉记录仪。12翻开加热块盖子，丢掉检测杯。13吸收峰用mm或小方格表示。胶原1.00加900ul稀释好的样本到预温好的检测杯中。1.01在预温孔预温样本5分钟。1.02设置搅拌速度为10〔1000rpm〕1.03翻开加热块盖子，将含样本的检测杯放到样本检测孔。1.04加100ulCHRONO-LUME试剂到样本1.05将电极放到样本检测孔。电极上的弹簧片放到监测杯里面。560ca对着通道的后面，500ca对着通道的左边。1.06将每个电极与相应的线连接好。将加热块盖子关闭完全。1.07放下纪录笔，翻开纪录仪。1.08用“Zeroknob〞点，让红色的阻抗取图表中央点。顺时针旋转“Indepancezeroknob〞使红色的阻抗笔移动到右边。逆时针那么到左边。预温电极，样本会减少其阻抗值让红色的阻抗笔向左移动。当红色的阻抗笔停顿向左移动时，证明电极何比色杯到达了需要的37℃。如果红色的阻抗笔走到了图表的外面。用“Impendancezeroknob1.09用聚集仪上的“Impendancezeroknob〞将红色的阻抗笔调到最初的纪录。左边的10〔或90〕。1.10让仪器记录两分钟。以确认基线已经建设。如果曲线往左移动说明样本仍在预温。用“Impendancezeroknob〞根据需要从设置基线。注意：如果曲线往左边走，证明样本中有自发聚集产生。更换样本或检查自发聚集产生的原因。注意：如果曲线往左边走，证明样本中有自发聚集产生。更换样本或检查自发聚集产生的原因。11按住聚集仪上的定标按钮，仪器会自动产生标准20ohm的环形阻抗。让红色的阻抗笔往右移动。1.12同时，另一个手用聚集仪上的“impendancegainknob〞在表格中的基线上标记50。这个步骤标定仪器在标准20ohm的阻抗下，记录笔移动40个小方格。顺时针旋转“impedanceknob〞将加快纪录笔的移动速度，逆时针将降低其移动速度。1.13翻开加热块盖，加2ulCHRONO-PARcol试剂到样本中。可用P/N353微量加样器。Col的终浓度为2Ug/ml。注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用microbore时，现在其中装满试剂，后排出试剂，重复操作2-3次。最后根据要求的试剂量排出多余的试剂。将需要的试剂留下。用微量加样器加样时，加样枪头必须到检测杯的底部，并且快速、完全的参加试剂，千万不要将试剂加到样本的上面，这样会使试剂、样本混合不均匀。移走加样枪时，按一下活塞，以阻止样本进入到microbore中。做每个试验都要更换microbore每天的试验完成后都要丢掉microbore。为了保护plunger更换一个干净的microbor1.14关闭加热块盖子，仪器纪录反响时间内的曲线。最少6分钟。1.15试验完成，拿走纪录笔，关掉记录仪。1.16翻开加热块盖子，从样本中取走电极。扔掉检测杯和搅拌子。用蒸馏水以搅拌的方式清洗电极.将电极上的聚集物取走.用生理盐水冲洗并用〞KIMPWIPES〞檫干电极,放到下一个样本中由于检测.注意:用注意:用KIMPWIPES檫干电极时,不能再电极上留下丝状物AA1.00加900ul稀释好的样本到预温好的检测杯中。1.01在预温孔预温样本5分钟。1.02设置搅拌速度为10〔1000rpm〕1.03翻开加热块盖子，将含样本的检测杯放到样本检测孔。1.04加100ulCHRONO-LUME试剂到样本1.05将电极放到样本检测孔。电极上的弹簧片放到监测杯里面。560ca对着通道的后面，500ca对着通道的左边。1.06将每个电极与相应的线连接好。将加热块盖子关闭完全。1.07放下纪录笔，翻开纪录仪。1.08用“Zeroknob〞点，让红色的阻抗取图表中央点。顺时针旋转“Indepancezeroknob〞使红色的阻抗笔移动到右边。逆时针那么到左边。预温电极，样本会减少其阻抗值让红色的阻抗笔向左移动。当红色的阻抗笔停顿向左移动时，证明电极何比色杯到达了需要的37℃。