人类生殖工程

辅

助

生

殖

技

术人工授精、试管婴儿、克隆技术辅助生殖技术不孕不育—辅助生殖研究发展史第一节人工授精第二节体外受精+胚胎移植第一代试管婴儿第二代试管婴儿第三代试管婴儿第四代试管婴儿第三节生殖工程引发的伦理问题

为什么要进行辅助生殖？生育是人类的基本生理功能，是人类的一种本能。人类生育过程是女性产生的健康卵子和男性产生的健康精子相结合而完成的。精子通过性交进入女性生殖道，如果没有遇到障碍，大概有上百个精子到达输卵管上端与卵子相遇，并完成受精作用，这个过程仅需要16小时就可以完成。正常的生殖过程

当新生命的起点——受精卵形成后，受精卵一边向子宫移动，一边开始卵裂，最终到达子宫内壁的某处并植入子宫内膜，即着床。共经历270天左右的孕育，胎儿分娩出世——一个新生命就这样诞生了。

影响精、卵结合的因素很多，比如排卵后，卵子仅在6~24小时内保持有受精能力；精子进入女性生殖道内，一般也仅在1~2天内维持有受精能力；男性每次射出精液量应是3~4毫升，而每毫升中精子数应在2000万~1亿，如果精子过少，受精机会显著下降；精子中必须要有60%以上形态正常，并且有运动能力；精子还必须在阴道、子宫、输卵管内获得能量，方能到达输卵管上端与卵子受精，等等。不孕症婚后两年、有正常的性生活，未采取任何避孕措施而未曾受孕者。调查显示：生育力正常的夫妇不避孕1年内妊娠率为80%~90%；2年的妊娠率为93%~95%。治疗方法之一：辅助生殖技术沉重的十字架不孕不育是一种常见病据统计，造成不孕症有30%是男方原因，30%是女方原因，还有40%的原因在男女双方。从女方来看：最常见的病因是不排卵，它可以由生理、病理和内分泌失调等原因引起的。其次，盆腔炎性病变，其中有20%~40%盆腔炎可导致输卵管堵塞、损伤、而不能受孕。第三，女性生殖道产生可以杀死精子的抗体。第四，由于染色体异常、黄体期缺陷等，或尚不清楚的原因引起的。

男方方面最重要的原因是不能提供足够数量、健康的精子。不孕不育现象是随年龄而增加。

不孕症是一种常见病。在不同国家和不同年代差别很大。1988年美国国家中心统计15~44岁育龄夫妇中，不孕症发病率为8.4%；到20世纪90年代就上升到10%左右。中国内地2.3亿育龄夫妇中约有5%~8%存在不能生育问题，而且每年还以40万对左右速度增加，并有上升趋势。在中国台湾约有14%夫妇由于种种疾病不能生育，或在怀孕上存在不可克服的困难。

不育夫妇经过各种治疗仍未生育，并且目前尚无治疗方法的情况下，为了使女方怀孕，就不得不依靠其他方法来达到这个目的。这些方法统称为辅助生殖技术。现行的辅助生殖技术包括人工授精、体外受精（试管婴儿）等技术。

辅助生殖发展简史

200年前，JohnHunter用注射器将一位尿道下裂的丈夫的精液注入妻子的阴道内怀孕。1953年，第一例冷冻精子人工授精成功，但人工授精技术一直到70年代才广泛应用于临床1983年，我国首个利用冷冻精子人工授精婴儿出生。1978年，世界第一例试管婴儿LouisBrown在英国剑桥大学诞生，开创体外授精治疗不孕新的里程碑。1988年，我国第一例试管婴儿出生第一节人工授精人工授精：收集丈夫或自愿献精者的精液，由医师注入女性生殖道以达到受孕目的的一种技术。解决男性不育的主要方法必须具备的三个条件：足够数量和活力的精子正常的排卵至少一条输卵管通畅和功能正常一、分类

