GB∕T 43169-2023 马铃薯斑纹病菌检疫鉴定方法（正式版）

马铃薯斑纹病菌检疫鉴定方法2023-09-07发布国家市场监督管理总局I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草原则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、广州海关技术中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、满洲里海关技术中心、中华人民共和国银川海关。1马铃薯斑纹病菌检疫鉴定方法1范围本文件描述了马铃薯斑纹病菌的检疫鉴定方法。本文件适用于茄科和伞形科等植物的种子、种苗、块茎、块根等植物材料以及传播介体木虱中马铃薯斑纹病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文本必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4马铃薯斑纹病菌基本信息中文名称：马铃薯斑纹病菌分类地位：原核生物界(KingdomMonera),变形菌门(Proteobacteria),a-变形菌纲(Alphapro-韧皮部杆菌属(CandidatusLiberibacter)。马铃薯斑纹病菌其他信息见附录A。5方法原理马铃薯斑纹病菌目前还无法培养，因此方法原理为采用马铃薯斑纹病菌特异性引物或探针，通过普通聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)、巢式PCR或实时荧光PCR方法进行检测。6仪器设备和主要试剂6.1仪器设备支持寡核苷酸探针(TaqMan)双标记水解探针，温度控制范围为30℃~100℃。2温度控制范围为4℃~99℃。波长为230nm～260nm。洁净等级100级，过滤效率达到99.99%。电压10V～300V,最小可调1V;电流4mA～400mA,最小可调1mA。紫外透射波长为302nm。转速为50r/min～600r/min。转速≥12000r/min。转速为200r/min～3000r/min。精确度为0.001g。温度控制范围为室温至100℃。制备出的纯水水质应符合GB/T6682中一级水的规格。最高工作温度不低于121℃。乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)、脱氧核糖核酸(de-3oxyribonucleicacid,DNA)聚合酶、引物和探针、琼脂糖、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、双重去离子水(doubledistilledwater,ddH₂O)。7病菌的鉴定7.1症状检查该病菌在不同寄主甚至同一寄主不同品种上的为害症状及为害程度均有差异。马铃薯、番茄可检管束组织变褐、内部组织产生髓质射线，该症状通常在块茎切片或切块油炸后表现较为明显，即薯片或薯条出现黑斑或斑纹。胡萝卜、芹菜可检查植株地上和地下部分，地上部分的症状表现为叶片卷曲黄化、叶片增生；地下部分症状表现为根变形、发育不良以及次生根增殖。具体症状图片见附录B。7.2样品采集与制备7.2.1植株样品制备采集样品时要同时采集有症状和无症状的叶片和/或茎，从有症状的植物上取3片～5片植物叶片和/或茎，无症状植物上不同部位取5片～10片叶子(包括新生叶片)和/或茎。植物地下部分如马铃薯块茎，胡萝卜根等都能够用来检测马铃薯斑纹病菌，选取症状明显的组织进行检测。在进行提取之茎维管束环。植物样品用研磨仪或液氮进行研磨处理。种子样品可任选以下两种方法之一进行制备处理：——取种子样品1g～2g(例如：胡萝卜种子约450粒～900粒)直接用研钵研磨，或用研磨机研磨，或置塑料袋内用锤子粉碎后，取适量粉碎样品提取核酸；——取种子样品1g～2g(例如：胡萝卜种子约450粒～900粒)加入50mL～100mLPBS缓冲液4℃冰箱浸泡过夜，弃缓冲液，浸泡后的种子用研磨仪研磨，研磨后加20mLPBS缓冲液振荡混匀，然后用纱布或滤纸过滤，滤液12000r/min离心后取沉淀物提取核酸。