如果红色的阻抗笔走到了图表的外面。用“Impendancezeroknob1.09用聚集仪上的“Impendancezeroknob〞将红色的阻抗笔调到最初的纪录。左边的10〔或90〕。1.10让仪器记录两分钟。以确认基线已经建设。如果曲线往左移动说明样本仍在预温。用“Impendancezeroknob〞根据需要从设置基线。注意：如果曲线往左边走，证明样本中有自发聚集产生。更换样本或检查自发聚集产生的原因。注意：如果曲线往左边走，证明样本中有自发聚集产生。更换样本或检查自发聚集产生的原因。1.11按住聚集仪上的定标按钮，仪器会自动产生标准20ohm的环形阻抗。让红色的阻抗笔往右移动。1.12同时，另一个手用聚集仪上的“impendancegainknob〞在表格中的基线上标记50。这个步骤标定仪器在标准20ohm的阻抗下，记录笔移动40个小方格。顺时针旋转“impedanceknob〞将加快纪录笔的移动速度，逆时针将降低其移动速度。1.13翻开加热块盖，加10ulCHRONO-PARAA试剂到样本中。可用P/N353微量加样器。AA的终浓度为0.5mM.注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用microbore时，现在其中装满试剂，后排出试剂，重复操作2-3次。最后根据要求的试剂量排出多余的试剂。将需要的试剂留下。用微量加样器加样时，加样枪头必须到检测杯的底部，并且快速、完全的参加试剂，千万不要将试剂加到样本的上面，这样会使试剂、样本混合不均匀。移走加样枪时，按一下活塞，以阻止样本进入到microbore中。做每个试验都要更换microbore每天的试验完成后都要丢掉microbore。为了保护plunger更换一个干净的microbor1.14关闭加热块盖子，仪器纪录反响时间内的曲线。最少6分钟。1.15试验完成，拿走纪录笔，关掉记录仪。1.16翻开加热块盖子，从样本中取走电极。扔掉检测杯和搅拌子。用蒸馏水以搅拌的方式清洗电极.将电极上的聚集物取走.用生理盐水冲洗并用〞KIMPWIPES〞檫干电极,放到下一个样本中用于检测.ADP1.00加900ul稀释好的样本到预温好的检测杯中。1.01在预温孔预温样本5分钟。1.02设置搅拌速度为10〔1000rpm〕1.03翻开加热块盖子，将含样本的检测杯放到样本检测孔。1.04加100ulCHRONO-LUME试剂到样本1.05将电极放到样本检测孔。电极上的弹簧片放到监测杯里面。560ca对着通道的后面，500ca对着通道的左边。1.06将每个电极与相应的线连接好。将加热块盖子关闭完全。1.07放下纪录笔，翻开纪录仪。1.08用“Zeroknob〞点，让红色的阻抗取图表中央点。顺时针旋转“Indepancezeroknob〞使红色的阻抗笔移动到右边。逆时针那么到左边。预温电极，样本会减少其阻抗值让红色的阻抗笔向左移动。当红色的阻抗笔停顿向左移动时，证明电极何比色杯到达了需要的37℃。如果红色的阻抗笔走到了图表的外面。用“Impendancezeroknob1.09用聚集仪上的“Impendancezeroknob〞将红色的阻抗笔调到最初的纪录。左边的10〔或90〕。1.10让仪器记录两分钟。以确认基线已经建设。如果曲线往左移动说明样本仍在预温。用“Impendancezeroknob〞根据需要从设置基线。注意：如果曲线往左边走，证明样本中有自发聚集产生。更换样本或检查自发聚集产生的原因。注意：如果曲线往左边走，证明样本中有自发聚集产生。更换样本或检查自发聚集产生的原因。1.11按住聚集仪上的定标按钮，仪器会自动产生标准20ohm的环形阻抗。让红色的阻抗笔往右移动。1.12同时，另一个手用聚集仪上的“impendancegainknob〞在表格中的基线上标记50。这个步骤标定仪器在标准20ohm的阻抗下，记录笔移动40个小方格。顺时针旋转“impedanceknob〞将加快纪录笔的移动速度，逆时针将降低其移动速度。1.13翻开加热块盖，加5ULCHRONO-PARADP试剂到样本中。