依据精液来源分为：夫精人工授精（AIH）：使用丈夫精子供精人工授精（AID）：自愿献精者的精子依据操作方法：子宫人工授精：宫腔内授精、宫颈内授精、阴道内授精输卵管内精液灌注：是人工授精的一种新方法二、接受人工授精妇女的条件有规则的月经周期有正常排卵输卵管必须通畅生殖器官无严重疾患三、供精人工授精（AID）供精者的选择挑选体力和智力俱佳的已婚青壮年男性仔细检查精液质量，排除一切遗传病和性传播性疾病供方与受方不相识兼顾供者血型、身高、肤色及头发颜色是否与患者丈夫一致四、人工授精治疗程序（一）精液的采集和处理逆行射精者：采精前每4小时服碳酸氢钠1克，使尿液pH值达到7.2~7.7，排空尿液，冲洗膀胱，诱导排精，取膀胱内容物，离心浓缩至1ml立即进行人工授精精液量及精子少的患者：多采集几次浓缩后进行人工授精精液不液化：授精前加糜蛋白酶或胰蛋白酶使之液化精子活力差：加入咖啡因，终浓度为7.2mmol/L,提高精子活力，提高精子受精能力。（二）人工授精的方法1、子宫人工授精①宫腔内授精：处理过的精子直接送入宫腔②宫颈内授精：将精液注入宫颈内③阴道内授精：将精液注入子宫颈周围将宫颈盖上宫颈杯，将精液注入杯中，杯留放24小时2、输卵管内精液灌注原理：封闭子宫颈口后，向宫腔内注入4ml处理过精子悬液，利用子宫腔压力，使输卵管内口张开，精液进入输卵管。曾捐精200余次的鲍比·盖拉多特

2008年首位怀孕变性人托马斯-比提孕前照片2008年6月２９日生下了一名漂亮女婴。苏珊

2008年１１月1４日再度怀孕变性前照片有的家庭中，丈夫的生殖能力正常，但妻子因输卵管阻塞而不孕，这样的问题该怎样解决呢？现实中的问题第二节：试管婴儿的培育方法第一代试管婴儿：体外受精-胚胎移植术

1978英国1988中国

第二代试管婴儿：单精子卵细胞浆内显微注射授精技术1992比利时1996中国第三代试管婴儿：胚胎种植前的遗传学诊断

19901999中国第四代试管婴儿：核移植技术1997英国2002年中国

1978年7月25日深夜时分，英国曼彻斯特郊外的奥德姆总医院里，一个女婴的啼哭声划破夜空，震撼了世界……她就是世界上第一例试管婴儿——路易斯.布朗。试管婴儿是近２０余年逐步发展起来的以体外受精－胚胎移植为中心的一系列技术方法及理论，使人们能更深入地了解受精及人体胚胎的发育机制，并为不孕、不育症以及预防遗传病提供新的途径。一、第一代试管婴儿技术即常规的体外授精-胚胎移植(IVF-ET)

主要解决女性因素的不育。主要应用于：①双侧输卵管缺如或完全阻塞，估计治疗效果差或经治疗无效者；②行宫腔内人工授精3-6次未受孕者；③不明原因不孕者；④需要赠卵，并有受孕的其它基本条件者。此项技术于1976年创立于英国，世界和中国的第一例试管婴儿分别于1978年和1988年诞生。二、第二代试管婴儿技术即单精子卵细胞浆内显微注射授精技术(ISCI)。依靠显微注射系统，选择吸取单个活精子，直接注入卵母细胞内进行人工授精，主要解决男性因素的不育。主要应用于：①严重的男性因素不育(严重少精症、弱畸精症、阻塞性无精症、精子成熟障碍)；②常规的体外授精周期中，卵子不受精或受精率低下，可用该技术作为补救手段。

此项技术于1992年创立于比利时，世界和中国的第一例第二代试管婴儿分别于1992年和1996年诞生。它对家畜的育种和珍稀动物的拯救也具有重要的应用价值。三、第三代试管婴儿技术

即胚胎移植前的遗传学诊断技术(PGD)显微注射技术虽然提高了试管婴儿技术的成功率，但也加大了胎儿畸形的风险。在前两代技术的基础上，对植入前的胚胎进行筛选，选择健康、正常、无遗传性疾病(优生)的胚胎植入子宫内。这一技术和显微注射技术的联合运用，被称为第三代试管婴儿技术。主要适应用于：遗传性疾病、遗传高危夫妇。

世界和中国的第一例第三代试管婴儿分别于1990和1999年诞生。四、第四代试管婴儿技术，

即核移植技术

通俗地讲，就是克隆人。但存在两个问题：操作时带入外源DNA、受体细胞线粒体遗传。另外，需要指出的是隆人已经不是传统意义上的试管婴儿，它只是男方或女方某一方的复制品，而不是精子和卵子结合的产物。

随着国外克隆羊(多利)的诞生，2002年2月中国诞生了克隆牛。现在，克隆人已经不存在技术问题，存在的只是伦理道德问题。美国科学家于2001年10月首次成功克隆出早期人类胚胎，立即招来了许多抨击。国际社会讨论通过一项“关于禁止克隆人的国际公约”，公约将规定除非由于医治某种疾病(不孕症除外)，否则不能进行克隆人研究一、常规试管婴儿培养技术——第一代试管婴儿