另外，如果是种衣剂处理过的种子应先去除种衣，按照每克种子加入10mL～50mL0.5%TritonX-100的比例振荡洗涤30min,洗3次后在水中过夜软化，再任选上述两种方法之一进行制备处理。7.2.3木虱样品制备从有症状或无症状的植物中收集成虫木虱，置于研钵中加入液氮研磨备用。7.3核酸提取根据常规的十六烷基三甲基溴化铵法(Cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)或商业化核酸提取试剂盒规定的质量，取植物组织、木虱样品研磨粉末状物质或种子浸泡液的沉淀物提取待测样品核酸，且应根据不同提取物(植物、昆虫)选择合适的商业化核酸提取试剂盒。7.4检测选用普通PCR、巢式PCR、实时荧光PCR检测方法中的任意一种，检测具体操作步骤按照附录C、附录D和附录E的规定。48结果判定选用普通PCR、巢式PCR、实时荧光PCR检测方法中任意一种的检测结果为阳性，可判定检出马铃薯斑纹病菌。9样品保存植物组织样品置于密封样品袋保存于4℃冰箱中，木虱样品保存于70%乙醇中，以备复核。阳性样品保存期满后应经高压灭菌后方再处理。10结果记录与资料保存人和实验人员的签字。对检出马铃薯斑纹病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。普通PCR和巢式PCR琼脂糖凝胶电泳检测电泳结果图片、荧光PCR检测原始数据等资料应妥善保存。5(资料性)马铃薯斑纹病菌相关信息A.1症状特征马铃薯斑纹病菌危害寄主植物的叶片、枝干、块茎等部位，在不同寄主上的症状存在一定的差异。马铃薯、番茄等茄科植物的地上部分的症状与植原体的危害症状类似，表现为叶片黄化矮化、叶脉地下部分症状表现为匍匐茎倒伏、维管束组织变褐、内部组织产生髓质射线。该症状通常在块茎切片或切块油炸后表现较为明显，即薯片或薯条出现黑斑或斑纹。胡萝卜、芹菜等伞形科植物的地上部分的症状与植原体的危害症状类似，表现为叶片卷曲黄化、叶片增生；地下部分症状表现为根变形、发育不良以及次生根增殖。A.2寄主范围马铃薯斑纹病菌已知寄主主要有茄科和伞形科植物，茄科包括：马铃薯(Solanumtuberosum),番茄(S.lycopersicum),茄子(S.melongena),树番茄(S.betaceum),银叶茄(S.elaeagnifolium),东方龙葵(S.ptycanthum),辣椒(Capsicumannuum),烟草(Nicotianatabperuviana),和枸杞(Lyciumbarbarum)等。伞形科包括：胡萝卜(Daucuscarota),芹菜(Apiumgraveolens),茴香(Foeniculumvulgare),芫荽(Petroselinumcrispum),欧防风(Pastinacasativa),香芹(Libanotisseseloides)和欧洲萝卜(Pastinacasativa)等。蓼科、旋花科和荨麻科也是其寄主。马铃薯斑纹病菌潜在的寄主范围比已知的寄主范围更广泛。A.3分布目前已报道马铃薯斑纹病菌分布的国家或地区如下：利群岛；A.4传播途径马铃薯斑纹病菌可通过带菌薯块和种子等繁殖材料进行远距离传播；田间通过昆虫介体传播。此外，病菌还可通过嫁接、染病植株、带菌种子和马铃薯种薯等进行传播和扩散。目前报道的传播介体包括：马铃薯木虱(Bactericeracockerelli)、B.trigonica、B.maculipennis和胡萝卜木虱(Triozaapicalis)等。A.5单倍型马铃薯斑纹病菌目前已知的单倍型有10种(见表A.1),不同单倍型之间具有不同的地理范围和植物宿主，且与木虱的种类和取食行为密切相关。