可用P/N353微量加样器。AA的终浓度为5.0uM.由于红细胞对由于红细胞对ADP有吸收，每个试验室应建设正常反响的ADP浓度。推荐使用终浓度为20uM的ADP。注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用microbore时，现在其中装满试剂，后排出试剂，重复操作2-3次。最后根据要求的试剂量排出多余的试剂。将需要的试剂留下。用微量加样器加样时，加样枪头必须到检测杯的底部，并且快速、完全的参加试剂，千万不要将试剂加到样本的上面，这样会使试剂、样本混合不均匀。移走加样枪时，按一下活塞，以阻止样本进入到microbore中。做每个试验都要更换microbore每天的试验完成后都要丢掉microbore。为了保护plunger更换一个干净的microbor1.14关闭加热块盖子，仪器纪录反响时间内的曲线。最少6分钟。1.15试验完成，拿走纪录笔，关掉记录仪。1.16翻开加热块盖子，从样本中取走电极。扔掉检测杯和搅拌子。用蒸馏水以搅拌的方式清洗电极.将电极上的聚集物取走.用生理盐水冲洗并用〞KIMPWIPES〞檫干电极,放到下一个样本中用于检测.Ris不需要检测ATP的释放。没有诊断说明Ris能诱导ATP的释放。1.00加900ul稀释好的样本到预温好的检测杯中。1.01在预温孔预温样本5分钟。1.02设置搅拌速度为10〔1000rpm〕1.03翻开加热块盖子，将含样本的检测杯放到样本检测孔。1.04将电极放到样本检测孔。电极上的弹簧片放到监测杯里面。560ca对着通道的后面，500ca对着通道的左边。1.05将每个电极与相应的线连接好。将加热块盖子关闭完全。1.06放下纪录笔，翻开纪录仪。1.07用“Zeroknob〞点，让红色的阻抗取图表中央点。顺时针旋转“Indepancezeroknob〞使红色的阻抗笔移动到右边。逆时针那么到左边。预温电极，样本会减少其阻抗值让红色的阻抗笔向左移动。当红色的阻抗笔停顿向左移动时，证明电极何比色杯到达了需要的37℃。如果红色的阻抗笔走到了图表的外面。用“Impendancezeroknob1.08用聚集仪上的“Impendancezeroknob〞将红色的阻抗笔调到最初的纪录。左边的10〔或90〕。1.09让仪器记录两分钟。以确认基线已经建设。如果曲线往左移动说明样本仍在预温。用“Impendancezeroknob〞根据需要从设置基线。注意：如果曲线往左边走，证明样本中有自发聚集产生。更换样本或检查自发聚集产生的原因。注意：如果曲线往左边走，证明样本中有自发聚集产生。更换样本或检查自发聚集产生的原因。1.10按住聚集仪上的定标按钮，仪器会自动产生标准20ohm的环形阻抗。让红色的阻抗笔往右移动。1.11同时，另一个手用聚集仪上的“impendancegainknob〞在表格中的基线上标记50。这个步骤标定仪器在标准20ohm的阻抗下，记录笔移动40个小方格。顺时针旋转“impedanceknob〞将加快纪录笔的移动速度，逆时针将降低其移动速度。1.12翻开加热块盖，加10ulCHRONO-PARRis试剂到样本中。可用P/N353微量加样器。AA的终浓度为1.25mg/ml.也有些试验室用终浓度较低的试剂，0.25—1.0mg/ml.注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用注意：每个试验的试剂用量很少。加样小孔要求是潮湿的并且没有气泡。应此，在用microbore时，现在其中装满试剂，后排出试剂，重复操作2-3次。最后根据要求的试剂量排出多余的试剂。将需要的试剂留下。用微量加样器加样时，加样枪头必须到检测杯的底部，并且快速、完全的参加试剂，千万不要将试剂加到样本的上面，这样会使试剂、样本混合不均匀。移走加样枪时，按一下活塞，以阻止样本进入到microbore中。做每个试验都要更换microbore每天的试验完成后都要丢掉microbore。