体外授精-胚胎移植术：体外让卵子与精子结合形成受精卵，在体外继续培养8细胞左右，再将胚胎重新移植到母亲子宫中，继续发育生长直至足月分娩。主要解决女性因素的不育（一）主要适应症和禁忌症适应症：①输卵管病变所致不孕：双侧输卵管缺如或完全阻塞；②行宫腔内人工授精3-6次未受孕者；③不明原因不孕者；④子宫内膜异位症不孕；适应症：⑤无排卵或黄素化卵泡未破裂综合征；⑥子宫颈病变，阻碍精子进入；⑦一方生殖细胞缺如；⑧子宫发育异常或缺如；

⑨选择性生育。禁忌症：①年龄：40岁以上不适于IVF；②过度肥胖者；③高催乳素血症造成的不孕；④严重的盆腔粘连者。

（二）卵子的收集1、获得可受精卵的方法①自然周期法：②药物诱发超数排卵法：③诱发排卵常用药物及其作用机制克罗米酚、人绝经期促性腺激素（hMG）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）、FSH2、采卵的方法①腹腔镜手术取卵②超声波导向采卵3、卵子成熟度的判定从理论上讲，成熟的卵母细胞在排卵前已完成第一次成熟分裂，第一极体的排出是卵成熟的标志。经验性评估卵母细胞成熟度的方法①根据卵丘细胞的伸展度②依据卵泡的大小③根据卵丘细胞内脂肪颗粒多少④根据卵-放射冠-卵丘复合体的特点成熟型：直径3~5mm或更大，卵丘细胞之间距离大，放射冠分散，透明带可见。未成熟型：直径1~1.5mm，紧密放射冠，看不清透明带成熟的卵母细胞未成熟卵母细胞（三）精子的准备1、精液的采集与人工授精相同2、精液分析形态、细菌、免疫、细胞遗传学关于精子受精能力的评价：①保持直线性向前运动能力的精子受精能力强②正常精子多而畸形精子少，受精能力强穿卵实验阳性，受精能力强3、精液的加工处理目的：洗涤精子、去除精浆、增强精子活力、精子获能穿卵实验阳性（四）体外授精及体外培养1、孵育卵细胞：使卵母细胞在体外进一步成熟2、检查精子活力，调节精子浓度3、体外授精：向孵育好的卵细胞中加入适量精子5~10万4、换液培养：人工受精后14~16h观察，如出现雌、雄原核，卵周隙有第二极体，表明受精成功，随后将受精卵转移到生长培养基中继续培养，使其卵裂并发育，以便适时施行胚胎移植。（五）胚胎移植(ET)与妊娠监护

ET是试管婴儿试验中的最后一步，也是最重要一关1、胚胎的移植：2~16细胞（卵裂球）时移植；2~4胚胎/次2、妊娠监护：放射免疫方法检测血、尿中

hCG（促绒毛膜性腺激素）6天：血中hCG升高，8天：尿中hCG升高3周：超声检查胚囊位置，5周：胚胎大小和胎心波动3、影响ET的因素：①移植时，母体子宫内膜与胚泡发育不同步；②穿刺取卵时黄体受损，使黄体功能不足；③移植过程中，胚泡损伤或子宫内膜损伤（六）“试管婴儿”的成功率

1、成功率：体外受精率：85%~90%卵裂率（体外培养成功率）：80%胚胎移植后妊娠率：20%~25%2、畸形发生率：1987~1991年总计出生6248例试管婴儿，有某种畸形的新生儿187例，占总数的2.8%。这与自然妊娠分娩的新生儿畸形发生率相当。

如果妻子的生育能力正常，但因丈夫产生的精子少或精子活力差而造成的不孕，应该采用什么辅助生殖技术呢？二、胞浆内单精注射——第二代试管婴儿

主要目标：帮助精子穿过透明带

单精胞浆注射(显微授精技术)透明带钻孔技术（PZD）

透明带下授精（SUZI）

卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）针对男性少、弱、畸精症或阻塞性无精症（一）显微授精技术发展简史1962年Hiramoto首次将海胆精子直接注入海胆卵中1966年Graham将青蛙精子注入未受精的蛙卵中，PN形成1988年第一个通过精子微注射受精的子代动物（小鼠）诞生1988年lanzendorf等人报道人精子直接注入卵胞浆PN形成1992年Palermo等人报道卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）婴儿诞生1996年我国首例ICSI在中山医科大学获得成功（庄广伦－李蓉）（二）胞浆内单精注射