6表A.1马铃薯斑纹病菌10种单倍型的信息单倍型寄主分布地区传播媒介A马铃薯、番茄中美洲：洪都拉斯、危地马拉北美洲：墨西哥、美国(亚利桑那州、加利福尼亚州、俄勒冈州、华盛顿州、爱达荷州)大洋洲：新西兰马铃薯木虱(Bactericeracock-B马铃薯、番茄北美洲：墨西哥、美国马铃薯木虱(Bactericeracock-C胡萝卜、芹菜、茴香、欧洲：芬兰、瑞典、挪威、德国、奥地利胡萝卜木虱(Triozaapicalis)D胡萝卜、芹菜、茴香、亚洲：以色列欧洲：比利时、西班牙、法国、希腊、葡萄牙、非洲：突尼斯、摩洛哥BactericeratrigonicaE马铃薯、番茄、胡萝卜、芹菜、茴香、芫荽等亚洲：以色列、日本欧洲：比利时、西班牙、法国、希腊、葡萄牙、加那利群岛非洲：突尼斯、摩洛哥马铃薯木虱(Bactericeracock-F马铃薯北美洲：美国马铃薯木虱(Bactericeracock-G马铃薯北美洲：美国马铃薯木虱(Bactericeracock-H伞形花科；蓼科欧洲：芬兰未知旋花科北美洲：美国未知U荨麻北美洲：墨西哥欧洲：芬兰、德国荨麻木虱(Trioeaurticae)7(资料性)马铃薯斑纹病菌危害症状a)马铃薯斑纹病菌危害马铃薯叶片的症状b)马铃薯斑纹病菌危害马铃薯叶片的症状c)马铃薯斑纹病菌危害马铃薯块茎的症状d)马铃薯斑纹病菌危害马铃薯块茎的症状e)马铃薯斑纹病菌危害马铃薯块茎切片油炸后的症状f)马铃薯斑纹病菌危害马铃薯块茎切条油炸后的症状图B.1马铃薯斑纹病菌危害马铃薯的症状8a)马铃薯斑纹病菌危害番茄的田间症状b)马铃薯斑纹病菌危害番茄出现的叶片黄化、卷曲症状图B.2马铃薯斑纹病菌危害番茄的症状注：左为马铃薯斑纹病菌危害胡萝卜叶片出现卷叶和紫化的症状；中为马铃薯斑纹病菌危害胡萝卜叶片仅出现卷叶的症状；右为正常的胡萝卜。a)马铃薯斑纹病菌危害芹菜的切面症状b)马铃薯斑纹病菌危害芹菜出现的叶片增生症状9GB/T43169—2023(规范性)马铃薯斑纹病菌普通PCR检测程序C.1普通PCR扩增C.1.1引物序列普通PCR检测的引物序列见表C.1。表C.1普通PCR检测的引物序列引物名称引物序列PCR产物大小/bp上游引物：5'-aattttagcaagttctaaggg-3'下游引物：5'-ggtacctcccatatcgc-3'C.1.2反应体系及反应条件普通PCR反应体系见表C.2。反应条件为：94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃40s,40个循环；72℃5min(当使用不同仪器和试剂时，可根据要求将反应参数进行适当调整)。预期扩增产物为上述反应中均需同时设置阳性对照(马铃薯斑纹病菌)、阴性对照(健康马铃薯叶片)和空白对照(以灭菌蒸馏水代替模板DNA)。表C.2反应体系组成加样量10×PCR缓冲液50mmol/L氯化镁5U/μLTaqDNA聚合酶10ng/μL～100ng/μL模板DNAddH₂O补至25注：反应体系中各试剂的量使用等效的PCR预混液时，具体情况根据采用的试剂进行适当调整。C.2琼脂糖凝胶电泳制备1.5%的琼脂糖凝胶，按比例均匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNA分子标记(Marker)作为分子质量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外投射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA条带，并拍摄记录。C.3质量控制阳性对照应出现383bp的预期扩增片段，阴性对照和空白对照应都未出现383bp的预期扩增片段。上述指标如有一项不符合者，应重新进行普通PCR扩增。C.4结果判定检测样品如出现383bp的预期扩增片段判为阳性，如未出现383bp的预期扩增片段判为阴性。(规范性)马铃薯斑纹病菌巢式PCR方法D.1巢式PCR扩增巢式PCR检测的引物序列见表D.1。表D.1巢式PCR检测的引物序列引物名称引物序列产物大小/bp上游引物：5'-gcgcttatttttaataggagcggca-3'下游引物：5'-gcctcgcgacttegcaacccat-3'Lib16S01F上游引物：5'-ttctacgggataacgcacgg-3'Lib16S01R下游引物：5'-cgtcagtatcaggccagtgag-3'D.1.2反应体系及反应条件用引物OA2/OI2c进行第一轮PCR反应。