为了保护plunger更换一个干净的microbor1.13关闭加热块盖子，让阻抗曲线到达最大值。1.14一旦到达最大值，拿走纪录笔，关掉记录仪。1.16翻开加热块盖子，从样本中取走电极。扔掉检测杯和搅拌子。用蒸馏水以搅拌的方式清洗电极.将电极上的聚集物取走.用生理盐水冲洗并用〞KIMPWIPES〞檫干电极,放到下一个样本中用于检测.如果不是连续检测样本,将电极放在有生理盐水的检测杯中,并将其放在预温孔备用.最后一个试验完成后,用流动水清洗电极,檫干并放在一个清洁\枯燥的检测杯中.如果没有纤维样物质.就没必要用含腐蚀剂的化学试剂来清洗电极.因为这些化学试剂会破坏电极外表的绝缘体,而导致电极不能做出基线.损坏的电极无法修理,必须从新更换.单通道500-CAP/N369电极。双通道560-CAP/N369电极。结果计算1.00阻抗法通常以试剂参加后在反响时间内的OHM的变化来表示如果IMPEDANCEGAIN已经设置好．２０OHM为8厘米〔4个大方格〕．每两厘米〔每个大方格〕为５个OHMs每四毫米〔2个小方格〕为1个OHM根据表格可以直接判断出结果和最恰当的OHM。1.01表格中发光物的峰值用毫米或小方格来表示。1.02释放反响的结果用ATP的浓度表示〔nmol〕，用下面的方式计算。Lum.oftestGainofstdTestATPnmol=-----------*-----------*ATPnmolestdGainoftestLum.ofstd加2nmATP标准到样本后，计算公式简化为test=［样本吸收峰〔mm或小方格〕／标准物吸收峰〔mm或小方格〕］×２nm结果解释全血和PRP的聚集和ATP释放反映曲线可作如下解释：1与不受药物干扰的正常质控的直接对比。2与被公认和确定的正常值对比。3用“rulesofthumb〞对比凝血酶的聚集与ATP的释放。对比ATP的释放和胶原、AA的聚集。发表的聚集范围和ATP的释放范围如下；正常试剂浓度阻抗值〔OHM〕全血中ATPnm凝血酶1u/ml——>0.5胶原2Ug/ml15—276分钟时0.5—1.72花生四稀酸0.5Mm5-176分钟时0.6—1.4Ris1.25Mg/ml>5四分钟时并且或者lag小于70秒---ADP5Um21--17六分钟时0.0—0.7血小板活化时，膜磷脂代谢释放AA。AA通过环氧化酶代谢血栓烷合成酶生成血栓烷A2。只有在环氧化酶作用下，才能生成血栓烷A2，阿斯匹林及同类药物抑制血小板聚集和ATP的释放。当血小板储藏池有缺陷时，有血栓烷A2生成，所以有聚集反响，但是没有ATP的释放。ADP诱导的全血聚集要求ADP的浓度(20Um)较PRP诱导聚集时要高.原因可能是红细胞能吸收局部ADP.对凝血酶的释放响应与血栓烷无关,对胶原的聚集、释放反响局部依赖于血栓烷。AA的聚集和释放完全依赖于血栓烷。因此，“rulesofthumb〞规那么描述为：对凝血酶的释放反响缺乏或减少可能是储藏池的缺乏或是释放反响的缺陷。胶原的释放较凝血酶的释放要减少一半。说明血栓烷合成酶有减少。对AA没有聚集也没有释放那么确定血栓烷合成酶有损坏。对AA只有聚集没有释放，可能是由于储藏池的减少或分泌的缺陷。VWD是血浆VWF因子缺乏引起的血小板黏附反响的缺陷。在VWF和GPIb受体存在下，Ris能诱导血小板黏附，当血小板对Ris的聚集没有响应时，提示为VWD疾病或GPIb受体缺乏。然而，两相的间隔时间的延长说明标本不正常。可用0.3ng/ml的Ris来区别。血小板数量过多，并且聚集曲线异常，当服用ASA、ibuprofen或同类药物后，Ris的聚集会消失。因为，VWF和Fg受体会有第二相聚集。对Ris无聚集可能是GPIb受体缺乏。用正常血浆或高浓度的VWF能纠正聚集反响。说明，是VWD而不是BSS.异常的GPIIB-IIIA能使除了Ris外所有的诱导剂结果异常。异常结果：服用阿斯匹林后试剂浓度阻抗值〔OHM〕ATPnm凝血酶1u/ml——1.5-2.3胶原2Ug/ml6-226分钟时0.2–0.5花生四稀酸0.5Mm1<0。