IntracytoplasmicSpermInjection

(ICSI)定义：指用显微操作术将单个精子注入卵胞浆的过程适应症：①严重精子质量异常②既往常规IVF失败患者③严重的抗精子抗体患者④无精子症患者⑤未成熟卵以及冷冻保存的卵母细胞⑥常规IVF失败未受精卵母细胞ICSI操作程序促排卵和卵子的采集卵子体外培养精子的采集及处理显微注射①精子制动②卵胞浆内精子注入③放开卵母细胞，培养16~24h4~8-细胞或囊胚后，移植母体子宫中影响ICSI成功的主要因素ICSI成功与否主要看受精、卵裂及妊娠率，除技术因素外，径自、卵子状态及卵子激活等都直接影响其成功。①显微操作技术对ICSI的影响体外操作过程不超过5分钟注射针内径5~8微米之间固定针外径120微米，内径15~40微米②精子状态对ICSI的影响影响ICSI成功的主要因素

③卵子对ICSI的影响卵子状态卵母细胞成熟程度女性年龄影响卵子质量卵子激活以放出第二极体、形成雌雄原核为标志并最终启动卵子代谢的一系列变化

形态检查

B超间接诊断方法检查母体生化指标直接诊断方法胎儿细胞三、产前诊断着床前遗传病诊断技术（PGD）PGD：指对植入前的胚进行诊断，排除遗传病的一项新技术.当子代处于可遗传的遗传异常危险中时，可应用PGD对胚进行筛选，应用此项技术诞生的婴儿被称为第三代试管婴儿优点：防止产前诊断终止妊娠给患者带来的身心痛苦PGD发展简史1966年Edwards提出PGD的思想1987年Verlinsky提出4-细胞胚胎遗传学诊断模型1988年Li对单个精子和体细胞进行可遗传学分析1989年PCR技术首先引入PGD，成功鉴定人类性别1990年对X-连锁隐性遗传病的夫妇进行PGD诞生第一例经PGD后的健康女婴1992年对单个基因相关遗传病进行PGD，获成功1994年对染色体病和年龄相关的染色体非整倍性检测1996年染色体平行易位携带者进行PGD，接受治疗后，诞生正常三胞胎PGD常适用于不同时期受精前：第一极体做为活检材料卵裂期：卵裂球做为活检材料囊胚期：滋养外胚层细胞做为活检材料PGD常用的检测方法聚合酶链反应（PCR）

荧光原位杂交（FISH）

PGD适应症X-连锁隐性遗传病单基因相关遗传病染色体病高龄妇女非整倍性检测

理论上，只要有足够的序列信息，能针对任何遗传条件开展PGDPGD诊断程序诊断时期及取样方法1、配子时期精子选择：性染色体非整倍性50~100%卵子选择：常染色体非整倍性80%通过检测第一、第二极体的遗传学分析，可推测卵子内遗传物质状况，达到诊断目的。

优越处：不影响胚胎发育；诊断时间早，没有错过移植时间的危险胚胎时期

PGD多选择在卵裂期，即体外受精3天后，6~10-细胞时期进行。实验证明：从卵裂期胚胎中活检取出25%细胞，并不影响其正常发育，活检成功率可达97%。

将胚胎置于显微操作仪上，用固定针固定胚胎，用预先装载了酸性Tyrodes的打孔针在透明带上消化打孔，再用取球针经孔进入透明带内吸拉出单个卵裂球。

单个细胞的遗传学分析细胞遗传学诊断

取出的活检细胞经3：1甲醇/冰醋酸固定，制作染色体样本，

FISH技术检测分析。

例如有一位母亲是血友病基因的携带者，她自己虽然不发病，但是，她的两个儿子都是血友病患者，接连不幸夭折。这位悲伤的母亲来到试管婴儿中心，要求给她做试管婴儿。医生考虑到她的情况，决定给她做“第三代”试管婴儿。随后就是取卵、人工授精等等步骤。当受精卵分裂到4—8个细胞时，取出其中的一个细胞进行诊断：对于胚卵是XY型，将来能发育为男子的就淘汰了；而胚卵是XX型（即将来发育为女儿）的则进行移植。试验成功了，一个健康的女婴来到人间。按照遗传学法则，这个女婴虽然和她妈一样，也是血友病基因的携带者，但不会发病，将是一个“健康”的女孩。

可见，“第三代”试管婴儿是优生的保证。它把妇科的产前诊断，提前到胚胎尚未着床时，这对于患有遗传病或有遗传疾病倾向的妇女、高龄孕妇是很有必要的。单个细胞的遗传学分析分子细胞遗传学诊断

间期多色FISH技术，可以进行多条染色体细胞遗传学分析

染色体数目异常

X、Y、21、13、18这五条染色体数目异常占新生儿染色体数目异常的95%染色体结构异常

全染色体涂染探针

Genebank获取与易位重接点相关的DNA序列,标记后制备易位携带者特异性探针

植入前胚胎性别鉴定

Y染色体或X、Y染色体特异探针进行性别分析

四、细胞核移植技术----第四代试管婴儿是指将发育不同时期的胚胎或成体细胞核经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，或将体细胞核直接注入去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成子代个体。克隆技术