反应条件为：94℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃(当使用不同仪器和试剂时，可根据要求将反应参数进行适当调整)。PCR反应体系见表D.2。表D.2第一轮PCR反应体系组成加样量10×PCR缓冲液50mmol/L氯化镁5U/μLTaqDNA聚合酶10ng/μL～100ng/μL模板DNAddH₂O补至25注：反应体系中各试剂的量使用等效的PCR预混液时，具体情况根据采用的试剂进行适当调整。取第一轮PCR产物稀释10倍后取1μL为模板利用引物Lib16S01F/Lib16S01R进行第二轮PCR反应。反应条件为：94℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,35个循环；72℃10min(当使用不同仪器和试剂时，可根据要求将反应参数做适当调整)。PCR反应体系见表D.3。表D.3第二轮PCR反应体系组成加样量10×PCR缓冲液50mmol/L氯化镁5U/μLTaqDNA聚合酶第一轮PCR反应产物ddH₂O补至25注：反应体系中各试剂的量使用等效的PCR预混液时，具体情况根据采用的试剂进行适当调整。上述反应中均需同时设置阳性对照(马铃薯斑纹病菌)、阴性对照(健康马铃薯叶片)和空白对照(以蒸馏水代替模板DNA)。D.2琼脂糖凝胶电泳制备1.5%的琼脂糖凝胶，按比例均匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为分子质量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外投射光下观察是否扩增出预期的特异性D.3质量控制阳性对照应出现580bp的预期扩增片段，阴性对照和空白对照应都未出现580bp的预期扩增片段。上述指标如有一项不符合者，应重新进行巢式PCR扩增。D.4结果判定检测样品如出现580bp的预期扩增片段判为阳性，如未出现580bp的预期扩增片段判为阴性。(规范性)马铃薯斑纹病菌实时荧光PCR方法E.1实时荧光PCR检测E.1.1引物及探针序列实时荧光PCR检测的引物及探针序列见表E.1。表E.1实时荧光PCR检测的引物及探针序列引物及探针名称引物及探针序列LsoF上游引物：5'-gtegagcgcttatttttaatagga-3'HLBr下游引物：5'-gcgttatecegtagaaaaaggtag-3'HLBp采针：5'-FAM-agacgggtgagtaacgcg-BHQ-3E.1.2反应体系及反应条件实时荧光PCR反应程序：95℃10min;95℃15s,60℃60s,40个循环，每个循环结束后采集FAM通道荧光信号(当使用不同仪器和试剂时，可根据要求将反应参数进行适当调整)。反应体系见上述反应中均需同时设置阳性对照(马铃薯斑纹病菌)、阴性对照(健康马铃薯叶片)和空白对照(以灭菌蒸馏水代替模板DNA)。表E.2反应体系组成加样量2×TaqManreal-timePCRmastermix10ng/μL～100ng/μL模板DNAddH₂O补至25注1:在使用具有ROX校正通道的实时荧光PCR仪时按仪器要求添加ROX荧光试剂。注2:反应体系中各试剂的量使用等效的PCR预混液时，具体情况根据采用的试剂进行适当调整。E.2质量控制阳性对照循环数阈(CycleThreshold,Ct)值≤35,阴性对照和空白对照没有扩增或Ct值>40。上述指标如有一项不符合者，应重新进行实时荧光PCR扩增。E.3结果判定检测样品Ct值，若Ct值≤35判为阳性；若在35<Ct值≤40之间，需重复测试，重复结果为典型S形扩增曲线，判为阳性，否则判为阴性；检测样品无扩增或Ct值>40,判为阴性。[1]LiWB,AbadJA,French-MonarR,etal.Multiplexreal-timePCRfordetection,identifi-cationandquantificationof‘CandidatusLiberibactersolanacearum'i