1Ris1.25Mg/ml1–156分钟时<0。1ADP5Um20-186分钟时<0。1先天性确实血栓烷合成酶异常结果与其很相似。VWD试剂浓度阻抗值〔OHM〕ATPnm胶原2Ug/ml18.56分钟时1．3花生四稀酸0.5Mm136分钟时1．3Ris1.25Mg/ml<1<0。1ADP5Um2150．4在BernardSoulierSyndrome其结果类似。血小板功能不全试剂浓度阻抗值〔OHM〕ATPnm胶原2Ug/ml106分钟时0.4花生四稀酸0.5Mm<0。56分钟时0.3Ris1.25Mg/ml7.56分钟时<0.1ADP5Um2<0.56分钟时<0.1血小板储藏池缺陷试剂浓度阻抗值〔OHM〕ATPnm凝血酶1u/ml——<0.1胶原2Ug/ml206分钟时<0.1花生四稀酸1Mm126分钟时<0.1血小板释放反响的缺乏，聚集反响的结果与其很相似。确认:为了确认疾病，必须作特殊的实验。质控：好的实验室必须做正常质控。阳性质控收集服用ASA的病人和诊断为VWD的病人。钙离子，洗涤血小板中发光物质时形态的变化和聚集检测原理诱导剂激活血小板，释放出钙离子，使血小板胞质内的钙离子浓度在1秒内迅速增加。因此，钙离子的增加被看作血小板响应的启动过程。因此，检测检测钙流的变化，同时发生变形和聚集。对血小板功能的研究提供了有价值的工具。检测原理：结合的钙离子发射蓝色的光。发光物的强度说明了钙离子的浓度。检测范围2.5*10-7–2.5*10-9。发光物的来源与处理。做钙离子研究的发光物能从下面的地方获得：FridayJ.R.BlinksPostofficeBoxFridayHarbor:(206)378-6384;：〔206〕543–1273发光蛋白质是一种冻干粉，在每毫升含150mMKcl5mM用时，冻干得发光蛋白用PH7.4，含7mM的EGTA的去离子水复溶。分装成10等份。每份含发光蛋白3mg/ml处理发光蛋白时，一定要注意千万不能被钙离子污染。翻开小瓶前用EGTA清洁瓶子的外部。清洗所有可能与发光蛋白有联系的工程，包括用EGTA制备发光蛋白的分装品。所有的水,必须过滤掉钙离子。不然，存在的钙离子将会发光蛋白释放。另一个会释放发光蛋白的污染物是银。不要将ph电极放到任何与发光蛋白接触的溶液中。因为，参比电极会导致银染物。如果必须要测试PH值，从溶液中取一份样本，测量PH值后，将样本丢弃。样本的准备：PRP的制备：40毫升柠檬酸盐抗凝的全血在160g试剂和器材1、1M2、含EGTA和PGE1的HEPES缓冲盐140mMNaCL5mM2.7mMKCL1UMPGE10.1%血清蛋白0.1%葡萄糖3.8mMPH=7.63、HEPES缓冲盐140mM2.7mMKCL0.1%血清蛋白0.1%葡萄糖3.8mMPH=7.64、含钙和镁的HEPES缓冲盐140mMNaCL12.7mMKCL1m.M氯化镁0.1%血清蛋白0.1%葡萄糖PH=7.6制作缓冲液时，将NaCL、KCL、HEPES作10倍稀释。同样氯化钙、氯化镁也作10倍稀释。5、DMSO货号20684。高级纯的物质。保存在50毫升含氮气的试剂瓶中。DMSO容易受潮，受潮后会释放有毒的亚硫酸盐和硫磺类物质。6、Tritonx-100货号28314。Tritonx-100中含10%的水溶液。7、注射式注射器---Chrono-logP/N9751-20ul注射器。注射器上的加样针型号P/N976，有22个标准量成，2.65英寸长。8、P/N367检测杯。9、P/N370搅拌子。10、普通离心机。11、Eppendorf高速离心机。12、Eppendorf试管。发光蛋白的装载过程1.00再PRP血浆中加9/1000的1M枸橼酸。调解样本的PH1.01将上诉血液用800g1.02在原始的PRP中参加等体积的含EGTA和PGE1的HEPES缓冲盐重悬。1.03处理标本如1.011.04加90ul含EGTA和PGE1的HEPES缓冲盐重悬。在1.5毫升的微量试管中加10ul的发光蛋白原液。1.05在1.5